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 文章信息

 关键词：

 脂肪自噬

铁死亡介导的多模式治疗
 溶解微针
 黑色素瘤
 抗肿瘤免疫

 摘要


铁死亡介导的多模式治疗已成为肿瘤消除的有前景策略，其中脂质过氧化物（LPO）发挥着关键作用。然而，由于细胞内游离脂肪酸（FFA）水平不足，治疗效率受到限制，这严重阻碍了 LPO 的产生。为了解决这一限制，我们提出了一种脂肪自噬策略，旨在降解脂滴（LDs）以释放 FFA，作为 LPO 生产的基本“燃料”。在本研究中，脂肪自噬诱导剂表没食子酸没食子酸酯（EGCG）与反应性氧种（ROS）产生剂苯乙基异硫氰酸酯（PEITC）通过 Fe 2 + Fe 2 + Fe^(2+)\mathrm{Fe}^{2+} 自组装形成 EFP 纳米胶囊，进一步整合到微针贴片中形成“全合一”EFP@MNs。EFP 的金属-多酚网络结构赋予其光热治疗能力。插入肿瘤后，释放的 EFP 纳米胶囊被证明通过代谢干扰诱导脂肪自噬，从而促进 LPO 的产生并促进铁死亡。 当与光热疗法结合时，这种方法通过推动肿瘤相关巨噬细胞向 M1 表型转变并增强树突状细胞的成熟，显著重塑了肿瘤免疫微环境。令人鼓舞的是，结合 α α alpha\alpha PD-L1 治疗，所提出的 EFP@MNs 在肿瘤消融方面表现出显著的疗效。我们的研究提出了一个多功能框架，用于利用微针贴片推动铁死亡介导的多模态疗法。

 1. 介绍


铁死亡疗法已成为对抗肿瘤的高效治疗方法[1-3]。许多研究报告了丰富的策略来激活肿瘤的氧化还原失衡，旨在进一步诱导致命脂质过氧化物（LPO）的产生和细胞膜破裂引发的细胞死亡[4]。更令人兴奋的是，利用肿瘤细胞铁死亡的策略被证明能够积极促进

抗肿瘤免疫疗法。已有报道表明，铁死亡疗法通过缓解肿瘤免疫抑制微环境（TIME）促进抗肿瘤免疫。在铁死亡疗法过程中，树突状细胞（DCs）的成熟和 M1 肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的极化因肿瘤细胞破裂而得到促进，这可能有助于免疫检查点抑制剂免疫疗法的治疗效果。铁死亡诱导剂的免疫疗法促进作用已被广泛研究。

在包括黑色素瘤在内的多种肿瘤模型中报道[8,9]。因此，铁死亡介导的抗肿瘤免疫疗法被确立为一种有前景的抗肿瘤策略，并展现出显著的治疗益处。

为了激活所需的肿瘤细胞铁死亡并随后进行免疫调节，丰富的 LPO 积累发挥着至关重要的作用[10]。细胞内 LPO 通常是由活性氧（ROS）与游离脂肪酸（FFA）之间的氧化还原反应产生的[11]。ROS 充当“火”，而 FFA 则作为“燃料”，通过对 FFA 长碳链内的不饱和结构进行过氧化反应来产生 LPO。然而，目前大多数研究仅关注于增加 ROS 含量，而忽视了 FFA 水平不足的问题[10]。已经开发出多种诱导 ROS 的试剂来激活肿瘤铁死亡，例如苯乙基异硫氰酸酯（PEITC）、肉桂醛和顺铂[12,13]。FFA 水平不足仍然是铁死亡介导的抗肿瘤免疫疗法在有效消除肿瘤方面的一个关键瓶颈问题。

事实上，一个精致的脂质代谢系统准确地调节细胞内 FFA 水平，以避免异常波动[14]。脂质滴（LDs）被认为是这一代谢系统的核心，作为脂质的多功能储存池，具有由中性脂质组成的疏水核心，周围包裹着各种蛋白质的磷脂单层[15]。由于 LDs 的储存，过量内化和新合成的脂质不会干扰稳态脂质水平，从而影响依赖脂质的肿瘤治疗方法，如铁死亡疗法[14]。因此，目前缺乏脂质代谢调节的单调 ROS 策略可能严重限制铁死亡诱导效率，无法满足 TIME 调节和肿瘤消融的要求。因此，迫切需要一种针对细胞内 FFA 水平激增的量身定制策略，伴随 ROS 诱导剂，以实现优化的铁死亡介导的抗肿瘤免疫治疗。

自噬作为肿瘤细胞自我降解机制，已被认定为调节细胞内生物大分子（例如脂质）水平的可靶向脆弱性[16]。在自噬过程中，受损的细胞器或蛋白质会被降解，以保护肿瘤细胞免受多重压力，同时释放与细胞信号传导或增殖相关的关键成分[17]。脂肪自噬作为自噬的一种特殊模式，在能量代谢耐受性中发挥着重要作用[18]。激活后，脂肪自噬导致脂滴的吞噬和随后的溶酶体降解，导致游离脂肪酸的释放[19]。释放的游离脂肪酸作为线粒体 β β beta\beta -氧化的底物，并在压力条件下促进能量产生[20]。因此，脂肪自噬过程在脂质从脂滴储存到释放游离脂肪酸的转变中至关重要。文献记载，药理诱导的脂肪自噬可能通过增加游离脂肪酸水平来增强抗肿瘤铁死亡疗法[21]。识别特定的脂肪自噬诱导剂在通过提供游离脂肪酸作为脂质过氧化的关键“燃料”来增强 ROS 介导的肿瘤铁死亡方面具有巨大潜力。 有一种强烈的动力去开发创新策略，利用脂肪自噬的力量来增强脂质过氧化，从而促进铁死亡介导的抗肿瘤免疫疗法。

尽管有这些见解，具体的脂肪自噬诱导剂仍然不太清楚。根据目前的知识，脂肪自噬是由与能量压力相关的细胞信号通路触发的。最近的研究调查了饥饿诱导或热量限制模拟物（CRM），证明它们在激活与能量压力相关的细胞信号方面具有潜力，因此在诱导脂肪自噬方面具有重要前景[22]。值得注意的是，CRM 被认为模拟热量限制的生化效应而不导致体重减轻，并被报道能够激活关键的自噬信号通路，如 AMPK 激活和 mTOR 抑制[23]。因此，利用 CRM 构建脂肪自噬驱动的策略是有效的。多酚是一类以其安全性和成本效益为特征的天然衍生化合物，广泛被认为是经典的

在这种情况下的 CRM [22,24]。例如，使用表没食子酸没食子酸酯（EGCG）治疗，作为最广泛使用的多酚之一，已被报道能在小鼠中诱导脂肪自噬 [25]。因此，假设利用 EGCG 有可能在黑色素瘤等肿瘤中诱导脂肪自噬，为促进铁死亡介导的抗肿瘤免疫疗法提供了潜在候选者。

此外，由于其典型的儿茶酚结构使其能够将金属离子与酚羟基配位，EGCG 在生物医学工程中具有深远的应用。EGCG 可以用于构建独特的金属-酚网络（MPN）结构，这些结构不仅可以作为药物包封和递送的纳米胶囊，还具备优良的光热转换效率[26,27]。一方面，将 ROS 诱导剂纳入 MPN 框架中以制造创新的纳米胶囊是合理的，从而优化药物递送效率。另一方面，由于 MPN 纳米胶囊的光热转换效率，光热疗法（PTT）可以同时与铁死亡介导的抗肿瘤免疫疗法相结合，预计将展现出通过高温消融肿瘤和增强免疫刺激的显著能力[28]。通过利用这些定制的纳米胶囊，我们不仅可以期待脂肪自噬与铁死亡之间的和谐相互作用，还可以期待铁死亡/PTT/免疫疗法的多模态治疗。 因此，MPN 纳米胶囊可以作为一种“全能”平台，用于脂肪自噬驱动的铁死亡介导的多模态治疗。

在此，提出了一种基于“全合一”MPN 纳米胶囊的脂肪自噬驱动策略，用于黑色素瘤的治疗，旨在通过促进 LPO 的产生来增强铁死亡介导的多模态疗法。考虑到黑色素瘤病变深深分布在角质层屏障下，采用溶解微针（MNs）贴片通过有效克服屏障以最小的侵入性来增强经皮药物输送效率[29]。为了验证这一推测，EGCG 与 Fe 2 + Fe 2 + Fe^(2+)\mathrm{Fe}^{2+} 自组装为纳米胶囊系统以包裹 PEITC，称为 EFP。EFP 纳米胶囊进一步装载到由透明质酸（HA）构建的微针尖端，构建 EFP@MNs。插入皮肤并被肿瘤细胞内化后，释放的 EGCG 被假设为触发脂肪自噬，以提供足够的细胞内 FFA，促进 LPO 的增强产生并增强铁死亡疗法。所提出的“全合一”EFP@MNs 被用作铁死亡/PTT/免疫疗法多模态疗法的多功能平台。 预期衰亡的肿瘤细胞通过上调树突状细胞的成熟和 M1 型巨噬细胞极化来调节 TIME，最终增强抗肿瘤免疫。当 EFP@MNs 与抗 PD-L1 抗体（ α α alpha\alpha PD-L1）结合时，显示出强大的肿瘤生长抑制，甚至完全消除肿瘤。本研究强调了 EFP@MNs 作为多模式治疗平台的巨大潜力。


2. 结果与讨论


2.1. EFP 成功制备并表征。


LDs 的积累被假设在肿瘤细胞中显著，而 EGCG 预计通过诱导脂肪自噬来降低 LDs 水平。为了初步确认这一假设，在体外和体内确定了 LDs 的数量。在肿瘤细胞和组织中发现了显著的 LDs 积累，而 EGCG 处理显著降低了 LDs 水平，伴随绿色荧光的减少（图 1a 和 b）。因此，EGCG 被认为是一个潜在的脂肪自噬诱导剂，以增强铁死亡治疗，可以用于构建 EFP（图 1c）。所提出的 EFP 纳米胶囊表现出狭窄的粒径分布，水动力学粒径为 151.6 纳米，聚分散指数（PDI）为 0.317（图 1d）。这些结果表明粒径分布均匀且可接受。EFP 纳米胶囊的 zeta 电位记录约为-18.6 mV（图 S1）。散射

方案 1. “一体化”MPN 纳米胶囊集成微针贴片的示意图，用于脂肪自噬驱动的铁死亡介导的多模态治疗

三批 EFP 纳米胶囊的场自相关函数（ACFs）曲线被发现平滑且可重复，散射强度衰减速率较快，表明尺寸分布均匀（图 S2）。透射电子显微镜（TEM）分析显示，制备的 EFP 纳米胶囊具有均匀的尺寸和规则的形态（图 S3）。此外，相应的元素 X 射线成像结果揭示了明显的铁和氧分布，证明了 MPN 结构的形成（图 S4）。

为了确认疏水性 PEITC 在 MPN 中的包封，记录了傅里叶变换红外光谱（FTIR）和紫外-可见光谱。正如图 1e 所示，与 FP 组（仅 PEITC 和 Fe 2 + Fe 2 + Fe^(2+)\mathrm{Fe}^{2+} ）相比，EF（仅 EGCG 和 Fe 2 + Fe 2 + Fe^(2+)\mathrm{Fe}^{2+} ）和 EFP 组中 PEITC 的特征峰消失，暗示了 PEITC 的包封。此外，UV-Vis 光谱显示 EFP 组中 EGCG 的 274 nm 明显特征吸收峰，而 PEITC 的 245 nm 吸收峰消失，表明构建了以 MPN 为壳、PEITC 为核的核壳结构（图 1f）。为了进一步验证 EFP 自组装过程中的关键驱动力，进行了严格的研究，通过向 EFP 悬浮液中添加过量的乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠（NaCl）、十二烷基硫酸钠（SDS）和尿素（Fig. 1g）。在 EDTA 和 SDS 组中监测到明显的褪色，这分别表明在自组装过程中协调键和疏水力的参与。 然而，通过添加氯化钠（消除静电力）和尿素（氢键变形）并未发现明显的外观变化，表明它们没有发挥作用。更准确地说，进行了分子动力学（MD）模拟，以通过模拟 EGCG、PEITC 和 Fe 2 + Fe 2 + Fe^(2+)\mathrm{Fe}^{2+} 的组装性能来阐明自组装过程。如图 1h 所示，系统中的势能逐渐降低，表明明显的分子间相互作用和复合物的形成。在溶液中获得的 PEITC/EGCG/ Fe 2 + Fe 2 + Fe^(2+)\mathrm{Fe}^{2+} 自组装的快照



图 1. EFP 纳米胶囊的制备和表征。a) B16 细胞中 LDs 的染色，使用或不使用 EGCG 处理。b) B16 肿瘤组织中 LDs 的染色，使用或不使用 EGCG 处理。c) EFP 自组装的示意图。d) EFP 纳米胶囊的尺寸分布。e) FP、EF 和 EFP 纳米胶囊的 FTIR 光谱。f) EFP 纳米胶囊的 UV-Vis 光谱。g) 使用不同试剂处理的 EFP 纳米胶囊悬浮液的照片。h) 通过 MD 模拟计算的 PEITC/EGCG / Fe 2 + / Fe 2 + //Fe^(2+)/ \mathrm{Fe}^{2+} 自组装过程中的势能变化。i) 通过 298 K 下的 MD 模拟获得的 PEITC/EGCG/Fe 2 + 2 + ^(2+){ }^{2+} 自组装的快照。所有分子均以球棍模型表示，PEITC（蓝色），EGCG（红色）， Fe 2 + Fe 2 + Fe^(2+)\mathrm{Fe}^{2+} （蓝色）。为清晰起见，水分子未显示。

（有关本图例中颜色引用的解释，请参阅本文的网络版本。）

图 2. EFP 纳米胶囊的体外诱导铁死亡能力。a) 不同处理下 B16 细胞在不同浓度下的细胞活力。b) 用 EFP 和不同调控细胞死亡通路抑制剂处理的 B16 细胞的相对细胞活力。c) 不同处理下 B16 细胞的 GPX4 活性。d) 流式细胞术检测和 e) 细胞内 ROS 水平的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测。f) 细胞内 LPO 水平的流式细胞术检测。g) 不同处理下 B16 细胞的相对细胞内 MDA 水平。h) 不同处理下 B16 细胞的透射电子显微镜（TEM）图像。比例尺： 2 μ m 2 μ m 2mum2 \mu \mathrm{~m} （上）和 500 纳米（下）。i) B16 细胞的单细胞 3D 表面拓扑图像和代表性 AFM 拓扑图像。j) B16 细胞的代表性表面拓扑。k) 单细胞的高度轮廓线分析。使用 ANOVA 或 t t tt -检验来确定数据之间是否存在显著差异。 P P PP 值样式： ∗ p < 0.05 ∗ p < 0.05 ^(**)p < 0.05{ }^{*} p<0.05 ； ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 ^(****)p < 0.01;^(******)p < 0.005;^(********)p < 0.001{ }^{* *} p<0.01 ;{ }^{* * *} p<0.005 ;{ }^{* * * *} p<0.001 。

氧化应激诱导和自噬辅助的铁死亡主导了 EFP 诱导的细胞死亡。然而，凋亡抑制剂 Z-VADFMK 和坏死抑制剂 Necrostatin-1 并未影响细胞死亡特征，表明在 EFP 诱导的细胞死亡过程中没有参与凋亡和坏死。

然后，测量了一系列与铁死亡相关的细胞信号指标，以阐明铁死亡机制。与对照组相比，谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）的活性在 EF 组和 EFP 组中显著下调，显示出典型的铁死亡特征，即崩溃的氧化还原系统（图 2c 和图 S7）。与 EF 组相比，EFP 的 GPX4 下调能力增强可能归因于 PEITC 的作用。此外，EFP 处理的细胞内谷胱甘肽水平也显著下调，进一步表明其诱导铁死亡的性能（图 S8）。有趣的是，FP 组的 GPX4 活性略有改善，这可能归因于活化的内质网应激（ER 应激）。之前有报道指出，肿瘤细胞在氧化压力下会触发 ER 应激，以保护自己免于死亡。HSAP70 已被证明在 ER 应激反应中上调，负责与 GPX4 复合以抑制 GPX4 降解[30]。该假设通过 FP 组中 HSP70 表达的上调得到了验证（图 S9)，而 EF 和 EFP 组中 HSP70 的下调显示了 EGCG 的 ER 应激抑制能力，这与其他报告一致。此外，HSP70 的下调也有望通过减轻肿瘤细胞的耐热性来增强 PTT，这为多模式治疗提供了巨大的潜力[31]。

细胞内 ROS 水平是铁死亡的一个关键指标。通过 DCFH-DA 探针染色确定，FP 和 EF 组表现出几乎没有 ROS 产生，这可能归因于费顿反应不足和强抗氧化系统（图 2d 和 e，图 S10 和 S11）。然而，EFP 处理诱导了明显的 ROS 激增，表明 REDOX 系统失衡。值得注意的是，EFP 组中显著的 ROS 升高可能是 ROS 诱导剂 PEITC、铁离子催化的费顿反应和 GPX4 活性降低的综合效应。费顿反应产生的羟基自由基在细胞内被检测到，结果显示 EFP 纳米胶囊显著促进了费顿反应（图 S12）。具体原因可能是 EFP 处理增强了细胞内摄取和细胞外释放的 Fe 2 + Fe 2 + Fe^(2+)\mathrm{Fe}^{2+} 水平（图 S13 和图 S14）。

为了验证 LPO 在 ROS 爆发中的主要作用，使用 C11-Bodipy 探针监测脂质的过氧化（图 2f 和图 S15）。在 EFP 处理的细胞中发现明显的 LPO 产生，而 FP 和 EF 组则记录了微不足道的变化。此外，丙二醛（MDA）的检测，作为 LPO 的关键指标，显示了类似的结果（图 2g）。这些结果共同证明了 EFP 处理促进了 LPO 的产生，这可能归因于脂肪自噬驱动的策略。

根据之前的报告，肿瘤细胞铁死亡的证据将通过一系列形态特征表现出来，包括线粒体缩小、细胞膜破裂、铁死亡孔和表面粗糙度增加[32]。为了进一步确认 EFP 处理的 B16 细胞中的铁死亡过程，研究了这些形态变化。B16 细胞线粒体的透射电子显微镜（TEM）图像显示出典型的缩小形态和 EFP 处理引起的膜密度增加（图 2h），这表明了经典的铁死亡特征。然而，FP 和 EF 处理对线粒体没有明显影响。然后，通过原子力显微镜（AFM）成像研究了细胞膜形态的变化（图 2i-k）。如图所示，与对照组相比，在 EFP 处理的细胞表面发现了几个明显的铁死亡孔，表明了典型的铁死亡特征。此外，量化的细胞表面粗糙度显示出类似的结果，在 EFP 处理的细胞中记录了显著增强的值（图 S16）。


2.3. EFP 诱导脂肪自噬以增强铁死亡


在证明 EFP 增强铁死亡的效果后，全面探讨了其潜在机制。假设 EFP 可以诱导脂肪自噬以增加细胞内 FFA 水平，从而进一步触发 LPO 的产生并最终增强铁死亡。为了验证这一假设，进行了系列实验。

首先，定量确定了不同处理的 B16 细胞中 LDs 的数量（图 3a 和 b）。正如预期的那样，在 EF 和 EFP 处理的细胞中记录到了显著的 LDs 减少，这可能归因于 EGCG 诱导的脂肪自噬。有趣的是，FP 处理也减少了 LDs 的数量，这可能与细胞代谢紊乱有关。具体原因仍需进一步探讨。为了进一步阐明 LDs 水平，测量了分布在 LDs 表面的 LDs 相关蛋白脂肪蛋白（ADFP）的表达（图 3c 和 d）。在 EF 和 EFP 处理的细胞中发现 ADFP 下调，这与 LDs 染色结果一致。然后，LDs 的减少促进了细胞内 FFA 的增加，暗示脂肪自噬的发生（图 3e 和 f）。此外，还进行了脂质组学分析，以更准确地确定细胞内 FFA 水平。如图 3g 所示，与对照组相比，EFP 处理的细胞中各种 FFA 显著增加。 特别是，发现不饱和游离脂肪酸明显升高，这表明了 LPO 生产的巨大潜力（图 S17）。细胞内游离脂肪酸的增加可能作为“燃料”促进 LPO 的生产，从而合理化 EFP 增强的铁死亡效率。然后，初步研究了脂滴减少的具体机制。为了验证脂肪自噬过程，将铁死亡抑制剂 Fer-1、DFO 和自噬抑制剂 CQ、3-MA 施加于 EFP 处理的细胞，以评估脂滴数量和 LPO 生产。如图 S18 和图 3h-k 所示，铁死亡抑制剂对 EFP 处理的脂滴减少效果没有影响，而自噬抑制剂则逆转了 EFP 纳米胶囊诱导的脂滴减少趋势。此外，还测量了 LPO 的生产（图 S19）。EFP 诱导的 LPO 过量生产不仅受到铁死亡抑制剂的阻碍，也受到自噬抑制剂的影响，表明了与自噬相关的铁死亡机制。这些结果强烈支持 EFP 诱导的脂滴减少是以自噬依赖的方式来辅助铁死亡，而不是由铁死亡引起的。

为了阐明脂肪自噬的详细机制，概述并证明了 EFP 诱导的脂肪自噬假说的整体图景。EFP 可能作为 CRM 模拟与能量压力相关的生化结果，这些结果以代谢紊乱和线粒体功能破坏为特征，诱导 AMPK 激活和 mTOR 抑制，最终触发自噬信号通路。然后，活化的自噬以自噬体形成和 LC3 表达为标志，将 LDs 输送到溶酶体进行降解。进行了几项实验来证明这一过程。

基于假设，EFP 的脂肪自噬激活与能量应激相关的生化结果相关。因此，细胞内 ATP 和乳酸水平这两个关键代谢标志物被确定用于评估能量应激过程。如图 S20 和 S21 所示，所有药物处理组均发现显著减少，而 EFP 组表现出最显著的下降，暗示其代谢干扰效应。此外，通过测量线粒体膜电位（MMP）评估了线粒体这一关键代谢细胞器的功能。MMP 的丧失被认为是线粒体功能障碍的一个关键特征。如图 S22 和 S23 所示，EF 和 EFP 处理明显诱导 MMP 下降，伴随红色荧光减少和绿色荧光增强，表明线粒体功能障碍。最后，通过西方印迹实验（图 S23-26）确定了与能量应激相关的关键通路信号 AMPK 和 mTOR。之前的研究报告了 AMPK-

图 3. 用 EFP 纳米胶囊处理的 B16 细胞的 LDs 降解和 FFA 释放。a) 不同处理的 B16 细胞的 LDs 染色。比例尺： 40 μ m 40 μ m 40 mum40 \mu \mathrm{~m} （上）和 20 μ m 20 μ m 20 mum20 \mu \mathrm{~m} （下）。b) LDs 数量的定量分析。c) ADFP 表达的 Western blot 图像。d) ADFP 表达的定量分析。e) 细胞内 FFA 测量的照片。f) 不同处理的 B16 细胞的细胞内 FFA 水平。g) 不同处理的 B16 细胞的脂质组学分析。h-j) 用 EFP 和不同调节细胞死亡途径抑制剂处理的 B16 细胞每个细胞的 LDs 数量。使用 ANOVA 或 t t tt -检验来确定数据之间是否存在显著差异。 P P PP 值样式： ∗ p < 0.05 ; ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 ∗ p < 0.05 ; ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 ^(**)p < 0.05;****p < 0.01;******p < 0.005;********p < 0.001{ }^{*} p<0.05 ; * * p<0.01 ; * * * p<0.005 ; * * * * p<0.001 。

mTOR 轴连接了能量压力和自噬诱导[23,33]。如所示，在 EF 和 EFP 处理的细胞中记录到了 mTOR 的下调和 AMPK 的上调，证明了代谢干扰引发的脂肪自噬激活。总体而言，这些结果暗示 EFP 处理诱导了能量压力介导的脂肪自噬。

在证明了能量应力性能后，脂肪自噬过程得到了进一步验证。首先，LDs 和溶酶体一起被染色以分析脂肪自噬过程。如图 4a 和 b 所示，LDs 的减少伴随着溶酶体的增加，溶酶体和 LDs 的定量比率在 EF 和 EFP 处理下显著提高，表明 LDs 的降解与溶酶体的上调有关。更重要的是，在 EF 和 EFP 处理的细胞中记录到了 LDs 和溶酶体的共定位，这进一步证明了 LDs 被输送到溶酶体中（图 4c）。这些结果共同证明了脂肪自噬的激活。然后，评估了自噬通量以进一步

证明触发自噬的机制。LC3 是自噬体和自噬溶酶体的主要结构蛋白，广泛用作监测细胞自噬的标志物[17]。可以预期，EF 和 EFP 处理显著增加了 LC3II/LC3I 的表达（图 4d 和 e）。细胞内 LC3 的免疫荧光染色显示了类似的结果（图 S27），证明自噬体的增加。然后，自噬体被特定染料 MDC 直接染色（图 S28）。与对照组和 FP 组相比，EF 和 EFP 处理的细胞显示出更亮的区域，表明自噬体的积累。此外，B16 细胞的透射电子显微镜图像得出类似的结论，即在 EF 和 EFP 处理的细胞中记录到显著更多的自噬体（图 4f）。以上所有结果共同证明了脂肪自噬激活的机制：EFP 可以诱导异常的细胞代谢，进一步诱导能量应激通路，进而调节 AMPK-mTOR 轴，最终诱导脂肪自噬（图 4 g）。

图 4. EFP 纳米胶囊的脂肪自噬激活机制。a) 不同处理下 B16 细胞的 LDs 和溶酶体染色。比例尺：20 毫米。b) 溶酶体数量与 LDs 数量比率的定量分析。c) 不同处理下 B16 细胞中 LDs 与溶酶体的共定位。比例尺：20 μ m μ m mum\mu \mathrm{m} 。d) LC3II 和 LC3I 表达的西方印迹图像。e) LC3II/LC3I 比率的定量分析。f) 不同处理下 B16 细胞的透射电子显微镜图像。白色箭头，自噬体。比例尺： 2 μ m 2 μ m 2mum2 \mu \mathrm{~m} （上）和 500 纳米（下）。g) 不同处理下 B16 细胞的细胞内 FFA 水平。g) 脂肪自噬过程的示意图。h-j) 不同处理下 B16 细胞的转录组分析结果。使用 ANOVA 或 t t tt -检验来确定数据之间是否存在显著差异。 P P PP 值样式： ∗ p < 0.05 ; ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 ∗ p < 0.05 ; ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 ^(**)p < 0.05;^(****)p < 0.01;^(******)p < 0.005;^(********)p < 0.001{ }^{*} p<0.05 ;{ }^{* *} p<0.01 ;{ }^{* * *} p<0.005 ;{ }^{* * * *} p<0.001 。

然后，进行了转录组分析，以进一步描述脂肪自噬的潜在机制。如图 4h 所示，在 EFP 处理下，约有 1775 个基因上调，而 2578 个基因下调，表明 EFP 导致了显著的基因扰动。

治疗。为了寻找显著富集的通路，我们基于基因本体（GO）进行了注释和功能富集。如图 4i 所示，差异基因在多个通路中显著富集，包括细胞分裂、细胞质、金属。

离子结合和蛋白质结合与代谢、自噬和铁死亡过程密切相关。在基于京都基因和基因组百科全书（KEGG）的分析中也可以发现类似的结果（图 S29）。受到这一结果的鼓舞，我们进一步分析了与脂滴、自噬和铁死亡相关的基因表达。

（图 4j）。如所示，EFP 组中与 LD 相关的基因表达水平显著下调，表明有明显的减少。同时，经典的自噬诱导基因如 Map1lc3a、Map1lc3b、Atg13、Atg4d 和 Atg14 表现出上调，而自噬抑制基因如 Hmgb1 和 Cisd2 则表现出下调。

图 5. EFP@MNs 的制备和表征。A-c) EFP@MNs 的照片。d) EFP@MNs 中 EFP 纳米胶囊的分布。e) EFP-FITC@MNs 的荧光图像。f) EFP-FITC@MNs 的三维重建。g) EFP-FITC@MNs 的逐层扫描。h) EFP@MNs 插入后皮肤的 H&E 染色切片图像。i) EFP@MNs 的 Paraflim 渗透效率。j) 通过质构分析仪检测的 EFP@MNs 的力曲线。k) EFP@MNs 插入后 EFP-FITC 在皮肤中的体外扩散。l) EFP@MNs 插入后 EFP-FITC 在肿瘤-bearing 小鼠中的体内扩散。m) EFPFITC@MNs 插入肿瘤-bearing 小鼠后的体内分布。n) EFP-FITC@MNs 在肿瘤部位的定量分析。o) EFP-FITC@MNs 在 10 小时的体外分布分析。使用 ANOVA 或 t t tt -检验来确定数据之间是否存在显著差异。 P P PP 值样式：* p < 0.05 p < 0.05 p < 0.05p<0.05 ; * p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01p<0.01 ; *** p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 p < 0.005;^(********)p < 0.001p<0.005 ;{ }^{* * * *} p<0.001 。

显示出下调。这些发现为自噬的激活提供了证据。值得注意的是，Hmgb1 的下调也作为 ICD 的一个指标，从而确认了铁死亡与免疫治疗之间的协同关系。活化自噬引发的脂肪自噬可能有助于 LDs 的减少。此外，观察到与铁死亡相关的基因发生了变化，特别强调了那些参与脂质代谢的基因（ACSL3 和 ACSL4）。总体而言，这些结果强烈支持以脂肪自噬为动力的铁死亡过程。


2.4. EFP@MNs 被制备为具有所需的药物递送性能


微针（MNs）被认为是下一代生物医学设备，用于有效的经皮药物输送。通过机械性穿刺角质层以创建微通道阵列，微针预计能够克服皮肤输送障碍，促进局部病变药物的积累并减少系统性副作用。因此，在本研究中，设计并制备了负载 EFP 的微针（EFP@MNs），通过将 EFP 纳米胶囊整合在微针的针尖中。制备的 EFP@MNs 配备了 144 根典型三维金字塔结构的针（如图 5a-b 所示）。EFP 纳米胶囊被加载在针尖中，这一点通过针尖的黑色证明（如图 5 c − d 5 c − d 5c-d5 \mathrm{c}-\mathrm{d} 所示）。为了进一步验证结构和纳米胶囊的分布，合成了 EGCG-FITC 并用于制备 EFPFITC@MNs。在针尖观察到的强绿色荧光表明 EFP-FITC 的有效积累，符合之前的结果（如图 5e 所示）。此外，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获得了 EFP-FITC@MNs 的逐层扫描及其三维重建图像。如图 5f 和 g 所示，EFP-FITC 被加载在针尖，长度约为 600 μ m 600 μ m 600 mum600 \mu \mathrm{~m} 。 总之，这些结果共同表明 EFP@MNs 成功制备。然后，评估了溶解干燥的 EFP@MNs 后颗粒大小和分布的变化。如图 S30 所示，EFP 纳米胶囊的大小分布峰在 EFP@MNs 组中被记录下来。有趣的是，还发现了另一个较小尺寸的峰，这可能归因于与空白 MNs 的大小分布相比，所用材料（HA 和 PVPK90）在 MNs 中的自组装。

然后，系统地研究了 EFP@MNs 的透皮给药性能。通过大鼠皮肤和 Parafilm 评估了所提议的 EFP@MNs 的皮肤插入能力。如图 5h 和图 S31 所示，在大鼠皮肤中构建了明显的微通道阵列，表明其所需的机械强度。作为一种人工疏水聚合物膜，Parafilm 通常用于模拟皮肤以测量 MNs 的穿透效率[34]。EFP@MNs 被发现成功穿透了 4 层 Parafilm（约 508 μ m 508 μ m 508 mum508 \mu \mathrm{~m} ），效率超过 80 % 80 % 80%80 \% ，其厚度远远超过角质层的厚度（图 S32 和图 5i）。这些结果表明，制备的 EFP@MNs 具备足够的插入强度。为了准确评估机械强度，评估了纹理分析仪（图 5j 和图 S33）。如图所示，EFP@MNs 的断裂力约为 49.13 N（144 根针的总值），而空白 MNs 的断裂力约为 46.8 N，两者均远高于穿透皮肤所需的力（ 0.1 N / 0.1 N / 0.1N//0.1 \mathrm{~N} / 针）[35]。 此外，结果表明，EFP 纳米胶囊在微针中的负载增强了其机械强度，这可能是由于 HA 与 MPN 结构之间相互作用引起的分子重排所致[36]。然而，值得注意的是，纳米胶囊的负载并不总是增强机械强度，负载量是一个重要参数。在我们的案例中，EFP 纳米胶囊与 HA 的比例（约 1:40）表现出显著的机械强度促进效果。需要进一步研究以优化负载量。

除了显著的皮肤插入能力外，当 EFP@MNs 接触水时，记录到在 18 秒内快速溶解的速度（图 S34）。在皮肤或肿瘤中施用后，记录到大鼠皮肤中明显的水平和垂直药物扩散（图 5k）。

和图 S35）以及肿瘤-bearing 小鼠（图 51），揭示了 EFP@MNs 的良好药物递送效率。这种理想的经皮药物递送性能满足了有效肿瘤治疗结果的前提条件。然而，值得注意的是，装载在微针中的纳米胶囊的递送可能会受到一系列参数的影响，例如纳米胶囊的聚集或扩散、给药方法以及病变的病理状态。因此，在临床使用 EFP@MNs 时，考虑这些参数至关重要。

然后，在 B16 肿瘤小鼠模型中检测了 EFP@MNs 的体内分布。如图 5m-n 所示，在 EFP@MNs 给药后，肿瘤中记录到了强烈的荧光信号。还显示出长达 8 小时的肿瘤滞留，暗示在病变中有显著的载荷积累。此外，10 小时的离体结果显示，肿瘤中仍然存在信号，而肝脏和肾脏中记录到的荧光信号很少（图 5o）。这些结果表明，直到 10 小时，肿瘤中仍保留了一定量的纳米胶囊，其代谢主要通过肝脏和肾脏。上述结果共同表明，EFP@MNs 对肿瘤部位具有出色的药物递送效率，这可能有助于铁死亡介导的多模式治疗。


2.5. EFP@MNs 增强的肿瘤铁死亡治疗在体内


在成功开发 EFP@MNs 后，其抗肿瘤效率在 B16 肿瘤小鼠模型中进行了评估。肿瘤小鼠被随机分为四组，当肿瘤体积达到 150 mm 3 150 mm 3 150mm^(3)150 \mathrm{~mm}^{3} 时，分别在第 3 天和第 6 天用不同的 MNs（FE@MNs、EF@MNs 和 EFP@MNs）进行两次给药（图 6a）。监测肿瘤体积以评估效率。如图 6b 和图 S36 所示，对照组记录了惊人的肿瘤进展，而 MNs 治疗组的肿瘤生长显著抑制。其中，EFP@MNs 组表现出肿瘤发展最被抑制，肿瘤体积增量最小，显示出最佳的抗肿瘤效率。上述结果共同表明所提出的 EFP@MNs 具有强大的抗肿瘤效果，这可能归因于脂肪自噬驱动的铁死亡疗法。

此外，为了初步评估肿瘤-bearing 小鼠的免疫系统激活状态，测量并分析了解剖脾脏的重量，脾脏是主要的免疫器官（图 6c）。与健康小鼠相比，控制组发现脾脏显著肿胀，暗示抗肿瘤免疫受到抑制。然而，EFP@MNs 的治疗被验证能够减轻脾脏重量的增加，表明免疫功能得到了正常化。这个结果激励我们进一步研究 EFP@MNs 的免疫调节作用。此外，体重稳步增加、可忽略的器官毒性和良好的血液检查结果共同证明了 EFP@MNs 的良好生物相容性（图 6d 和 e，图 S37 和图 S38）。

然后，肿瘤被切片并染色以进行病理分析。如图 6f 所示，与对照组相比，EFP@MNs 组的肿瘤显示出最高的肿瘤组织损伤水平和最稀疏的肿瘤细胞密度。类似地，TUNEL 染色也得出了类似的结论，EFP@MNs 治疗对肿瘤造成了显著损伤（图 S39）。此外，脂肪自噬的进展通过油红染色和 LC3 染色进行评估。油红是脂质滴的特定染料，而 LC3 则指示自噬水平。如所示，EFP@MNs 组观察到了明显的脂质滴减少和自噬激活，这证明了脂肪自噬的发生（图 6 g 和 h）。此外，BODIPY 493/505 探针，一种特定的脂质滴染色染料，也被用来检测脂质滴的变化。如图 6i 所示，显著的脂质滴减少被揭示，表明脂肪自噬的激活。然后，检测了 GPX4 的表达水平以估计铁死亡过程（图 6j）。正如预期的那样，GPX4 明显下降。

图 6. EFP@MNs 的体内抗肿瘤效率。a) 体内抗肿瘤效率测定过程的示意图。b) 不同处理后小鼠的肿瘤体积增长。c) 不同处理后小鼠的脾脏重量。d) 不同处理后小鼠的器官系数。e) 不同处理后小鼠的体重曲线。f) H&E 染色，g) 油红染色，h) LC3 染色，i) Bodipy 493/505 染色和 j) GPX4 染色的不同处理小鼠肿瘤。比例尺： 200 μ m 200 μ m 200 mum200 \mu \mathrm{~m} 为 f − h , 300 μ m f − h , 300 μ m f-h,300 mum\mathrm{f}-\mathrm{h}, 300 \mu \mathrm{~m} 为 i − j i − j i-j\mathrm{i}-\mathrm{j} 。使用 ANOVA 或 t t tt -检验来确定数据之间是否存在显著差异。 P P PP 值样式： ∗ p < 0.05 ; ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 ∗ p < 0.05 ; ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 ^(**)p < 0.05;^(****)p < 0.01;^(******)p < 0.005;^(********)p < 0.001{ }^{*} p<0.05 ;{ }^{* *} p<0.01 ;{ }^{* * *} p<0.005 ;{ }^{* * * *} p<0.001 。 （有关本图例中颜色引用的解释，请参阅本文的网络版本。）

EFP@MNs 治疗，表明有效的铁死亡是由 EFP@MNs 引起的。根据上述结果，可以推断出强效的脂肪自噬驱动的铁死亡疗法是由 EFP@MNs 治疗诱导的，这可能伴随着有效的免疫调节。上述结果共同表明，所提出的 EFP@MNs 能够通过诱导脂肪自噬来打破 FFA 水平不足的瓶颈，并通过 MNs 给药提高经皮药物递送效率。因此，在黑色素瘤模型中增强的铁死亡诱导效率在体外和体内得到了揭示。


2.6. EFP@MNs 表现出光敏性能以促进肿瘤消除


MPN 结构已被广泛用作各种基于光的肿瘤治疗方法的光敏材料，例如光动力疗法（PDT）或 PTT。在 PTT 的情况下，当暴露于近红外（NIR）辐射时，MPN 结构可以有效地将光能转化为热能，以精确消除肿瘤细胞（图 7a）。值得注意的是，通过 PTT 消灭肿瘤细胞会导致免疫原性细胞死亡（ICD），这有望协同促进铁死亡。

免疫疗法[29,37]。在这项研究中，我们基于 MPN 结构开发了“全能”EFP 纳米胶囊，具有有效光热治疗的巨大潜力。因此，进行了全面评估，以评估所提议的 EFP@MNs 在光热治疗效果方面的表现。

首先，评估了纳米胶囊悬浮液的光热效应（图 7b 和 c）。EF 和 EFP 纳米胶囊表现出所需的光热效应，温度在 10 分钟内升高到超过 42 ∘ C 42 ∘ C 42^(@)C42{ }^{\circ} \mathrm{C} ，满足肿瘤光热治疗的要求。相比之下，FP 组没有明显的温度变化，表明光热效应归因于 MPN 结构。然后，在不同功率下，确定了 EFP@MNs 在近红外照射下的温度升高（图 7d 和 e）。显示出可调的光热效应，温度在较低功率下在 2 分钟内迅速升高到超过 42 ∘ C 42 ∘ C 42^(@)C42^{\circ} \mathrm{C} 。此外，评估了 EFP@MNs 在 B16 肿瘤小鼠中的体内光热治疗效果（图 7f 和 g）。如图所示，肿瘤病灶成功诱导了强烈的高温，展示了施加光热治疗以消除肿瘤的巨大潜力。此外，EFP@MNs 在五次激光开/关循环后的光热效应仍然在 5 分钟内将温度升高到 58 ∘ C 58 ∘ C 58^(@)C58{ }^{\circ} \mathrm{C} ，显示出优异的光热稳定性，并证明其在多次治疗中的潜力（图 7h）。

图 7. EFP@MNs 在近红外下的光敏性能和抗肿瘤效率。a) EFP@MNs 在近红外下的示意图。b) 光热加热图像和 c) EFP 纳米胶囊悬浮液的曲线。d) 体外光热加热图像和 e) 不同功率下 EFP@MNs 在近红外下的曲线。f) 体内光热加热图像和 g) EFP@MNs 插入肿瘤小鼠后的曲线。h) EFP@MNs 在五个近红外开/关循环中的加热曲线。i) 体内抗肿瘤效率测定过程的示意图。j) 不同处理后小鼠的肿瘤体积增长。使用 ANOVA 或 t t tt -检验来确定数据之间是否存在显著差异。 P P PP 值样式: ∗ p < 0.05 ; ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 ∗ p < 0.05 ; ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.005 ; ∗ ∗ ∗ ∗ p < 0.001 ^(**)p < 0.05;****p < 0.01;******p < 0.005;********p < 0.001{ }^{*} p<0.05 ; * * p<0.01 ; * * * p<0.005 ; * * * * p<0.001 。

总结，所提议的 EFP@MNs 可以作为 PTT 平台，以辅助铁死亡介导的多模式治疗。

根据上述结果，EFP@MNs 与 NIR 照射结合可能显著促进肿瘤消除。因此，在 B16 肿瘤小鼠模型中比较了 EFP@MNs 和 EFP@MNs/NIR 的抗肿瘤效果（图 7i）。在本实验中，初始肿瘤体积为 200 mm 3 200 mm 3 200mm^(3)200 \mathrm{~mm}^{3} ，在第 1 天和第 3 天施用了两个微针贴片。令人鼓舞的是，EFP@MNs/NIR 组的抗肿瘤效果显著优于 EFP@MNs 组，肿瘤体积增长最慢，肿瘤重量最小（图 7j，图 S40 和图 S41）。此外，EFP@MNs 与 NIR 结合也显示出良好的生物相容性，体现在小鼠体重变化、可忽略的主要器官毒性和良好的血液检查结果（图 S42-44）。因此，可以得出结论，EFP@MNs 与 NIR 结合可以发挥更有效的抗肿瘤效果。接下来，将分析和讨论其潜在机制。


2.7. EFP@MNs/NIR 调节时间以增强肿瘤治疗


已经证明，由 EFP@MNs 触发的脂肪自噬驱动的铁死亡疗法具有增强肿瘤细胞死亡的能力。先前的研究还揭示了它在促进树突状细胞成熟和 M1-TAM 极化方面的潜力，这两者都是

因其对抗肿瘤免疫的积极贡献而受到认可。通过用 EFP 处理的 B16 细胞的细胞培养基处理 RAW264.7 细胞，验证了 EFP 纳米胶囊的 TAM 极化潜力（图 S45）。结果显示，M1 型巨噬细胞的比例从 4.18 % 4.18 % 4.18%4.18 \% 提高到 25 % 25 % 25%25 \% ，表明极化显著增加了 5.7 倍。同样，DCs 的成熟水平也以类似方式检测（图 S46）。结果表明，成熟 DCs 的比例显著从 5.56 % 5.56 % 5.56%5.56 \% 提高到 9.91 % 9.91 % 9.91%9.91 \% ，表明铁死亡/免疫治疗的可行性。此外，当与 NIR 照射结合时，EFP@MNs 强烈诱导了 ICD 并释放了大量肿瘤抗原。因此，提出 EFP@MNs/NIR 的结合有效调节了肿瘤微环境并激活了抗肿瘤免疫，最终增强了肿瘤消除的疗效。

因此，利用不同治疗中肿瘤组织中 DC 的成熟和 TAM 极化。正如图 8a 和 b 所示，EFP@MNs 和 EFP@MNs/NIR 组中 CD 8 + CD 8 + CD_(8)^(+)\mathrm{CD}_{8}{ }^{+} CD86 + + ^(+){ }^{+} 细胞（成熟 DC）的比例显著增加，表明肿瘤抗原呈递能力增强。有趣的是，仅使用 EFP@MNs 而不使用 NIR 也能触发 DC 的成熟，证明了铁死亡治疗的 TIME 调节能力。此外，EFP@MNs 治疗（无论是否使用 NIR）后，整体 TAM 细胞比例和 M1-TAM 极化水平显著提高（图 8c-f）。TAM 表型的重塑可能





< 0.005 < 0.005 < 0.005<0.005; ****p < 0.001 < 0.001 < 0.001<0.001.

有效缓解肿瘤微环境，并将肿瘤从“冷”转变为“热”。然后，测量了 T 细胞渗透到肿瘤床的情况。如图 8g-k 所示，整体 T 细胞、CD4 + T + T ^(+)T{ }^{+} \mathrm{T} 细胞和细胞毒性 CD8 + T + T ^(+)T{ }^{+} \mathrm{T} 细胞在 EFP@MNs/NIR 治疗下被吸引到肿瘤病灶，表明激活了抗肿瘤免疫。与 EFP@MNs 组相比，EFP@MNs/NIR 能够诱导更强的抗肿瘤免疫，标志着 T 细胞水平的提升，证明了 PTT 引起的免疫细胞死亡效应。总之，EFP@MNs/NIR 能够调节肿瘤微环境并激活抗肿瘤免疫反应。

然后，对肿瘤的病理分析进行了进一步讨论抗肿瘤机制。如图 81 所示，EFP@MNs 和 EFP@MNs/NIR 组的肿瘤组织破坏通过 HE 染色显示出来。此外，触发的铁死亡通过 GPX4 的减少（图 8m）表示，而激活的脂肪自噬则通过

上调的 LC3 表达（图 8n）。这些结果表明了由 EFP@MNs 介导的脂肪自噬驱动的铁死亡治疗。此外，通过免疫荧光染色进一步分析了肿瘤组织中的免疫细胞浸润（图 8o-p）。在 EFP@MNs 和 EFP@MNs/NIR 组中观察到肿瘤中 CD3 + + ^(+){ }^{+} 细胞（T 细胞）和 CD11c + + ^(+){ }^{+} 细胞（树突状细胞）的积累，这与之前的结果一致。总之，“一体化”EFP@MNs/NIR 作为一种强大的多模态肿瘤治疗平台，通过脂肪自噬驱动策略。


2.8. EFP@MNs/NIR 促进肿瘤消除与 α α alpha\alpha PD-L1 结合


根据上述结果，EFP@MNs/NIR 将显著调节时间，激活抗肿瘤免疫并

增强铁死亡介导的多模式治疗。因此，EFP@MNs/NIR 与 α α alpha\alpha PD-L1（经典免疫检查点抑制剂）联合给药，以研究其是否能改善抗肿瘤效果（图 9a）。初步肿瘤体积为 150 mm 3 150 mm 3 150mm^(3)150 \mathrm{~mm}^{3} ，在第 1 天和第 3 天施用两个微针贴片。如图 9b 和 c 所示，单独使用 α α alpha\alpha PD-L1 的肿瘤抑制效果微乎其微，表明肿瘤对其的敏感性不足。然而，当与 EFP@MNs/NIR 治疗结合时，几乎所有（5 只中的 4 只）肿瘤携带小鼠实现了完全缓解，且没有记录到任何肿瘤体积；这一结果也超过了 EFP@MN/NIR 组的观察结果。此外，获得了类似的结果。

来自肿瘤重量的测量（图 S47）。此外，所有组别都显示出高生物相容性，体现在小鼠体重变化、可忽略的主要器官毒性和良好的血液检查（图 S48-50）。上述令人鼓舞的现象验证了 EFP@MNs/NIR 可以作为一种有前景的抗肿瘤平台，辅助免疫检查点抑制剂的治疗。

然后，肿瘤免疫微环境进行了系统研究。发现整体免疫细胞（CD45 + + ^(+){ }^{+} 细胞）的百分比通过 EFP@MNs/NIR 和 α α alpha\alpha PD-L1 联合给药显著提高，表明激活了抗肿瘤免疫反应（图 9d）。有趣的是， α α alpha\alpha PD-L1 单独使用并未引起明显的





< 0.001 < 0.001 < 0.001<0.001.

对 DCs 成熟的影响，而在 EFP@MNs/NIR 处理组中，无论是否有 α α alpha\alpha PDL1，均显示出明显的 DCs 成熟（图 S51 和图 9e）。关于 TAM 极化也有类似现象，EFP@MNs/NIR 诱导了 M1TAM 表型水平的显著改善，而单独使用 α α alpha\alpha PD-L1 则没有（图 S52 和图 9f 及图 9g）。这些发现共同支持了假设，即 EFP@MNs/NIR 介导的脂肪自噬驱动的铁死亡/免疫调节协同作用有助于 TIME 的改善，其特征是 DCs 成熟和 M1-TAM 极化，从而促进 α PD − L 1 α PD − L 1 alphaPD-L1\alpha \mathrm{PD}-\mathrm{L} 1 在抗肿瘤反应中的疗效。然后，评估了肿瘤床中的 T 细胞浸润（图 S53 和图 S54 及图 9h-j）。在 EFP@MNs/NIR + α α alpha\alpha PD-L1 组中诱导了最高的 T 细胞水平，表明增强了肿瘤细胞的杀伤效果。此外，EFP@MNs/NIR 的免疫调节功能与 α PD α PD alphaPD\alpha \mathrm{PD} -L1 的 PD-L1 抑制活性的组合效应显著促进了该组整体 T 细胞群体中 CD 4 + CD 4 + CD4^(+)\mathrm{CD} 4^{+} 和 CD 8 + T CD 8 + T CD8^(+)T\mathrm{CD8}^{+} \mathrm{T} 细胞的比例。 这些发现表明，增强的免疫反应有助于在 EFP@MNs/NIR + α α alpha\alpha PD-L1 组中改善肿瘤清除。此外，测量脾脏中的 T 细胞以评估全身免疫的激活。如图 S55 和图 S56 所示，接受 EFP@MNs/NIR 和 α α alpha\alpha PD-L1 治疗的小鼠脾脏中的整体 T 细胞比例得到了提升，这意味着抗肿瘤免疫不仅在肿瘤病灶中重塑，也在脾脏中重塑。此外，表型分析显示 EFP@MNs/NIR + aPD-L1 组中 CD + CD + CD^(+)\mathrm{CD}^{+} 细胞的比例显著增强，从而证明了激活的系统性抗肿瘤免疫反应（图 S57 和图 9k）。总之，EFP@MNs/NIR + α α alpha\alpha PD-L1 治疗诱导了强大的抗肿瘤免疫，从而促进了肿瘤清除效率。

综合上述结果，提出的 EFP@MNs 通过诱导脂肪自噬和促进脂质过氧化物（LPO）产生，增强了铁死亡诱导效果，提高了肿瘤抑制效率。基于这些令人鼓舞的结果，当与近红外（NIR）照射和免疫检查点抑制剂 α α alpha\alpha PD-L1 结合时，EFP@MNs 更有效地杀死肿瘤细胞，展现出理想的肿瘤微环境（TIME）调节能力，并最终显示出令人满意的肿瘤消除效果。TIME 调节能力还暗示提出的 EFP@MNs 可能通过激活抗肿瘤免疫来抑制黑色素瘤的扩散。在未来的研究中，建立一个远程肿瘤模型以进一步评估抗肿瘤能力是至关重要的。

 3. 结论


总之，“一体化”EFP@MNs 被提议作为一种多功能黑色素瘤治疗平台。通过干扰代谢，体外和体内研究表明，EFP 纳米胶囊激活脂肪自噬并促进细胞内 FFA 释放，从而促进 LPO 产生和铁死亡。此外，当与近红外照射结合时，EFP@MNs 的 TIME 重塑效果得到了增强。通过重塑 TIME，所提议的 EFP@MNs 可以增强 α α alpha\alpha PD-L1 的抗肿瘤效率，同时促进铁死亡介导的多模态治疗。该平台为肿瘤铁死亡介导的多模态治疗提供了新的视角，并突显了以脂肪自噬为动力的策略的重大潜力，这将成为临床上强有力的抗肿瘤策略。


3.1. 实验部分

 3.1.1. 材料


EGCG 购自能源化学（上海，中国），葡萄糖酸亚铁（FG）购自麦克林生化有限公司（上海，中国）。PEITC 购自 J&K 科学（北京，中国）。RPMI 1640 培养基、PBS 和 0.25% EDTA-胰蛋白酶由赛默飞（上海，中国）提供。Hoechst 33342，JC-1，

细胞内 ATP 含量测定试剂盒、GPX4 活性测定试剂盒和 LysoTracker Red 购自贝奥泰姆生物科技（上海，中国）。DAPI 和 DCFH-DA 购自索拉生物生命科学（北京，中国）。MDA 水平测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（南京，中国）。C11 BODPIY 581/591 和 BODPIY 505/515 购自 GLPBIO（加利福尼亚，美国）。FFA 含量测定试剂盒由北京博克生物科技有限公司提供（北京，中国）。MDC 探针购自凯基恩生物科技（南京，中国）。CheKine TM TM ^(TM){ }^{\mathrm{TM}} 乳酸测试试剂盒由 Abbkine 提供（武汉，中国）。

 3.1.2. 细胞和动物


B16 细胞是从普罗赛尔（中国武汉）购买的。C57BL/6 小鼠（3-5 周龄）是从广东省医学实验动物中心获得的。所有动物实验均按照中山大学动物护理与使用委员会的实验动物指南进行（SYSU-IACUC-2023-001907）。


3.1.3. EFP 纳米胶囊的制备与表征


EFP 纳米胶囊是通过简单的一锅法制备的。简而言之，PEITC 溶解在 2 M 的乙醇中，而 EGCG 溶解在 4 mM 的蒸馏水中。然后，将 PEITC 溶液与 EGCG 溶液以 1:1000 的体积比混合，并进行超声处理。最后，将 10 mg / mL 10 mg / mL 10mg//mL10 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} 的 FG 溶液在搅拌下以 1:100 的体积比逐滴加入 PEITC/EGCG 混合溶液中。该体系进一步搅拌 12 小时以获得 EFP 纳米胶囊。纳米胶囊的粒径和ζ电位通过 Malvern Mastersizer 2000（Malvern Instruments Ltd.，英国）测量。纳米胶囊通过 FTIR 光谱仪（UATR Two，PerkinElmer，Waltham，MD）进行 FTIR 分析，而紫外-可见光谱则由紫外光谱仪（TU-1901，普金杰通用仪器有限公司，北京，中国）记录。


3.1.4. 自组装机制测定


在成功建立 EFP 纳米胶囊后，初步研究了自组装机制。首先，向 EFP 悬浮液中添加了不同的相互作用力消除剂 EDTA、 NaCl , SDS NaCl , SDS NaCl,SDS\mathrm{NaCl}, \mathrm{SDS} 和尿素，并监测外观变化。然后，进行了分子动力学模拟，以模拟 EGCG、PEITC 和 Fe 2 + Fe 2 + Fe^(2+)\mathrm{Fe}^{2+} 的组装性能。分子动力学模拟使用 Gromacs 2019.4 软件包进行[38,39]。对 PETIC 和 EGCG 使用了一般 Amber 力场参数和 RESP 电荷。TIP3P 水模型用于水分子[39-41]。力场参数通过 SobTop 软件生成。PEITC 的分子数为 20，EGCG 为 80， Fe 2 + Fe 2 + Fe^(2+)\mathrm{Fe}^{2+} 为 80，水为 8529。为了获得电解质的结构，首先在 298 K 下进行 200 ns 的 NPT 运行，以获得平衡自组装结构。使用 VMD 软件[42]可视化结构。


3.1.5. 体外细胞毒性测定


B16 细胞以每孔 1.2 × 10 4 1.2 × 10 4 1.2 xx10^(4)1.2 \times 10^{4} 的密度接种在 96 孔板中，培养 24 小时。然后，细胞在不同浓度下处理不同的纳米胶囊。再经过 24 小时后，通过 CCK8 法检测细胞活力。


3.1.6. 细胞死亡形式确认


为了研究 EFP 纳米胶囊诱导的特定细胞死亡通路，使用了不同的细胞死亡通路抑制剂，包括 Fer-1（铁死亡抑制剂， 2 μ M 2 μ M 2muM2 \mu \mathrm{M} ）、DFO（铁死亡抑制剂， 200 μ M 200 μ M 200 muM200 \mu \mathrm{M} ）、NAC（抗氧化剂，5 mM）、Z - VAD-FMK（凋亡抑制剂， 12.5 μ M 12.5 μ M 12.5 muM12.5 \mu \mathrm{M} ）、3-MA（自噬抑制剂， 12.5 μ M 12.5 μ M 12.5 muM12.5 \mu \mathrm{M} ）和 Necrostatin-1（坏死抑制剂， 40 μ M 40 μ M 40 muM40 \mu \mathrm{M} ），与 EFP 纳米胶囊结合使用，通过 CCK8 法测量细胞活力。


3.1.7. GPX4 活性和 MDA 水平测定


为了研究纳米胶囊处理细胞中的 GPX4 活性和 MDA 水平，将 B16 细胞以每孔 6 × 10 5 × 10 5 xx10^(5)\times 10^{5} 的密度接种在 6 孔板中，并培养 24 小时。然后，分别用 60 μ M 60 μ M 60 muM60 \mu \mathrm{M} EFP、EF 和 FP 纳米胶囊处理细胞 24 小时。接着，用 PBS 洗涤细胞三次并完全裂解。通过在 4 ∘ C , 12000 g 4 ∘ C , 12000 g 4^(@)C,12000g4^{\circ} \mathrm{C}, 12000 \mathrm{~g} 下离心 10 分钟获得细胞裂解液。然后，按照 GPX4 活性检测试剂盒（贝优特生物科技，上海，中国）和 MDA 水平检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京，中国）的说明，分别测定细胞内的 GPX4 活性和 MDA 水平。

细胞内 ROS 和 LPO 水平测定 B16 细胞以每孔 6 × 10 5 6 × 10 5 6xx10^(5)6 \times 10^{5} 的密度接种在 6 孔板中，培养 24 小时。然后，细胞分别用 60 μ M 60 μ M 60 muM60 \mu \mathrm{M} EFP、EF 和 FP 纳米胶囊处理 24 小时。随后，细胞用冷 PBS 轻轻洗涤三次，并在 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 下用 DCFH-DA（ROS 检测）或 C11-BODIPY（LPO 检测）探针染色。染色 30 分钟后，收集细胞并进行流式细胞术（CytoFLEX S，Beckmann）。


3.1.8. 细胞透射电子显微镜形态分析


B16 细胞在 5 厘米的细胞培养皿中接种（每皿 1 × 10 6 1 × 10 6 1xx10^(6)1 \times 10^{6} ），培养 24 小时。然后，细胞分别用 60 μ M 60 μ M 60 muM60 \mu \mathrm{M} EFP、EF 和 FP 纳米胶囊处理 24 小时。接着，细胞被轻轻洗涤和收集，然后用 2.5 % 2.5 % 2.5%2.5 \% 戊二醛固定。样品被送往生物透射电子显微镜（Bio-TEM）（HT7800/ HT7700，日立，东京，日本）。


3.1.9. 细胞表面形态学检测


为了研究 B16 细胞的细胞表面形态，采用了原子力显微镜（AFM）。简而言之，B16 细胞被接种在一个 5 厘米的细胞培养皿中（每皿 1 × 10 6 1 × 10 6 1xx10^(6)1 \times 10^{6} ），并培养 24 小时。然后，细胞分别用 60 μ M 60 μ M 60 muM60 \mu \mathrm{M} EFP、EF 和 FP 纳米胶囊处理另 24 小时。随后，细胞用 PBS 仔细洗涤三次，然后用 2.5 % 2.5 % 2.5%2.5 \% 戊二醛固定。多余的戊二醛用蒸馏水仔细洗涤，并自然干燥过夜。AFM 图像是在室温下使用 Dimension Fastscan AFM 设备（布鲁克公司，德国）以峰值力敲击模式获得的。


3.1.10. 细胞内 LDs 数量测定


细胞内 LDs 通过特定探针 Bodipy 505/515 被检测到。简而言之，B16 细胞被接种在一个 20 毫米玻璃底细胞培养皿中（每皿 6 × 10 5 6 × 10 5 6xx10^(5)6 \times 10^{5} ），并培养过夜。然后，细胞用 40 μ MEFP 40 μ MEFP 40 muMEFP40 \mu \mathrm{MEFP} 、EF 和 FP 纳米胶囊处理 24 小时。细胞在 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 下用 BODPIY 505/515 染色 20 分钟。细胞通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察和成像。


3.1.11. 细胞内 FFA 水平测量


为了确定细胞内 FFA 水平，将 B16 细胞接种在 10 厘米的细胞培养皿中（每皿 3 × 10 6 3 × 10 6 3xx10^(6)3 \times 10^{6} ），并用 40 μ MEFP 40 μ MEFP 40 muMEFP40 \mu \mathrm{MEFP} 、EF 和 FP 纳米胶囊处理 24 小时。然后，用 PBS 洗涤细胞并收集以进行检测。FFA 水平按照 FFA 含量测定试剂盒（北京博克生物科技有限公司，北京，中国）的说明进行测定。

 3.1.12. 西方印迹法


采用西方印迹法分析特定蛋白质的表达水平。简而言之，将 B16 细胞以每孔 6 × 10 5 6 × 10 5 6xx10^(5)6 \times 10^{5} 的密度接种在 6 孔板中，培养 24 小时。然后，用 40 μ M 40 μ M 40 muM40 \mu \mathrm{M} EFP、EF 和 FP 纳米胶囊处理细胞 24 小时。接着，用 PBS 洗涤细胞三次并完全裂解。将细胞裂解液在 4 ∘ C , 12000 g 4 ∘ C , 12000 g 4^(@)C,12000g4^{\circ} \mathrm{C}, 12000 \mathrm{~g} 离心 10 分钟以获得细胞蛋白。然后，将细胞蛋白进行西方印迹分析。


3.1.13. EFP@MNs 的制备


EFP@MNs 是通过三步离心法制备的，HA 作为针头材料，PVP K90 作为基材。简而言之，EFP 纳米胶囊悬浮液与 HA 溶液（ 450 mg / mL 450 mg / mL 450mg//mL450 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} ）以 3:1 的体积比混合。然后，将 EFP/HA 混合溶液在 4 ∘ C 4 ∘ C 4^(@)C4^{\circ} \mathrm{C} 下以 4000 rpm 的速度离心 5 分钟填充到 PDMS 母模中。随后，去除多余的 EFP/HA 混合物。接着，填充好的母模再离心 30 分钟，以将 EFP/HA 推至针尖。经过过夜干燥后，重复该过程。然后，HA 溶液通过相同的离心法被离心到母模中。去除多余的 HA 溶液后，PVP K90 溶液（31.25%）通过离心填充到母模中以去除气泡。最后，在脱模前需要进行 48 小时的干燥过程。


3.1.14. EFP@MNs 的表征


所制备的 EFP@MNs 的机械强度通过纹理分析仪（TA.XT Plus，Stable Micro Systems）进行测量。此外，采用 Parafilm 渗透法检测 EFP@MNs 的渗透效率。EFP@MNs 被施加于大鼠腹部皮肤，并进行 H&E 染色以检测皮肤渗透效率。EFP@MNs 的三维形态通过层层扫描的共聚焦显微镜（CLSM）进行评估。


3.1.15. EFP@MNs 的体内分布


所有动物实验均按照中山大学实验动物伦理委员会的实验动物指南进行（SYSU-IACUC-2023-001907）。为了检测 EFP@MNs 的体内分布，建立了 B16 肿瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到 400 mm 3 400 mm 3 400mm^(3)400 \mathrm{~mm}^{3} 时，将包裹有 DID 探针的 EFP@MNs 施用到肿瘤部位，并使用活体成像系统（IVIS Lumina Series III，PerkinElmer Inc.，德国）在不同时间点监测荧光信号。


3.1.16. EFP@MNs 的体内抗肿瘤效果


为了评估 EFP@MNs 的抗肿瘤效率，建立了 B16 肿瘤小鼠模型。为了比较不同 MNs 的抗肿瘤效率，使用了 20 只 B16 肿瘤小鼠，并在肿瘤体积达到 150 mm 3 ( n = 5 ) mm 3 ( n = 5 ) mm^(3)(n=5)\mathrm{mm}^{3}(n=5) 时将其分为四组：对照组、FP@MNs 组、EF@MNs 组和 EFP@MNs 组。小鼠在第 2 天和第 6 天接受不同 MNs 的治疗，并每 2 天监测一次肿瘤体积。然后，在第 10 天处死小鼠，切除肿瘤，切片并用 H&E、油红、LC3、BODIPY 493/505 和 GPX4 染色。为了评估光热辅助 EFP@MNs 在肿瘤消融中的效率，肿瘤小鼠在肿瘤体积达到 200 mm 3 ( n = 5 ) mm 3 ( n = 5 ) mm^(3)(n=5)\mathrm{mm}^{3}(n=5) 时被分为三组：对照组、EFP@MNs 组和 EFP@MNs/NIR 组。小鼠在第 1 天和第 3 天接受 EFP@MNs 的治疗，是否使用 NIR。肿瘤体积每 2 天监测并记录一次。在第 8 天，处死小鼠。切除肿瘤并称重。然后，将切除的肿瘤切片进行 H&E、GPX4、LC3、CD3 和 CD11c 染色。此外，将肿瘤匀浆化以制备单细胞悬液以进行进一步的淋巴细胞分析。 为了评估 EFP@MNs 与 α α alpha\alpha PD-L1 联合使用的抗肿瘤效果，当肿瘤体积达到 150 mm 3 150 mm 3 150mm^(3)150 \mathrm{~mm}^{3} （ n n nn = 5 = 5 =5=5 ）时，肿瘤-bearing 小鼠被分为四组：对照组、EFP@MNs/NIR 组、 α α alpha\alpha PD-L1 组和 EFP@MNs/NIR + α α alpha\alpha PD-L1 组。小鼠在第 1 天和第 3 天接受 EFP@MNs 治疗， α PD α PD alphaPD\alpha \mathrm{PD} L1 在第 2 天和第 4 天通过腹腔给药。肿瘤体积每 2 天监测和记录一次。小鼠在第 8 天被处死，肿瘤被切除并切片进行分析。




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    •  通讯作者。

      ** 通讯作者：中国广州市 511443，济南大学药学院。


      https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2024.07.063


      2024 年 7 月 31 日在线可用

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