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Nature 协议

https://doi.org/10.1038/s41596-023-00899-4

Protoco 公司

检查更新

1

小鼠皮肤伤口切除愈合研究的可重复策略

格式由作者提供且未经编辑

补充信息 – Nature Protocols

补充方案 1:使用活检打孔器进行尾基伤口。

计时:30 分钟。

以下补充协议旨在提供执行 tail-

基于伤口。有关后续程序、恢复、测量和其他步骤,请

请参阅主协议。

试剂:

o 丁丙诺啡(0.3 mg/ml,Richter Pharma)。

o 异氟醚 (Piramal)。

设备:

o 酒精制备垫(Covidien,货号 6818-1)。

o 弹簧手术剪刀:小,略微弯曲,尖端直径细(FST,猫。

编号 15023-10 或猫。编号 15011-12)。

o 镊子:弯曲(F.S.T,货号 91197-00)

o 带柱塞的 3 mm 活检打孔器(Robbins Instruments,货号。RBP-30P)

试剂设置:

o 请参阅主要手稿。

1|按照主方案(设置恢复笼)执行步骤 11-16。

2|按照主要方案执行步骤 28-29(对工作区域进行消毒,准备

工具和镇痛治疗)。消毒并准备好 3 mm 活检打孔器。

3|用酒精准备垫擦拭尾巴。

4|在尾巴的背侧,在距离尾巴基部 1 厘米处标记一个点。

5|将 3 毫米活检打孔器与标记居中,然后对皮肤轻轻按压

同时交替顺时针和逆时针旋转打孔器。

6|穿透皮肤后,取出带有切除皮肤的活检穿刺器。

如果要切除的皮肤仍然松散地附着在皮下组织上,请轻轻抓住它

镊子并使用手术剪刀去除结缔组织残留物。

关键步骤:尾部打孔切除术出血比背部皮肤更常见

伤口。如果需要,用无菌纱布加压以止血。

7|继续进行第 0 天的伤口大小测量、动物恢复和指定的随访

在主协议中,步骤 36。

补充方案 2:使用活检打孔器处理尾侧伤口。

计时:30 分钟。

以下补充协议旨在提供执行两个

使用穿刺活检工具在动物的侧面进行尾部伤口。后续行动

程序、恢复、测量和其他步骤,请参阅主要协议。

试剂:

o 丁丙诺啡(0.3 mg/ml,Richter Pharma)。

o 异氟醚 (Piramal)。

设备:

o 电动剃须刀:现成的,能够修剪到不到 1 毫米的长度。

o 酒精制备垫(Covidien,货号 6818-1)。

o 弹簧手术剪刀:小,略微弯曲,尖端直径细(FST,猫。

编号 15023-10 或猫。编号 15011-12)。

o 镊子:弯曲(F.S.T,货号 91197-00)

o 带柱塞的 3 mm 活检打孔器(Robbins Instruments,货号。RBP-30P)

试剂设置:

o 请参阅主要手稿。

1|按照主方案(脱毛和设置恢复笼)执行步骤 1-16。

去除背皮整个尾部的毛发。

2|用酒精棉片轻轻擦拭裸露的尾部皮肤。

3|当鼠标躺下,背面朝上时,沿中线画一条细线

骨干。定义中线时要精确,因为这条线稍后会是

用于确定伤口的位置。

4|将鼠标侧放。从中线拉动以拉伸皮肤

在居中线的两侧产生对称的蒙皮区域(一个朝上,并且

一个下来)(补充图 2A)

关键步骤:拉伸的皮肤应该是对称的,以确保

伤口。

5|用活检打孔器对拉伸区域施加压力。钻取活检工具应

从一侧穿透皮肤并继续到侧侧。旋转钻取活检

按压时顺时针和逆时针交替(补充图 2B)。

6|穿透皮肤两侧后(补充图 2C),取出活检

带有切除的皮肤块的打孔器。伤口应对称位于

距中线等距(主要文章,图 1B 中板)

7|继续进行第 0 天的伤口大小测量、动物恢复和随访,如主要

协议,步骤 36。

补充方案 3:整个安装表皮组织的免疫荧光染色。

计时: 5 小时。

起点:固定样品,用 PBS 洗涤 3 次。主协议中的步骤 74。

试剂:

o 正常山羊血清 (NGS)(Abcam,货号 ab7481)。

或 Triton-X100(Sigma,货号 T8787)。

o 吐温-20(Fisher Scientific,货号。BP337)。

o 目标一抗 (1Ab)。

o 二抗:抗 1Ab 的宿主,与所需的荧光团偶联。

o PBS(参见正文中的准备说明)。

o 牛血清白蛋白组分 V (BSA)(默克,货号 10735078001)。

设备:

o 锥形管:15 ml(Greiner bio-one,货号 188261)。

o 圆底,2 ml 管(Eppendorf,货号 0030120094)。

o 学生镊子(FST,货号 91156-11)。

o 旋转混合器(ELMI、Intelli-Mixer™ RM-2L)

o Kimwipe(Kimberly-Clark,货号 34120)。

o 铝箔(现成产品)。

试剂设置:

o BSA,10% (wt/vol)。在 15 ml 试管中,将 0.5 克 BSA 添加到 5 ml PBS 中。允许

颗粒在 4 °C 下溶解过夜或在 4 °C 下以非常缓慢的旋转 30' 溶解。避免

溶液中形成气泡。10% BSA 原液可在 4 °C 下储存 3

日。

或 Triton-X100 储备溶液,10% (vol/vol)。在 15 ml 试管中,加入 1 ml Triton-

X100 至 9 ml PBS。在 RT 下旋转过夜。Ttiton-X100 10% 溶液

在 4 °C 下储存 1 年。

注意: Tritox-X100 是一种去污剂。穿戴防护装备。

或 PBST 0.3% Triton-X100 (vol/vol)。在 15 ml 试管中,加入 0.3 ml 10% Triton-

X100 至 9.7 ml PBS。PBST (0.3% Ttiton-X100) 溶液可在 4 °C 下储存 1

年。

封闭和透化:

1|通过将以下试剂混合在 15 ml 试管中来制备封闭溶液。后

加入所有试剂,倒置试管数次混合:

试剂储备百分比

最终百分比

(体积/体积)

5 ml 体积

PBS 1X -

4.25 毫升

NGS 100% 5%

0.25 毫升

海卫一 X100

10%

1%

0.5 毫升

计算出所需体积为每个样品 1 ml(每个样品最少 0.5 ml)。在以下情况下纵向扩展

必要。

2|用 1 ml 封闭溶液填充 2 ml 试管(圆底),然后轻轻放置每个试管

组织在指定管中。在 RT 下轻轻摇晃 30 英尺(如果使用旋转装置,则为 60,30 rpm)。

一抗反应:

3|抗体稀释缓冲溶液是通过将以下试剂混合在 15

ml 管。加入所有试剂后,将试管倒置数次混匀:

试剂

库存百分比 最终百分比

(体积/体积)

5 ml 体积

PBS 1X -

4.25 毫升

BSA 10% 1% 0.5 ml Triton-X100 10% 0.5%

0.25 毫升

计算所需的体积(例如每个样品 1 ml)。应定义确切的体积

基于抗体的所需稀释度(例如,1:100 稀释度表示 10 l

每 990 l 稀释液中的抗体)。每个染色管(样品)的体积可以是

如果样品完全被液体覆盖,则减少到每个样品 200 l(参见步骤 5)。

4|在新的 15 ml 试管(或 2 ml 试管,如果可能,用于小体积)中,制备一抗

通过在抗体稀释缓冲液中稀释一抗来混合。对于用于

第一次,建议使用 1:100 至 1:500 的稀释度。

关键步骤:当使用多种抗体时,使用一抗很重要

在不同宿主物种中产生的抗体。

5|将混合物分成 2 ml 管(圆底);每个样品 1 管。

6|轻轻地从封闭溶液中取出样品,在 Kimwipe 纸上吸干一次,然后放置

含有所需抗体混合物的试管。在 RT 下轻轻摇晃 1 小时(60°,如果使用,则为 30 rpm

旋转混合器)。或者,可以在 4 C 下过夜孵育。

7|用 PBST(0.1% Tween-20)填充新的 2 ml 试管,每个样品一个。将样本放入

用于洗涤的 PBST(如果使用旋转混合器,则在 RT 下 30 rpm、60、15 英尺)。重复两次。

关键步骤:PBST 可以通过移液在两次洗涤之间更换。然而,事实并非如此

建议没有经验的研究人员尽可能使用这种技术

不小心粘附在移液器上并撕裂。

二抗反应:

8|通过稀释荧光基团偶联物来制备二抗混合物

根据产品数据表,PBST 中的抗体 (0.3% Triton-X100)(未经检测

抗体,建议使用 1:250 稀释度)。计算所需体积为每 1 毫升

样本。根据需要缩小到每个样品 200 l,只要样品完全

被液体覆盖。

关键步骤:添加到混合物中的每种二抗都应识别宿主物种

的 1 个抗体。利用光谱避免荧光团的光谱重叠

查看器(例如,ThermoFisher 在线“Fluorescence-SpectraViewer”):

https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer#!/).

9|将二抗混合物分成 2 ml 管(圆底),每个样品 1 管。

10|从 PBST(0.1% Tween-20)洗涤液中轻轻提起样品,在 Kimwipe 纸上吸干一次,

并将组织放入含有适当抗体混合物的试管中。在 RT 中摇晃 1 小时

(旋转混合器,模式:30 rpm,如果使用旋转混合器,则为 60)。或者,孵化可以是

在 4C 下过夜。在管子周围放置铝箔以防止

光损伤。

11|进行 DAPI 染色、PBST(0.1% Tween-20)洗涤,并在主要的步骤 75 进行封片

协议(值得注意的是,继续在 2 ml 管中工作,而不是 35 mm 培养皿,如主要所述

协议)。

补充讨论:进行基于荧光的检测时的注意事项

使用共聚焦显微镜对皮肤整体安装进行可视化。

为了实现整个疤痕区域的高分辨率多色成像和放大

级别为 10 倍或更高,通常需要组合多个拼接的“小”图像

一起(瓷砖拼接)。此外,要获得 3D z 堆栈图像,该过程可能需要

采集时间长。例如,以 20 倍的

放大可能需要收集 5x5 至 9x9 瓦片的数据,厚度为 50 μm

和 5 μm 的 z 堆栈间隔(大约单个单元的大小),需要采集

单个通道有 891 张图像 (9x9x11)。因此,成像过程的持续时间可能会造成

一个限制因素。

对于这种类型的实验,我们建议使用转盘共聚焦 (SDC) 系统,

这样可以缩短采集时间,同时减少光损伤的可能性

组织。我们在内部显微镜方面的经验表明,收购大型、缝合

使用SDC(Eclipse Ti2,尼康和CSU-W1,横河电机)的图像速度在10到50倍之间

比使用激光扫描共聚焦(LSM-880,蔡司)。但是,对于单个图像,最佳

仪器将取决于所需光学特性的多功能性

荧光团。

补充图 1:伤口的精确位置影响伤口愈合

过程。A) 可以确定和伤害小鼠背部皮肤上的凸起区域。

准确区域放错位置可能会导致亚隆起处出现几乎无法区分的伤口

地区。B) 在隆起 (n=9) 或突起下区域受伤的小鼠的伤口闭合分析

(n=7) 揭示了伤口闭合动力学的差异。

补充图 2:使用活检打孔器利用尾侧伤口。

A) 将麻醉的鼠标侧放。中线(主干线)定义明确

并标记。B) 以中线与边缘对齐的方式轻轻拉伸皮肤

折叠。在旋转打孔器的同时,将活检打孔器工具按过拉伸区域

顺时针和逆时针。C) 描绘活检打孔器穿透的图像

工具穿过折叠蒙皮的两侧。蓝色圆圈和红色方块用于横向

面板之间的方向。

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