Nature 协议

https://doi.org/10.1038/s41596-023-00899-4

Protoco 公司

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小鼠皮肤伤口切除愈合研究的可重复策略

格式由作者提供且未经编辑

补充信息 – Nature Protocols

补充方案 1：使用活检打孔器进行尾基伤口。

计时：30 分钟。

以下补充协议旨在提供执行 tail-

基于伤口。有关后续程序、恢复、测量和其他步骤，请

请参阅主协议。

试剂：

o 丁丙诺啡（0.3 mg/ml，Richter Pharma）。

o 异氟醚 （Piramal）。

设备：

o 酒精制备垫（Covidien，货号 6818-1）。

o 弹簧手术剪刀：小，略微弯曲，尖端直径细（FST，猫。

编号 15023-10 或猫。编号 15011-12）。

o 镊子：弯曲（F.S.T，货号 91197-00）

o 带柱塞的 3 mm 活检打孔器（Robbins Instruments，货号。RBP-30P）

试剂设置：

o 请参阅主要手稿。

1|按照主方案（设置恢复笼）执行步骤 11-16。

2|按照主要方案执行步骤 28-29（对工作区域进行消毒，准备

工具和镇痛治疗）。消毒并准备好 3 mm 活检打孔器。

3|用酒精准备垫擦拭尾巴。

4|在尾巴的背侧，在距离尾巴基部 1 厘米处标记一个点。

5|将 3 毫米活检打孔器与标记居中，然后对皮肤轻轻按压

同时交替顺时针和逆时针旋转打孔器。

6|穿透皮肤后，取出带有切除皮肤的活检穿刺器。

如果要切除的皮肤仍然松散地附着在皮下组织上，请轻轻抓住它

镊子并使用手术剪刀去除结缔组织残留物。

关键步骤：尾部打孔切除术出血比背部皮肤更常见

伤口。如果需要，用无菌纱布加压以止血。

7|继续进行第 0 天的伤口大小测量、动物恢复和指定的随访

在主协议中，步骤 36。

补充方案 2：使用活检打孔器处理尾侧伤口。

计时：30 分钟。

以下补充协议旨在提供执行两个

使用穿刺活检工具在动物的侧面进行尾部伤口。后续行动

程序、恢复、测量和其他步骤，请参阅主要协议。

试剂：

o 丁丙诺啡（0.3 mg/ml，Richter Pharma）。

o 异氟醚 （Piramal）。

设备：

o 电动剃须刀：现成的，能够修剪到不到 1 毫米的长度。

o 酒精制备垫（Covidien，货号 6818-1）。

o 弹簧手术剪刀：小，略微弯曲，尖端直径细（FST，猫。

编号 15023-10 或猫。编号 15011-12）。

o 镊子：弯曲（F.S.T，货号 91197-00）

o 带柱塞的 3 mm 活检打孔器（Robbins Instruments，货号。RBP-30P）

试剂设置：

o 请参阅主要手稿。

1|按照主方案（脱毛和设置恢复笼）执行步骤 1-16。

去除背皮整个尾部的毛发。

2|用酒精棉片轻轻擦拭裸露的尾部皮肤。

3|当鼠标躺下，背面朝上时，沿中线画一条细线

骨干。定义中线时要精确，因为这条线稍后会是

用于确定伤口的位置。

4|将鼠标侧放。从中线拉动以拉伸皮肤

在居中线的两侧产生对称的蒙皮区域（一个朝上，并且

一个下来）（补充图 2A）

关键步骤：拉伸的皮肤应该是对称的，以确保

伤口。

5|用活检打孔器对拉伸区域施加压力。钻取活检工具应

从一侧穿透皮肤并继续到侧侧。旋转钻取活检

按压时顺时针和逆时针交替（补充图 2B）。

6|穿透皮肤两侧后（补充图 2C），取出活检

带有切除的皮肤块的打孔器。伤口应对称位于

距中线等距（主要文章，图 1B 中板）

7|继续进行第 0 天的伤口大小测量、动物恢复和随访，如主要

协议，步骤 36。

补充方案 3：整个安装表皮组织的免疫荧光染色。

计时： 5 小时。

起点：固定样品，用 PBS 洗涤 3 次。主协议中的步骤 74。

试剂：

o 正常山羊血清 （NGS）（Abcam，货号 ab7481）。

或 Triton-X100（Sigma，货号 T8787）。

o 吐温-20（Fisher Scientific，货号。BP337）。

o 目标一抗 （1Ab）。

o 二抗：抗 1Ab 的宿主，与所需的荧光团偶联。

o PBS（参见正文中的准备说明）。

o 牛血清白蛋白组分 V （BSA）（默克，货号 10735078001）。

设备：

o 锥形管：15 ml（Greiner bio-one，货号 188261）。

o 圆底，2 ml 管（Eppendorf，货号 0030120094）。

o 学生镊子（FST，货号 91156-11）。

o 旋转混合器（ELMI、Intelli-Mixer™ RM-2L）

o Kimwipe（Kimberly-Clark，货号 34120）。

o 铝箔（现成产品）。

试剂设置：

o BSA，10% （wt/vol）。在 15 ml 试管中，将 0.5 克 BSA 添加到 5 ml PBS 中。允许

颗粒在 4 °C 下溶解过夜或在 4 °C 下以非常缓慢的旋转 30' 溶解。避免

溶液中形成气泡。10% BSA 原液可在 4 °C 下储存 3

日。

或 Triton-X100 储备溶液，10% （vol/vol）。在 15 ml 试管中，加入 1 ml Triton-

X100 至 9 ml PBS。在 RT 下旋转过夜。Ttiton-X100 10% 溶液

在 4 °C 下储存 1 年。

注意： Tritox-X100 是一种去污剂。穿戴防护装备。

或 PBST 0.3% Triton-X100 （vol/vol）。在 15 ml 试管中，加入 0.3 ml 10% Triton-

X100 至 9.7 ml PBS。PBST （0.3% Ttiton-X100） 溶液可在 4 °C 下储存 1

年。

封闭和透化：

1|通过将以下试剂混合在 15 ml 试管中来制备封闭溶液。后

加入所有试剂，倒置试管数次混合：

试剂储备百分比

最终百分比

（体积/体积）

5 ml 体积

PBS 1X -

4.25 毫升

NGS 100% 5%

0.25 毫升

海卫一 X100

0.5 毫升

计算出所需体积为每个样品 1 ml（每个样品最少 0.5 ml）。在以下情况下纵向扩展

必要。

2|用 1 ml 封闭溶液填充 2 ml 试管（圆底），然后轻轻放置每个试管

组织在指定管中。在 RT 下轻轻摇晃 30 英尺（如果使用旋转装置，则为 60，30 rpm）。

一抗反应：

3|抗体稀释缓冲溶液是通过将以下试剂混合在 15

ml 管。加入所有试剂后，将试管倒置数次混匀：

试剂

库存百分比 最终百分比

（体积/体积）

5 ml 体积

PBS 1X -

4.25 毫升

BSA 10% 1% 0.5 ml Triton-X100 10% 0.5%

0.25 毫升

计算所需的体积（例如每个样品 1 ml）。应定义确切的体积

基于抗体的所需稀释度（例如，1：100 稀释度表示 10 l

每 990 l 稀释液中的抗体）。每个染色管（样品）的体积可以是

如果样品完全被液体覆盖，则减少到每个样品 200 l（参见步骤 5）。

4|在新的 15 ml 试管（或 2 ml 试管，如果可能，用于小体积）中，制备一抗

通过在抗体稀释缓冲液中稀释一抗来混合。对于用于

第一次，建议使用 1：100 至 1：500 的稀释度。

关键步骤：当使用多种抗体时，使用一抗很重要

在不同宿主物种中产生的抗体。

5|将混合物分成 2 ml 管（圆底）;每个样品 1 管。

6|轻轻地从封闭溶液中取出样品，在 Kimwipe 纸上吸干一次，然后放置

含有所需抗体混合物的试管。在 RT 下轻轻摇晃 1 小时（60°，如果使用，则为 30 rpm

旋转混合器）。或者，可以在 4 C 下过夜孵育。

7|用 PBST（0.1% Tween-20）填充新的 2 ml 试管，每个样品一个。将样本放入

用于洗涤的 PBST（如果使用旋转混合器，则在 RT 下 30 rpm、60、15 英尺）。重复两次。

关键步骤：PBST 可以通过移液在两次洗涤之间更换。然而，事实并非如此

建议没有经验的研究人员尽可能使用这种技术

不小心粘附在移液器上并撕裂。

二抗反应：

8|通过稀释荧光基团偶联物来制备二抗混合物

根据产品数据表，PBST 中的抗体 （0.3% Triton-X100）（未经检测

抗体，建议使用 1：250 稀释度）。计算所需体积为每 1 毫升

样本。根据需要缩小到每个样品 200 l，只要样品完全

被液体覆盖。

关键步骤：添加到混合物中的每种二抗都应识别宿主物种

的 1 个抗体。利用光谱避免荧光团的光谱重叠

查看器（例如，ThermoFisher 在线“Fluorescence-SpectraViewer”）：

https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer#!/).

9|将二抗混合物分成 2 ml 管（圆底），每个样品 1 管。

10|从 PBST（0.1% Tween-20）洗涤液中轻轻提起样品，在 Kimwipe 纸上吸干一次，

并将组织放入含有适当抗体混合物的试管中。在 RT 中摇晃 1 小时

（旋转混合器，模式：30 rpm，如果使用旋转混合器，则为 60）。或者，孵化可以是

在 4C 下过夜。在管子周围放置铝箔以防止

光损伤。

11|进行 DAPI 染色、PBST（0.1% Tween-20）洗涤，并在主要的步骤 75 进行封片

协议（值得注意的是，继续在 2 ml 管中工作，而不是 35 mm 培养皿，如主要所述

协议）。

补充讨论：进行基于荧光的检测时的注意事项

使用共聚焦显微镜对皮肤整体安装进行可视化。

为了实现整个疤痕区域的高分辨率多色成像和放大

级别为 10 倍或更高，通常需要组合多个拼接的“小”图像

一起（瓷砖拼接）。此外，要获得 3D z 堆栈图像，该过程可能需要

采集时间长。例如，以 20 倍的

放大可能需要收集 5x5 至 9x9 瓦片的数据，厚度为 50 μm

和 5 μm 的 z 堆栈间隔（大约单个单元的大小），需要采集

单个通道有 891 张图像 （9x9x11）。因此，成像过程的持续时间可能会造成

一个限制因素。

对于这种类型的实验，我们建议使用转盘共聚焦 （SDC） 系统，

这样可以缩短采集时间，同时减少光损伤的可能性

组织。我们在内部显微镜方面的经验表明，收购大型、缝合

使用SDC（Eclipse Ti2，尼康和CSU-W1，横河电机）的图像速度在10到50倍之间

比使用激光扫描共聚焦（LSM-880，蔡司）。但是，对于单个图像，最佳

仪器将取决于所需光学特性的多功能性

荧光团。

补充图 1：伤口的精确位置影响伤口愈合

过程。A） 可以确定和伤害小鼠背部皮肤上的凸起区域。

准确区域放错位置可能会导致亚隆起处出现几乎无法区分的伤口

地区。B） 在隆起 （n=9） 或突起下区域受伤的小鼠的伤口闭合分析

（n=7） 揭示了伤口闭合动力学的差异。

补充图 2：使用活检打孔器利用尾侧伤口。

A） 将麻醉的鼠标侧放。中线（主干线）定义明确

并标记。B） 以中线与边缘对齐的方式轻轻拉伸皮肤

折叠。在旋转打孔器的同时，将活检打孔器工具按过拉伸区域

顺时针和逆时针。C） 描绘活检打孔器穿透的图像

工具穿过折叠蒙皮的两侧。蓝色圆圈和红色方块用于横向

面板之间的方向。