PTE 肺腺癌的潜在生物标志物：关注长链非编码 RNA 和 mRNA

1. 新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸神经内科，新疆乌鲁木齐 830011

2. 作者： MaryamgvlAhmat^a， GvzalnurAlim^b， Zhu Zhu^c， Chen chao^a， 通讯作者： 曹国雷 ^a， 罗琴 ^a

作者单位： 所有作者均来自新疆医科大学附属肿瘤医院，新疆 乌鲁木齐 830011。作者 a 来自呼吸和神经病学系，b 来自心胸外科，c 来自癌症研究所。

3. 本文得到以下多个基金会的支持 ：1.新疆自治区青年基金项目（2022D01C795） 2.新疆自治区重点项目 （2022D01D74）

4. 利益声明声明：作者声明在本文的研究、作者身份和出版方面没有潜在的利益冲突 。

5. 数据访问声明 ： 本研究的数据集公开发布于：https://gco. iarc.fr/today。数据已匿名化以保护隐私。欲了解更多信息，请联系通讯作者 。

抽象： 目的肺癌患者跟肺血栓栓塞 常脸不良预后。本研究旨在调查差异表达lncRNA和 mRNA 在肺腺癌合并 PTE 患者中 提供新想法从 lncRNAs和 mRNA.方法收集 2019 年 1 月至 2019 年 12 月在新疆医科大学附属肿瘤医院采集肺腺癌伴 PTE 患者 （病例组） 、肺腺癌患者 （对照组-1 ）、肺栓塞但无癌患者 （对照组-2） 和健康对照组 （对照组-3） 的外周血标本。使用三唑^® 试剂。的表达谱lncRNA采用 Illumina 高通量测序技术同时检测 4 组样本中 mRNA 的 mRNA。的差异表达式lncRNA和 mRNA 进行了比较组间和每一个三个对照组.通过 Gene Ontology （GO） 和 PATHWAY 分析基因表达的差异。 结果 共计 149,468 个已知 mRNA 和 13,897 个已知 mRNAlncRNA检测到 12,900 个新lncRNA被识别。725 个差异表达lncRNA (P<0.05） 和 2052 个差异表达的 mRNA （P<0.05） 在病例组中与对照 1 组相比。其中，326lncRNA上调，399 例下调 与对照 1 组相比，病例组有 1181 个 mRNA 上调，871 个 mRNA 下调。共计九百三十-二差异表达lncRNA (P<0.05） 和 2206 个差异表达的 mRNA （P<0.05） 在病例组中与对照 2 组相比被鉴定出来。其中，452lncRNA上调，480lncRNA被下调 与对照 2 组相比，病例组 949 个 mRNA 上调，1257 个 mRNA 下调。共有 1190 个差异表达lncRNA (P<0.05） 和3001 个差异表达的 mRNA （P<0.05） 在病例组中与对照 3 组相比被鉴定出来。其中，453lncRNA被上调，737lncRNA被下调 与对照 3 组相比，CASE 组有 1327 个 mRNA 上调，1674 个 mRNA 下调。经过进一步分析，发现上调和下调lncRNA差异最显著的 mRNA 分别为 MERGE.31027.6 、 ENST00000318988 和 MERGE.30976.2 ENST00000397519。 GO 和京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 分析显示，存在一些与肺癌合并 PTE 密切相关的通路，例如免疫系统， 细胞因子-细胞因子受体相互作用， NF-κ B 信号通路， 适应性免疫系统， 炎症性肠病 （IBD）， 造血细胞谱系， 先天免疫系统， 第二信使分子 α 的产生 （i） 信号事件、血小板活化等。结论PTE 肺腺癌患者表现出明显的lncRNA外周血中的 mRNA 表达谱。MERGE.31027.6、MERGE.30976.2、ENST00000318988、ENST00000397519，四个转录本不同这与对照受试者相比，PTE 肺腺癌患者中的大多数可能是 PTE 肺腺癌的有希望的生物标志物和治疗靶点。 同时，PTE 的形成可能归因于免疫系统中涉及的信号通路失调、细胞因子-细胞因子受体相互作用和其他相关疾病。

关键词 ： 肺腺癌合并 PTE， lncRNA， mRNA， RNA 测序， KEGG

介绍

肺癌是最常见的癌症，其特点是其发病率和死亡率在全世界最高。 2020 年 ，估计有 240 万新病例 ， 超过 180 万人死于肺癌，其中超过 85% 可归因于非小细胞肺癌 ^[1]。

肺血栓栓塞 （PTE） 是与肺癌相关的常见并发症 ， 已成为该疾病患者死亡的主要原因。 与没有这些情况的患者相比，患有肺栓塞 （PE） 或未怀疑肺栓塞 （UPE） 的肺癌患者的平均生存期更短，疑似 PE 病例的死亡率高于确诊的 UPE 病例 ^[2]。 一些研究表明 ，偶然发现的无症状肺栓塞是与肺癌患者 1 年死亡率相关的独立危险因素 ^[3]。 由于肺癌合并 PTE 的临床症状不典型且异质性，经常出现误诊或漏诊，这加剧了肺癌患者的病情，并构成了重大的临床挑战。凝块的形成与肿瘤本身的存在、手术、化疗、酪氨酸激酶抑制剂和免疫调节药物有关 ^[4]。 此外，还有关于选择最佳抗凝策略以避免出血的共识。因此，确定更多风险因素将是有益的，这可能有助于我们预见肺癌患者 PTE 的形成。

长链非编码 RNA （lncRNA） 是指那些超过 200nt 但缺乏明显的开放阅读框且无法编码蛋白质的 RNA。lncRNA 与细胞中生物过程的调控和人类疾病的病理生理学密切相关 ^[5]。 与蛋白质编码基因 ^[6] 和较短的非编码 RNA （如 miRNA^[7]） 相比 ，lncRNA 的库更大，表达模式更多样化和复杂 ^[8]。 到目前为止，已经在人类基因组中克隆和鉴定了超过 50， 000 个 lncRNA 基因， 但  其中只有有限数量的基因在癌症背景下进行了功能表征。 尽管功能研究尚未广泛进行，但 lncRNA 已被证明具有作为治疗靶点和诊断恶性肿瘤和其他人类疾病的生物标志物的巨大潜力 ^[9]。 然而， 尽管 lncRNAs 可能具有临床相关性，但很少研究 lncRNAs 在 PTE 肺癌患者中的潜在作用。 或者，肺腺癌患者 PTE 发展所涉及的信号通路仍然不清楚。 考虑到与 PTE 相关的一系列错综复杂的风险因素，有理由认为其发展涉及多个信号通路。阐明独特的转录本概况可能会为这一关键问题提供有价值的见解。

本研究的目的是确定肺腺癌合并 PTE 患者外周血中不同的 lncRNA 和 mRNA 表达模式 。我们通过 Illumina 高通量测序比较了肺腺癌合并 PTE 患者和肺腺癌、 无癌症 PTE 患者或健康受试者外周血中差异表达的 lncRNAs 和 mRNA。 对差异表达基因进行 GO 和 KEGG 通路分析，以鉴定 可能与肺腺癌患者 PTE 发展相关的 lncRNA 和 mRNA，从而为该疾病的潜在新型生物标志物和治疗靶点提供证据。

材料和方法

研究对象

该研究得到了新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会的批准。所有研究参与者均签署了知情同意书。 选取 2019 年 1 月至 2019 年 12 月我院收治的 40 例患者作为对照组，即肺腺癌合并 PTE 组。病例组的纳入和排除标准为： 肺动脉 CTA（肺动脉 CT 血管造影扫描）活检诊断肺腺癌;患者无心血管、脑血管疾病、内分泌疾病或肺腺癌以外的其他恶性肿瘤病史。

同时， 对照组由 10 例个体组成 ， 分别作为无 PTE 肺腺癌患者 （control-1 组）、肺栓塞患者 （control-2 组） 和健康对照组 （control-3 group） 的对照组。对照组 1 组患者与病例组相同，但未观察到肺动脉血栓。对照组 2 由 PTE 患者组成，但无恶性肿瘤，同时满足其余病例组标准。对照组 3 由在同一家医院参加体检并证实无血栓、心血管、脑血管和内分泌疾病或恶性肿瘤的健康受试者组成。

血液样本、文库制备和 RNA 测序

治疗前将受试者的外周血样本采集到血液 RNA 管 （BD 762165） 中 。

使用 TRIzol^® 试剂从外周血样品中提取总 RNA。用 Qubit RNA BR 检测试剂盒 （Thermofisher） 定量总 RNA，用 Ribo-Zero ^TM 磁性试剂盒 （Epicentre） 去除其 rRNA。用 RNA 6000 Pico 芯片评价 RNA 的质量，认为 RNA 完整性值大于 8 的样品符合文库构建条件。 根据制造商提供的说明 ，使用 SuperScript II Reverse T ranscriptase 构建文库 。按照 Hiseq2500 Illumina 提供的说明 ，在 HiSeq 平台上以 150 bp 双端 （Illumina） 对所有文库进行测序。

RNA 测序数据分析

采用 Fastp 软件对 FASTQ 数据进行质量控制、适配器调整和质量过滤。转录本是使用 StringTie 组装的。 使用编码潜力计算器 （CPC） （评分 < 0）、编码非编码指数 （CNCI） （评分 < 0） 和 HMMER 软件 （E 值 < 0.001） 评估转录本的蛋白质编码潜力 ，以鉴定 lncRNA。如果四组中至少一组的平均表达水平为 ≥0.5，而超过三分之二的样品表达转录本;或者平均表达水平为 ≥1，而来自四组中至少一组的超过三分之二的样品表达转录本， 则转录本被纳入差异表达分析 。采用 limma 包和 DESeq 包 分析 case 组和 3 个对照组中 lncRNAs 和 mRNAs 的不同表达 。 病例组基因表达│log2 倍数变化 （FC）│≥1 和 P<0.05 时被认为与对照组不同 。 总结了 4 组的每千碱基百万转录本 （TPM） 、P 值、FC 值和表达差异，以供下一步研究。 通过系统聚类构建已知 mRNA 、 lncRNA 和新型 mRNA、新型 lncRNA 的差异表达图谱。Target Finder 软件用于预测差异 lncRNA 和 mRNA 靶基因。 最后，我们使用基因本体论 （GO） 项目和京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 通路，根据差异表达的 lncRNAs 和 mRNAs 鉴定与 PTE 肺腺癌相关的功能和生物学通路 。

统计分析

使用 String Tie 软件和 PrepDE.py 对样品的 lncRNA 和 mRNA 进行相关性分析。 根据每个样本中基因和转录本的表达计算 Pearson 相关系数， 样本的 Pearson 相关系数 r 的绝对值不大于 1。 使用 R 语言热图进行差异 lncRNA 和 mRNA 聚类分析。

结果

外周血中 lncRNA 和 mRNA 的鉴定

根据 lncRNAs 的特性 ， 将长度短于 200 bp 的转录本排除在分析之外，以鉴定 lncRNA。分别去除包含一个外显子或多个外显子的转录本，每百万个映射读数 （FPKM） 中每千碱基外显子模型片段数 （FPKM） ≥2 或 ≤0.5。 使用 CPC 、 CNCI 和 PFAM 三种工具去除潜在的编码转录本。来自三种工具的 12,900 个转录本的交叉被鉴定为新的 lncRNA （图 1a 和 1b）。同时，通过爆破鉴定了 13897 个已知的 lncRNA（图 1b）。此外，还鉴定出 149,468 个 mRNA（图 1b）。

图 1 （a） 维恩图说明了在去除假定的蛋白质编码转录本后使用 CPC、CNCI 和 PFAM 鉴定新型 lncRNA。（b） 鉴定出的 mRNA、已知 lncRNA 和新 lncRNA 的数量

lncRNA 和 mRNA 特性的比较

从长度分布和外显子数量两个方面分析了 lncRNAs 和 mRNAs 的特性，我们发现 lncRNAs 的长度分布比 mRNA 序列的长度分布更广（图 2a 和 2b）。此外，平均而言，与 mRNA 转录本相比，lncRNA 包含较少数量的核苷酸（图 2a 和 2b）。然而，lncRNA 的每个基因中包含的外显子比 mRNA 中包含的外显子少（图 2c 和 2d）。

图 2a. lncRNA 转录本的长度分布图 b. mRNA 转录本的长度分布图 c. lncRNA 转录本中外显子数的分布图 d. lncRNA 转录本中外显子数的分布图。 注意 ：图 a 和 b 的水平坐标表示对数，转录本的长度位于 2 的底部，纵向坐标表示与长度对应的转录本数量。图 c 和 d 的水平坐标表示转录本的外显子数，纵坐标表示相应的转录本数。

鉴定差异表达的 lncRNA 和 mRNA

对病例组与 3 个对照组进行成对比较，鉴定差异表达的 lncRNAs 和 mRNA。我们注意到，与不同的对照组相比，PTE 肺腺癌患者的差异表达转录本的数量不同（图 3）。病例组与对照组 1 组（肺腺癌但无 PTE 的受试者）之间的比较显示差异表达最少的 lncRNA 和 mRNA，分别为 725 和 2052。lncRNAs 有 326 个上调和 399 个下调 ，mRNA 上调 1181 个，下调 871 个（图 3、 图 4a、图 5a）。相比之下，与对照组 3 相比，由健康受试者组成的组，病例组显示出差异表达最多的转录本（图 3），lncRNA 有 453 个上调和 737 个下调 ， 以及 mRNA 有 1327 个上调和 1674 个下调（图 3，图 4c，图 5 病例组和 PTE 组之间的差异表达转录本数量位于其他两个之间，lncRNAs 有 452 个上调和 480 个下调 ，以及 mRNA 有 949 个上调和 1257 个下调（图 3、图 4b、图 5 根据表达与对照组不同的转录本的数量，很明显病例组表现出不同的特征。 值得注意的是， 将肺腺癌合并 PTE 组与正常对照组进行比较， 表 1 和 表 2 列出了按倍数变化值排序的前 10 个上调和下调的前 10 个 lncRNAs 和 mRNA。

图 3 lncRNA 和 mRNA 差异比较的直方图注： 水平坐标代表每组的差异，纵坐标代表差异的数量。

图 4 差异表达 lncRNA 的火山图 a： 病例与对照 1 b： 病例与对照 2 c： 病例与对照 3

说明 水平坐标表示表达式差倍数的 Log2 值 ， 纵坐标表示差分表达式分析负对数后的 P 值。红点代表 lncRNA 的上调，绿点代表 lncRNA 的下调，黑点代表 lncRNA，差异不显著。下图是相同的。

图 5 差异表达 mRNA 的火山图 a： 病例与对照 1 b： 病例与对照 2 c： 病例与对照 3

表 1 前 10 名上调和下调的 lncRNA

表 2 前 10 名上调和下调的 mRNA

缩写：ID 表示组合的转录 ID。 日志 2FC| 表示差倍数的 log2 的绝对值。调节是指转录本的上调和下调。pos-info（position information） 表示组装的转录本在参考基因组上的位置信息。

lncRNA 靶基因的富集分析

为了探讨差异表达的 lncRNA 参与肺腺癌患者 PTE 形成的作用，我们首先使用 Target Finder 预测了他们的靶基因。然后我们采用 GO 来分析目标基因的功能作用。分析表明，有几种途径被富集（图 6）。其中，生物过程占 6018 项，细胞成分占 666 项 ， 分子功能占 1243 项。7927 个富集词中的大多数与细胞过程和免疫系统反应有关。GO 功能分析中每个二级条目上的差异基因和背景基因的分布如图 6 所示 。

图 6 GO 二次频率图 注： 横坐标代表 GO 数据库的分类内容 ， 纵坐标左侧代表基因百分比 ， 纵坐标右侧代表基因数量。

KEGG 数据库分析：采用 KEGG 基于正学的注释系统 （KOBAS） 比较和鉴定病例组和对照 3 组之间基因差异表达的通路。为了可视化富集程度，我们为目标基因构建了 KEGG 富集散点图，区分了病例组和正常对照组，富集程度通过富集因子、Q 值和在该途径中富集的基因数量来衡量。较高的丰富因子表示更明显的富集水平，而 Q 值越接近零表示富集的统计显著性越大。 随后对差异表达基因的 KEGG 通路分析揭示了与肺腺癌并发 PTE 密切相关的几种通路 ，例如免疫系统 、 细胞因子-细胞因子受体相互作用 、NF-κ B 信号通路 、 适应性免疫系统 、 炎症性肠病 （IBD）、 造血细胞谱系 、 先天免疫系统 ， 第二信使分子的产生 ，G α （i） 信号传导事件 ， 血小板活化、信号传导和聚集 ， 淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节相互作用 ， 免疫系统中的细胞因子信号传导 ， 止血 ，T 细胞受体信号通路 ， 原发性免疫缺陷 （ 校正 P 值 <0.05）。 研究还发现， 我们研究中肺腺癌合并 PTE 的一些通路也参与类风湿性关节炎、免疫系统疾病、炎症性肠病、1 型糖尿病自身抗体、原发性免疫缺陷、1 型糖尿病和格雷夫斯病 （ 校正 P 值<0.05）（图 7）。

图 7 差异表达基因的 KEEG 富集气泡图 a： 差异表达基因的 KEGG 通路分析 b： 差异表达基因的 KEGG 疾病富集分析注： 横坐标代表富集因子，vertical coordinate 分别表示 Pathway 和 Disease 名称。点的大小表示该通路和疾病中差异表达基因的数量，点的颜色对应于不同的 Q 值。

讨论

根据美国国家癌症协会 （American Cancer Society， ACS） 在 2025 年发布的肿瘤统计数据 ，肺癌是美国男性和女性第二常见的癌症 ， 肺癌是迄今为止美国癌症死亡的主要原因，约占所有癌症死亡人数的五分之一 ^[10].PTE 是肺癌的一种普遍并发症，是被诊断患有这种疾病的患者死亡的主要原因之一。PTE 的患病率加剧了肺癌患者的总体死亡率 ^[11-12]。 目前，肺癌合并 PTE 的发病机制尚不完全清楚。一般认为，PTE 与肺癌细胞合成多种促凝物质和分泌血管生长因子有关，导致肺癌患者出现高凝状态和凝血系统激活 ^[13]，但具体分子机制仍有待阐明。因此，肺癌合并 PTE 的具体发病机制有待进一步探讨。

LncRNA 是指一类核苷酸超过 200bp 且无蛋白质编码功能的功能性非编码 RNA 分子。最近的研究表明，lncRNA 在表观遗传、转录和转录后水平上调节基因表达。它广泛参与许多重要的调控过程，如 X 染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内转运等 ^{[14151617]。} 在各种疾病的背景下已经注意到 lncRNA 的失调，例如 早期胃癌患者血浆外泌体中 lncRNA 的上调，表明其作为胃癌早期检测的高特异性和敏感性生物标志物的潜力 ^[18].此外，乳腺癌患者血清中 lncRNA FAM83H-AS1 和 lncRNA-ATB 水平升高有望作为乳腺癌诊断和肿瘤进展和分期监测的新诊断和预后指标 ^[19,20]。 D 在疾病中不同表达的 lncRNA 已成为疾病的诊断标志物和新疗法的潜在靶点。 因此， 本研究采用 Illumina 高通量测序技术比较肺腺癌合并 PTE、肺癌、PTE 和正常人群中 lncRNA 和 mRNA 的差异表达 ，以寻找可能与肺腺癌合并 PTE 相关的 lncRNAs 和 mRNA。

在我们研究,当肺腺癌合并 PTE 组与肺腺癌组相比，共有 725 个差异表达lncRNA鉴定出 2052 个差异表达的 mRNA。肺腺癌合并 PTE 组与 PTE 组相比，共有 932 个差异表达lncRNA 鉴定出 2206 个差异表达的 mRNA。当肺腺癌合并 PTE 组与正常组相比，共有 1190 个差异表达lncRNA鉴定出 3001 个差异表达的 mRNA。其中，上调的 lncRNA 和差异倍数最大的 mRNA 分别为 MERGE.31027.6 和 ENST00000318988。 下调的 lncRNA 和 mRNA 差异倍数最大分别为 MERGE.30976.2 和 ENST00000397519。值得注意那ENST00000318988又名 DULLARD、HSA011916、NET56, CTDNEP1.GO 功能分析显示，它与细胞有丝分裂周期、蛋白结合等细胞活动有关。 一些研究人员表明，DULLARD 是软骨内骨化中 TGF-β 信号转导的新型负调节因子^[21]而在肺癌中可以检测到 TGF-β 表达增加^[22].我们相信那DULLARD （ENST00000318988） 在肺中的表达显著不同腺癌并发 PTE 与正常对照组也可能与激活 TGF - β信号通路。TGF 的激活-β信号通路在肺癌一方面可以促进肿瘤细胞的生长和转移。由于肿瘤细胞的快速增殖，无法建立血管网络以满足快速扩张的需要瘤体积因此，新生血管形成的结构经常异常，导致氧气可用性减少、营养物质缺乏和酸性物质在微环境中积累。 另一方面，PI3k/Akt/HIF-1a 信号通路被激活，HIF-1a 可以调节肿瘤血管生成中下游 VEGF 的表达。同时，TGF-β信号也与血管内皮细胞和血小板反应蛋白 S1 的形成直接相关（THB-S1 型） 诱导血小板聚集并抑制血管生成。因此，我们假设 TGF-β 信号通路的激活增强了 DULLARD 的反应性，并可能有助于肺腺癌患者 PTE 的发展，因为在比较单纯肺癌组或简单 PTE 组与正常对照组时未观察到 DULLARD 表达的差异。ENST00000397519 也称为 DFS70、LEDGF、PAIP、PSIP2、p52、p75.GO 的功能分析显示，它与 PC4 和 SFRS1 相互作用蛋白 1 （PSIP1） 有关。PSIP1最初被确定为转录共激活因子，在细胞存活、应激和自身免疫中具有重要作用^[23].PSIP1 在 T-ALL 中的功能丧失突变与肿瘤起始加速和破坏 H3K27me3 结合相关，而 T-ALL 细胞系中的下调会影响s 细胞增殖和线粒体活性，表明 PSIP1 是 T-ALL 的双重调节治疗候选物^[24]. 我们进一步比较了单纯肺腺癌组和单纯 PTE 组与正常对照组的差异表达 mRNA，发现单纯肺腺癌与正常对照组的 ENST00000397519 差异有统计学意义 (P<0.001， 日志 2FC|=7.864）. 单纯性肺栓塞组与正常对照组之间也存在差异，但差异无统计学意义。根据我们的结果和之前的研究结果，我们推测 ENST00000397519 可能是肺癌筛查的潜在标志物。lncRNA-MERGE.31027.6 和 lncRNA-MERGE.30976.2 在肺腺癌合并 PTE 与正常对照组的比较， 但在相关数据库中找不到它。尽管如此，我们已经了解了它的相关信息，并打算进行进一步的研究，以验证其功能及其在肺腺癌合并 PTE 发生中的作用。

GO 和 KEEG 分析显示，肺腺癌合并 PTE 存在一些密切相关的通路 ， 如免疫系统、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NF-κ B 信号通路、适应性免疫系统、炎症性肠病 （IBD）、造血细胞谱系、先天免疫系统、第二信使分子 α （i） 信号事件的产生和血小板活化。 可以看出， 大多数信号通路都参与了免疫反应的失调。有许多研究提供了免疫系统在疾病发生和发展中发挥关键和多重作用的证据，癌症和血栓形成也不例外。 最近的研究提供了先天免疫系统与静脉血栓形成 （VTE） 有关的证据 ^[25]。 研究表明，VTE 与其他几种炎症标志物，如 C 反应蛋白 （CRP）、IL-6、IL-8 和肿瘤坏死因子-α 之间存在可能关联 ^[26， ²⁷， ²⁸， ^29]。 我们的结果很好地证实了这些工作在转录组水平上的发现。

综上所述，本研究在肺腺癌并发 PTE 患者血液中确定了 lncRNA 和 mRNAs 的独特特征。其中，MERGE.31027.6、MERGE.30976.2、ENST00000318988 和 ENST00000397519 是参与 PTE 肺腺癌发生和发展的候选者。未来的研究旨在深入研究这些差异表达的 RNA 在 PTE 肺腺癌发生和进展中的功能作用，目的是确定肺癌并发肺栓塞的新诊断和治疗靶点。同时，建议医护人员对免疫系统、细胞因子-细胞因子受体相互作用和其他相关病理保持警惕，以确保及时预防和治疗血栓形成，并最大限度地减少不必要的患者发病率。

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