1.目的 1.1 掌握PCR的原理和操作 1.2 掌握碱裂解提取质粒的方法 1.3 了解紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理和方法 1.4 进行水平琼脂糖凝胶电泳操作
2.原理 2.1 聚合酶链反应 PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在 DNA 聚合酶的催化下，以 DNA 为模板，以特异性引物为起点，通过变性、退火、延伸等步骤在体外进行 DNA 复制的过程。 图 1 PCR 的原理
2.2.1 碱裂法 根据染色体 DNA 和质粒 DNA 的变性和复性差异，染色体 DNA 和质粒 DNA 在高碱性条件下都会变性，但仍有一些未解析的质粒 DNA 链来帮助质粒 DNA 复性。当用高盐缓冲液将 pH 值调节为中性时，变性质粒 DNA 变性并储存在溶液中，离心去除因无法变性的染色体 DNA 缠结而形成的网状结构。
2.2.2 离心柱 硅基质膜在高盐、低 pH 值的状态下选择性结合溶液中的 DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质。在提取过程中，通过蛋白溶液和漂洗液去除杂质和其他细菌成分，然后在低盐、高 pH 值的洗脱缓冲液中从硅基质膜中洗脱出纯质粒 DNA。
2.3 紫外吸收法定量检测 2.3.1 物质在光的照射下会产生光的吸收作用，物质对光的吸收是选择性的。各种不同的物质都有自己的吸收光谱。 2.3.2 当不同波长的单色光通过溶液时，其光能会不同程度地被吸收。光能吸收的程度与物质的浓度成正比。 2.3.3 由于构成核酸的碱基 （
G
,
A
,
T
,
C
G
,
A
,
T
,
C
G,A,T,C \mathrm{G}, \mathrm{A}, \mathrm{T}, \mathrm{C} 2.3.4 260 nm为核酸最高吸收峰的吸收波长;230 nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，该比率可用于评估核酸样品的纯度（表 1）。
率
(
A
260
/
A
280
)
A
260
/
A
280
(A_(260)//A_(280)) \left(\mathrm{A}_{260} / \mathrm{A}_{280}\right) 核酸样品的纯度
1.7
∼
1.9
1.7
∼
1.9
1.7∼1.9 1.7 \sim 1.9 DNA 样品纯度较高，符合实验要求
>
1.9
>
1.9
> 1.9 >1.9 要求。
<
1.6
<
1.6
< 1.6 <1.6 DNA 样品被 RNA 污染
Ratio (A_(260)//A_(280)) The purity of nucleic acid samples
1.7∼1.9 The DNA sample is relatively pure and meets the experimental
> 1.9 requirements.
< 1.6 The DNA sample is polluted by RNA | Ratio $\left(\mathrm{A}_{260} / \mathrm{A}_{280}\right)$ | The purity of nucleic acid samples |
| :---: | :--- |
| $1.7 \sim 1.9$ | The DNA sample is relatively pure and meets the experimental |
| $>1.9$ | requirements. |
| $<1.6$ | The DNA sample is polluted by RNA |
表 1 核酸样品纯度评价
2.4 DNA 限制性内切酶消化 2.4.1 限制性核酸内切酶是一种能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 2.4.2 不同的质粒DNA具有不同的核苷酸序列，因此其上限制性内切酶消化位点的位置和数量不同，即存在不同的酶消化图谱。 2.4.3 根据质粒限制性图谱，选择合适的限制性内切酶可将质粒切割成线性 DNA （4）。通过鉴定电泳后条带的数量和片段的迁移率，可以通过已知分子量的线性 DNA（Marker）来识别限制性片段的大小，从而可以鉴定质粒。 2.4.4 核酸内切酶 EcoR I 和 Hind III 可以特异性识别提取的质粒 DNA 上的序列和切口：
EcoR I: G
↓
↓
darr \downarrow AATTC, HindIII: A
↓
↓
darr \downarrow AGCTT
2.5 DNA Agarose 凝胶电泳 2.5.1 琼脂糖是一种天然的长链分子，可以形成刚性孔。凝胶的大小取决于琼脂糖的浓度。 2.5.2 DNA分子在碱性环境中带负电，在外电场作用下游到正极 2.5.3 当 DNA 分子在琼脂糖凝胶中游动时，它们具有电荷效应和分子筛效应。不同分子量和构型的不同 DNA 在电泳过程中会具有不同的迁移率，从而区分不同的条带。（迁移速度与分子量的对数成反比。 2.4.4 核酸内切酶 EcoR I 和 Hind III 可以特异性识别提取的质粒 DNA 上的序列和切口：
EcoR I: G
↓
↓
darr \downarrow AATTC, Hind III : A
↓
↓
darr \downarrow AGCTT
2.5 DNA Agarose 凝胶电泳 2.5.1 琼脂糖是一种天然的长链分子，可以形成刚性孔。凝胶的大小取决于琼脂糖的浓度。 2.5.2 DNA分子在碱性环境中带负电，在外电场作用下游到正极 2.5.3 当 DNA 分子在琼脂糖凝胶中游动时，它们具有电荷效应和分子筛效应。不同分子量和构型的不同 DNA 在电泳过程中会具有不同的迁移率，从而区分不同的条带。（迁移速度与分子量的对数成反比。 3. 材料和方法（用流程图说明） 3.1 材料
试剂 装置
PCR
(1)细菌液体（大肠杆菌 DH5a 细菌菌株）
（2） 底漆 ： MJ 迷你）
离心机
正向：5'GTAAAA CGA CGG CCA GT 3' 反向：
5
∘
5
∘
5^(@) 5^{\circ}
3
∘
3
∘
3^(@) 3^{\circ} 微量移液器
（3）
2
×
2
×
2xx 2 \times 灭菌薄离心管
Taq 酶：
5
U
/
μ
L
;
4
X
5
U
/
μ
L
;
4
X
5U//muL;4X 5 \mathrm{U} / \mu \mathrm{L} ; 4 \mathrm{X}
10
mmol
/
L
10
mmol
/
L
10mmol//L 10 \mathrm{mmol} / \mathrm{L}
500
mmol
/
L
KCl
100
mmol
/
L
500
mmol
/
L
KCl
100
mmol
/
L
500mmol//LKCl100mmol//L 500 \mathrm{mmol} / \mathrm{L} \mathrm{KCl} 100 \mathrm{mmol} / \mathrm{L} 凝胶电泳系统
Tris-HCl（pH8.3），25 毫米氯化镁 2 凝胶成像系统
（4） 无菌去离子水
质粒的提取和定量 (1)细菌液体（大肠杆菌 DH5a 细菌菌株） 孵化器
(2)LB 培养基 恒温摇床
离心机
(3)AXYGEN 试剂盒 高压 釜
S1/P1：
50
mmol
/
L
50
mmol
/
L
50mmol//L 50 \mathrm{mmol} / \mathrm{L}
25
mmol
/
L
25
mmol
/
L
25mmol//L 25 \mathrm{mmol} / \mathrm{L} 紫外线分光光度计
Tris-Cl（pH8.0）、
10
mmol
/
L
10
mmol
/
L
10mmol//L 10 \mathrm{mmol} / \mathrm{L} 比色皿
S2/P2：
0.2
mol
/
L
NaOH
,
1
%
0.2
mol
/
L
NaOH
,
1
%
0.2mol//LNaOH,quad1% 0.2 \mathrm{~mol} / \mathrm{L} \mathrm{NaOH}, \quad 1 \%
S3/P3：
60
ml
5
mol
/
L
Na
60
ml
5
mol
/
L
Na
60ml5mol//LNa 60 \mathrm{ml} 5 \mathrm{~mol} / \mathrm{L} \mathrm{Na}
乙酸，28.5 ml 蒸馏水
蛋白质去除溶液 PE （W1）
漂洗液 WB（W2）
淋洗液 EB
限制性内切酶消化 （1） 细菌液（大肠杆菌 DH5a 细菌菌株）; 恒温水浴
（2）
9.0
μ
L
9.0
μ
L
9.0 muL 9.0 \mu \mathrm{~L}
2.0
μ
L
10
XM
2.0
μ
L
10
XM
2.0 muL10XM 2.0 \mu \mathrm{~L} 10 \mathrm{XM}
限制性内切酶缓冲液 （4）（
7.0
μ
L
7.0
μ
L
7.0 muL 7.0 \mu \mathrm{~L}
电泳 500 ng） （5）质粒 DNA （6）
1.0
μ
LHind
1.0
μ
LHind
1.0 muLHind 1.0 \mu \mathrm{LHind}
III（
15
U
/
μ
L
15
U
/
μ
L
15U//muL 15 \mathrm{U} / \mu \mathrm{L}
1.0
μ
L
1.0
μ
L
1.0 muL 1.0 \mu \mathrm{~L}
12
U
/
μ
L
)
12
U
/
μ
L
)
12U//muL) 12 \mathrm{U} / \mu \mathrm{L})
(1)琼脂（琼脂糖 + 琼脂糖素） （2）Gelview （3） 电解质
指示剂（溴酚蓝） （4）
0.5
×
0.5
×
0.5 xx 0.5 \times
上样缓冲液 （6）DNAmarker 5000 （7） 样品
reagents apparatus
PCR (1)Bacteria liquid (E-coli DH5a bacterial strain)
(2) Primer : MJ mini)
Centrifuge
Forward: 5'GTAAAA CGA CGG CCA GT 3' reverse: 5^(@) CAG GAAACA GCT ATG AC 3^(@) Micropipette
(3) 2xx Premix Taq : Sterilized thin centrifugal tube
Taq enzyme: 5U//muL;4X dNTP 10mmol//L each;10 X buffer: 500mmol//LKCl100mmol//L, Gel electrophoresis system
Tris-HCl(pH8.3), 25 mM MgCl 2 Gel imaging system
(4) Sterilized deionized water
Extraction and Quantitation of Plasmid (1)Bacteria liquid (E-coli DH5a bacterial strain) Incubator
(2)LB culture medium Thermostatic shaker
Centrifuge
(3)AXYGEN reagent box Autoclave
S1/P1: 50mmol//L glucose, 25mmol//L U-v spectrophotometer
Tris-Cl(pH8.0), 10mmol//L EDTA(pH8.0), Rnase Cuvette
S2/P2: 0.2mol//LNaOH,quad1% SDS
S3/P3: 60ml5mol//LNa acetate, 11.5 ml Glacial
acetic acid, 28.5 ml Distilled water
Protein-removed solution PE (W1)
Rinsing liquid WB(W2)
Eluent EB
Restriction enzyme digestion (1) Bacteria liquid (E-coli DH5a bacterial strain); Thermostatic water bath
(2) 9.0 muL Sterilized water (3) 2.0 muL10XM
restriction endonuclease buffer (4) 7.0 muL (about
Electrophoresis 500 ng) (5)Plasmid DNA (6) 1.0 muLHind
III( 15U//muL ) (7) 1.0 muL EcoR I ( 12U//muL)
(1)Agar(Agarose + Agaropectin) (2)Gelview (3) Electrolytes
Indicator (Bromophenol blue) (4) 0.5 xx TBE (5) 6 x
loading buffer (6)DNAmarker 5000 (7) Sample | | reagents | apparatus |
| :---: | :---: | :---: |
| PCR | (1)Bacteria liquid (E-coli DH5a bacterial strain) | |
| | (2) Primer : | MJ mini) |
| | | Centrifuge |
| | Forward: 5'GTAAAA CGA CGG CCA GT 3' reverse: $5^{\circ}$ CAG GAAACA GCT ATG AC $3^{\circ}$ | Micropipette |
| | (3) $2 \times$ Premix Taq : | Sterilized thin centrifugal tube |
| | Taq enzyme: $5 \mathrm{U} / \mu \mathrm{L} ; 4 \mathrm{X}$ dNTP $10 \mathrm{mmol} / \mathrm{L}$ each;10 X buffer: $500 \mathrm{mmol} / \mathrm{L} \mathrm{KCl} 100 \mathrm{mmol} / \mathrm{L}$, | Gel electrophoresis system |
| | Tris-HCl(pH8.3), 25 mM MgCl 2 | Gel imaging system |
| | (4) Sterilized deionized water | |
| Extraction and Quantitation of Plasmid | (1)Bacteria liquid (E-coli DH5a bacterial strain) | Incubator |
| | (2)LB culture medium | Thermostatic shaker |
| | | Centrifuge |
| | (3)AXYGEN reagent box | Autoclave |
| | S1/P1: $50 \mathrm{mmol} / \mathrm{L}$ glucose, $25 \mathrm{mmol} / \mathrm{L}$ | U-v spectrophotometer |
| | Tris-Cl(pH8.0), $10 \mathrm{mmol} / \mathrm{L}$ EDTA(pH8.0), Rnase | Cuvette |
| | S2/P2: $0.2 \mathrm{~mol} / \mathrm{L} \mathrm{NaOH}, \quad 1 \%$ SDS | |
| | S3/P3: $60 \mathrm{ml} 5 \mathrm{~mol} / \mathrm{L} \mathrm{Na}$ acetate, 11.5 ml Glacial | |
| | acetic acid, 28.5 ml Distilled water | |
| | Protein-removed solution PE (W1) | |
| | Rinsing liquid WB(W2) | |
| | Eluent EB | |
| Restriction enzyme digestion | (1) Bacteria liquid (E-coli DH5a bacterial strain); | Thermostatic water bath |
| | (2) $9.0 \mu \mathrm{~L}$ Sterilized water (3) $2.0 \mu \mathrm{~L} 10 \mathrm{XM}$ | |
| | | |
| | restriction endonuclease buffer (4) $7.0 \mu \mathrm{~L}$ (about | |
| Electrophoresis | 500 ng) (5)Plasmid DNA (6) $1.0 \mu \mathrm{LHind}$ | |
| | III( $15 \mathrm{U} / \mu \mathrm{L}$ ) (7) $1.0 \mu \mathrm{~L}$ EcoR I ( $12 \mathrm{U} / \mu \mathrm{L})$ | |
| | (1)Agar(Agarose + Agaropectin) (2)Gelview (3) Electrolytes | |
| | Indicator (Bromophenol blue) (4) $0.5 \times$ TBE (5) 6 x | |
| | loading buffer (6)DNAmarker 5000 (7) Sample | |
