这是用户在 2025-6-11 12:20 为 https://app.immersivetranslate.com/pdf-pro/bd47831d-2e41-4835-9b30-9f958d95e257/ 保存的双语快照页面，由 沉浸式翻译 提供双语支持。了解如何保存？

甲状腺素运载蛋白-穿透肽：一种具有高效血脑屏障穿透能力的阿尔茨海默症淀粉样蛋白纤维化强效融合蛋白抑制剂

王颖，刘伟*，孙燕，董晓燕*

引用本文：Bioconjugate Chem. 2024, 35, 419-431
  在线阅读
访问 | 指标与更多文章推荐 | 支持信息
ACCESS | 怔 Metrics & More Article Recommendations | si Supporting Information| ACCESS \| 怔 Metrics & More Article Recommendations | | si Supporting Information | | :--- | :--- | :--- | :--- |

  摘要

设计一种强效的淀粉样蛋白-β（Aβ）抑制剂对阿尔茨海默病（AD）的防治具有关键作用。尽管内源性转甲状腺素蛋白（TTR）被确认为天然抑制剂，但其较弱的抑制能力及血脑屏障（BBB）穿透性限制了其对β淀粉样蛋白聚集的抑制和运输功能。为此，我们通过偶联阳离子细胞穿膜肽（penetratin，Pen）设计出重组 TTR 蛋白——该融合蛋白 TTR-Pen（TP）不仅具有高效 BBB 穿透能力，还显著增强了 Aβ抑制效能。具体而言，蛋白融合使 TP 带正电荷，仅需低浓度（0.5μM）即可强力抑制 Aβ纤维化，而传统 TTR 需高达 8μM 浓度才能达到同等效果。此外，TP 能减轻 Aβ诱导的神经元死亡，在 10μM 浓度下将培养细胞存活率从 52%提升至 89%，并将 AD 线虫寿命从 14 天延长至 18 天。热力学研究表明，富含正电荷的 TP 与 Aβ之间存在广泛的静电相互作用。 值得注意的是，TP 蛋白表现出卓越的血脑屏障穿透性能，其渗透性比 TTR 高出 10 倍，这使得 TP 能够进入阿尔茨海默症患者的大脑，并参与将 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 类物质转运出脑组织的过程。因此，该融合蛋白在阿尔茨海默症治疗药物研发中展现出巨大潜力。

  ■ 引言

阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿、发病机制复杂的神经退行性疾病，已成为 65 岁以上人群中最常见的痴呆类型之一。 1 , 2 1 , 2 ^(1,2){ }^{1,2} AD 的发病率随年龄增长而上升，对全球老年人构成威胁。 3 3 ^(3){ }^{3} 该病主要临床表现为记忆力衰退、进行性认知功能障碍及行为异常。 4 4 ^(4){ }^{4} 大量证据表明，细胞外β淀粉样蛋白（Aβ）沉积是 AD 病程的始发事件，会引发突触损伤、神经元死亡、炎症反应和氧化应激等病理级联反应。 β β beta\beta Aβ纤维化通过破坏细胞膜、激活膜受体、干扰信号转导及扰乱细胞内通路，显著加剧了病理进程。 β β beta\beta 因此，抑制 Aβ纤维化并清除现有 Aβ聚集体成为 AD 治疗的有效策略。 5 , 6 5 , 6 ^(5,6){ }^{5,6}
在药物研发领域，多种靶向 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 的制剂（如小分子化合物、 8 − 10 8 − 10 ^(8-10){ }^{8-10} 多肽、 11 11 ^(11){ }^{11} 蛋白质、 12 , 13 12 , 13 ^(12,13){ }^{12,13} 单克隆抗体、 14 14 ^(14){ }^{14} 金属药物及 15 − 17 15 − 17 ^(15-17){ }^{15-17} 纳米材料 18 − 20 18 − 20 ^(18-20){ }^{18-20} ）已被证实能有效抑制 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 纤维化。最新研究表明，包括转甲状腺素蛋白（TTR）、 21 21 ^(21){ }^{21} 载脂蛋白 E , 22 E , 22 E,^(22)\mathrm{E},^{22} 簇集蛋白、 23 23 ^(23){ }^{23} 以及 BRICHOS 蛋白 24 24 ^(24){ }^{24} 在内的内源性蛋白质可通过调节蛋白质稳态来阻止淀粉样蛋白形成，展现出
潜在的治疗应用价值。这类蛋白质通常能与细胞外液中的 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 物质形成稳定复合物，从而阻止 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 聚集现象 25 25 ^(25){ }^{25} 。
TTR（转甲状腺素蛋白）由人类肝脏和脉络丛产生，主要以由四个相同亚基组成的四聚体形式存在。 21 21 ^(21){ }^{21} 过去三十年的多项生理学和流行病学研究表明，TTR 是脑脊液（CSF）中主要的 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 结合蛋白。 26 26 ^(26){ }^{26} TTR 单体和四聚体均可与 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 物质相互作用，抑制 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 纤维化并减轻细胞毒性。 27 − 29 27 − 29 ^(27-29){ }^{27-29} 此外，通过转基因秀丽隐杆线虫（C. elegans）和小鼠等多种体内 AD 模型实验，已证实 TTR 具有阻断 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 聚集和毒性的能力。 28 , 30 , 31 28 , 30 , 31 ^(28,30,31){ }^{28,30,31} 除作为 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 抑制剂外，TTR 还能作为 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 转运体将有毒的 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 物质从大脑中清除。 27 , 32 27 , 32 ^(27,32){ }^{27,32} 但 TTR 穿越血脑屏障（BBB）的能力是单向的，无法从外周血液进入大脑。 33 , 34 33 , 34 ^(33,34){ }^{33,34} 此外，大脑中内源性 TTR 的浓度过低，不足以抑制...

图式 1. TP 设计示意图：增强型 β β beta\boldsymbol{\beta} 抑制与血脑屏障穿透功能

图 1. TTR 与 TP 蛋白表征。(A)粒径分布，(B)Zeta 电位，(C)色氨酸荧光，(D)ANS 荧光，(E)圆二色谱，(F)TTR 与 TP 的二级结构含量。两种蛋白浓度均为 1 mg/mL。
在阿尔茨海默病(AD)进程中转运过量的β淀粉样蛋白(Aβ)。因此本研究提出通过补充外源性 TTR 来抑制并转运 Aβ以延缓 AD 进展。但重组 TTR 无法穿透血脑屏障(BBB)。为赋予 TTR 跨 BBB 能力，通过将 TTR 与阳离子细胞穿膜肽 Pen 融合，设计了 Aβ抑制剂(TTR-Pen, TP)。
相较于 TTR，带正电荷的 TP 因广泛的静电相互作用具有更高抑制效率。TP 能通过抑制 Aβ纤维化缓解聚集诱导的神经元毒性，并延长 AD 线虫寿命(示意图 1)。重要的是，Pen 能增强 TP 的血脑屏障渗透性，促进有毒 Aβ物种从脑部向外周血液的转运。
因此，这项研究为设计具有血脑屏障穿透能力的融合蛋白抑制剂以对抗阿尔茨海默病提供了深刻见解。

- 结果与讨论

TTR 与 TP 的特性表征。基于 TTR 和 TP 的氨基酸序列（图 S1A 和 S1B），分别构建了 pCold II-TTR 和 pCold II-TP 质粒。TTR 和 TP 在大肠杆菌 BL21 中表达，并通过亲和层析纯化。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和尺寸排阻色谱（SEC）测定 TTR 和 TP 的分子量。在变性条件下——
在变性条件下，TTR 和 TP 分别在 17.0 kDa 和 19.0 kDa 处显示单一条带（图 S1C），对应 TTR 和 TP 单体。此外，在非变性条件下观察到 TTR 和 TP 在 43 kDa 和 50 kDa 附近的微弱条带，可归因于 TTR 和 TP 二聚体，该结果与文献报道一致。 38 38 ^(38){ }^{38} 尺寸排阻色谱（SEC）分析显示，标准蛋白牛血清白蛋白（BSA）（66.6 kDa）和溶菌酶（14.5 kDa）的洗脱峰分别出现在 9.4 分钟和 19.8 分钟（图 S2A）。据此计算出 TTR 在 15.5 分钟和 18.7 分钟两个洗脱峰对应的分子量分别为 32.8 kDa 和 15.5 kDa（图 S2B）。类似地，TP 的分子量分别为 38.4 kDa 和 17.6 kDa（图 S2C）。该结果与 SDS-PAGE 分析的分子量一致（表 S1），证实了 TTR 和 TP 二聚体的形成。此外，根据 SDS-PAGE 结果测定，TTR 和 TP 的单体含量分别约为 50 % 50 % 50%50 \% 和 67 % 67 % 67%67 \% 。 根据先前报道，单体与二聚体 TTR 均可与 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 相互作用并抑制 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 聚集； 39 39 ^(39){ }^{39} 因此，后续研究采用含混合形态（单体与二聚体）的 TTR 及 TP 蛋白。
通过动态光散射法测定 TTR 和 TP 的粒径。如图 1A 所示，TTR 的流体力学直径（Dh）为 5.6 nm，与先前报道结果高度吻合。相比之下，TP 的 Dh 值从 5.6 nm 增至 7.5 nm。在生理条件（pH 7.4）下，TTR 几乎呈电中性，其 ζ ζ zeta\zeta 电位值为 1.3 mV；而 TP 带正电荷，电位值达 26.6 mV（图 1B）。该结果表明 Pen 的融合增加了 TTR 的正电荷，可能提升其抑制效率。
根据 TTR 的蛋白质结构（PDB ID：1DVQ），其单体中存在两个色氨酸残基（Trp41 和 Trp79）。 41 41 ^(41){ }^{41} 天然状态下 Trp79 的荧光被淬灭，而 Trp41 则表现出荧光特性，因此观测到的 TTR/TP 固有色氨酸荧光可完全归因于 Trp41。 42 , 43 42 , 43 ^(42,43){ }^{42,43} 通过测量色氨酸荧光光谱评估 Pen 对 TTR 的影响。如图 1C 所示，TTR 与 TP 的最大发射波长均为 332 nm，表明与 Pen 融合后 Trp41 附近的微环境几乎未发生变化。此外，采用 8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）荧光探针检测蛋白质疏水性。加入 TTR/TP 后，ANS 的最大发射波长从 545 nm 蓝移至 480 nm，同时荧光强度增加 4 − 5 4 − 5 4-54-5 倍，证实 TTR 与 TP 均具有强疏水性，且 TP 的疏水性与 TTR 几乎相同（图 1D）。通过圆二色光谱（CD）表征构象信息（图 1E），并在图 1F 中进行定量分析。 TTR 的β-折叠、α-螺旋和转角含量分别为 30.3 % , 16.4 % 30.3 % , 16.4 % 30.3%,16.4%30.3 \%, 16.4 \% 、 18 % 18 % 18%18 \% 和 31.3 % 31.3 % 31.3%31.3 \% ，而 TP 的对应含量为 24.2 % 24.2 % 24.2%24.2 \% 、 16 % 16 % 16%16 \% 和 38 , 44 38 , 44 ^(38,44){ }^{38,44} ，这与已知的 TTR 晶体结构一致。 α α alpha\alpha 由于融合了富含α-螺旋的 Pen 蛋白，TP 呈现出比 TTR 更高的α-螺旋结构含量。为深入解析 TP 的构象特征，我们通过 AlphaFold2 重建了 TP 的三维模型。如图 2 所示，TP 与 TTR 结构相似，但在 N 端和 C 端存在细微差异：两种蛋白的 N 端均为无规卷曲但朝向相反，而 C 端结构差异
图 2. (A)TTR 单体结构(PDB ID:1DVQ)，(B)TP 单体结构，(C)TTR 与 TP 结构对比分析
主要源于 Pen 蛋白的融合。因此 Pen 的融合不会改变 TTR 的主体结构，但能增加螺旋含量，这可能有利于 TP 穿透血脑屏障。 45 45 ^(45){ }^{45}
对β淀粉样蛋白纤维化的抑制作用。在阿尔茨海默病（AD）中，记忆丧失与β淀粉样蛋白纤维的沉积相关。AD 患者脑内存在两种主要亚型：Aβ40 和 Aβ42。通过硫磺素 T（ThT）实验探究 TTR/TP 对β淀粉样蛋白聚集的影响。如图 S3 所示，Pen 对最终 ThT 荧光无影响。TTR 和 Pen 将荧光强度降至[数值]，该效果与单独使用 TTR 处理时相似。相比之下，TP 能完全抑制β淀粉样蛋白聚集，表明 Pen 与 TTR 的融合显著增强了抑制效力。图 3 进一步比较了 TTR/TP 对 Aβ40 和 Aβ42 聚集的抑制效果。TP 在低浓度时即展现出比 TTR 更强的抑制能力：TP 使 ThT 荧光强度降至[数值]，而相同浓度下 TTR 仅显示微弱抑制作用。与[物质]共孵育的[物质]的 ThT 荧光强度，与仅用 TTR 处理组几乎相当。这些结果表明，TP 抑制β淀粉样蛋白纤维化的效果优于 TTR。
如先前报道， A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的纤维化滞后期较 A β 42 A β 42 Abeta_(42)\mathrm{A} \beta_{42} 更长，因此采用 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 来分析成核现象。表 S2 对不同条件下 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的滞后时间（ T lag T lag  T_("lag ")T_{\text {lag }} ）值进行了统计分析。如图 S4 所示， β 40 β 40 beta_(40)\beta_{40} 的纤维化呈现 S 型硫黄素 T 曲线，其 T lag T lag T_(lag)T_{\operatorname{lag}} 值为 41.1 小时。随着 TTR 浓度增加， T lag T lag  T_("lag ")T_{\text {lag }} 显著延长（图 S4A）。相比之下，TP 能加速 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 的成核过程。当 TP 浓度为 0.25 和 0.5 μ M 0.5 μ M 0.5 muM0.5 \mu \mathrm{M} 时， T lag T lag  T_("lag ")T_{\text {lag }} 值分别缩短至 24.8 和 27.8 小时；而当浓度高于 2.5 μ M 2.5 μ M 2.5 muM2.5 \mu \mathrm{M} 时则未观察到荧光信号（图 4A 与 S4B）。研究认为，阳离子穿膜肽与 TTR 的融合使 TP 表面带正电荷，通过静电作用富集带负电的 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 物质，导致 TP 周围 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 物质的局部浓度升高，从而加速成核进程。
随后通过原子力显微镜（AFM）观察了组装体 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 的聚集形态。 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 样品中形成了典型的长分支纤维（图 4 B 4 B 4B4 B ），与 A β 40 A β 40 Abeta_(40)A \beta_{40} 和 2.5 μ M 2.5 μ M 2.5 muM2.5 \mu \mathrm{M} 浓度 TTR 共孵育也得到类似结果，表明低浓度 TTR 对纤维化影响不明显。相比之下，更低浓度的 TP 显著改变了 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的形态——在 1 μ M 1 μ M 1muM1 \mu \mathrm{M} 浓度 TP 处理组观察到更细碎断裂的 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 纤维，而 1.5 μ M 1.5 μ M 1.5 muM1.5 \mu \mathrm{M} 浓度 TP 处理组则检测到无定形聚集体（图 4B）。这些结果表明 TP 能显著抑制 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 纤维化，与硫黄素 T 荧光实验结果一致。
图 3. (A) A β 42 A β 42 Abeta_(42)\mathrm{A} \beta_{42} 和(B) A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 与 TTR/TP 共孵育 48 ( A β 42 ) 48 A β 42 48((A)beta_(42))48\left(\mathrm{~A} \beta_{42}\right) 或 130 h ( A β 40 ) 130 h A β 40 130h((A)beta_(40))130 \mathrm{~h}\left(\mathrm{~A} \beta_{40}\right) 后的标准化硫黄素 T 荧光强度。纯 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 的荧光值设定为 100 % 100 % 100%100 \% 。误差线表示标准偏差（ n = 3 n = 3 n=3n=3 ）。 A β 42 A β 42 Abeta_(42)\mathrm{A} \beta_{42} 和 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的浓度均为 25 μ M 25 μ M 25 muM25 \mu \mathrm{M} 。
图 4. TP 对β淀粉样蛋白纤维化的抑制作用。(A) Aβ单体(20 μM)与 TP 共孵育时的硫黄素 T 荧光动力学曲线。(B) 不同处理剂孵育后 Aβ的原子力显微镜图像。(C) 圆二色谱检测显示 130 小时孵育后不同浓度 TP 引起的 Aβ构象变化。
为解析 Aβ构象变化，我们进行了圆二色谱检测。如图 4C 所示，孵育 130 小时后在 195 nm 处出现正峰、215 nm 附近出现宽负峰，表明典型β-折叠结构的形成。随着 TP 浓度增加，Aβ的两个特征峰逐渐消失，并在 200 nm 处出现代表无规卷曲结构的负峰。特别值得注意的是，当 TP 浓度为 1:0.25 时，在 208 nm 和 215 nm 附近出现两个宽负峰，说明
同时存在α-螺旋和β-折叠结构。当 Aβ与 1:1 比例 TP 混合时，200 nm 处出现负谷，证实 TP 有效阻止了从无规卷曲向β-折叠结构的构象转化。
根据上述结果，我们得出结论：带正电荷的 TP 能显著抑制β淀粉样蛋白纤维化。尤其值得注意的是，TP 在低浓度下就展现出显著的抑制效果，相较于其他抑制剂具有明显优势。
此前报道的蛋白质类抑制剂，如 HSA-A、HSA-B、BSA-B 和 hLys-B。 12 , 49 , 50 12 , 49 , 50 ^(12,49,50){ }^{12,49,50}
TP 与 A β A β Abeta\mathrm{A} \boldsymbol{\beta} 的相互作用。为阐明抑制作用，通过等温滴定量热法(ITC)测定了 TTR/TP 与 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的亲和力。采用独立位点模型拟合滴定数据，计算得到包括焓变 ( Δ H ) ( Δ H ) (Delta H)(\Delta H) 、熵变 ( Δ S ) ( Δ S ) (Delta S)(\Delta S) 、吉布斯自由能变 ( Δ G ) ( Δ G ) (Delta G)(\Delta G) 及解离常数( K d K d K_(d)K_{\mathrm{d}} )在内的热力学参数(图 S5)。如表 1 所示，测得 TTR 与 TP 的 K d K d K_(d)K_{\mathrm{d}} 分别为 41.5 和 19.4 μ M 19.4 μ M 19.4 muM19.4 \mu \mathrm{M} 。TP 与 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 之间更小的 K d K d K_(d)K_{\mathrm{d}} 值表明 TP 具有更高的结合亲和力。
表 1. 通过拟合 ITC 数据获得的热力学参数与解离常数
TTR TP
K d ( × 10 − 6 M ) K d × 10 − 6 M K_(d)(xx10^(-6)M)K_{\mathrm{d}}\left(\times 10^{-6} \mathrm{M}\right) 41.5 ± 0.2 41.5 ± 0.2 41.5+-0.241.5 \pm 0.2 19.4 ± 0.8 19.4 ± 0.8 19.4+-0.819.4 \pm 0.8
Δ H ( kJ moL − 1 ) Δ H kJ moL − 1 Delta H((kJ)moL^(-1))\Delta H\left(\mathrm{~kJ} \mathrm{moL}^{-1}\right) − 28.0 ± 18.4 − 28.0 ± 18.4 -28.0+-18.4-28.0 \pm 18.4 − 40.4 ± 1.2 − 40.4 ± 1.2 -40.4+-1.2-40.4 \pm 1.2
T Δ S ( kJ moL − 1 ) T Δ S kJ moL − 1 T Delta S((kJ)moL^(-1))T \Delta S\left(\mathrm{~kJ} \mathrm{moL}^{-1}\right) 8.5 10.1
Δ G ( kJ moL − 1 ) Δ G kJ moL − 1 Delta G((kJ)moL^(-1))\Delta G\left(\mathrm{~kJ} \mathrm{moL}^{-1}\right) -36.4 -50.5
TTR TP K_(d)(xx10^(-6)M) 41.5+-0.2 19.4+-0.8 Delta H((kJ)moL^(-1)) -28.0+-18.4 -40.4+-1.2 T Delta S((kJ)moL^(-1)) 8.5 10.1 Delta G((kJ)moL^(-1)) -36.4 -50.5| | TTR | TP | | :---: | :---: | :---: | | $K_{\mathrm{d}}\left(\times 10^{-6} \mathrm{M}\right)$ | $41.5 \pm 0.2$ | $19.4 \pm 0.8$ | | $\Delta H\left(\mathrm{~kJ} \mathrm{moL}^{-1}\right)$ | $-28.0 \pm 18.4$ | $-40.4 \pm 1.2$ | | $T \Delta S\left(\mathrm{~kJ} \mathrm{moL}^{-1}\right)$ | 8.5 | 10.1 | | $\Delta G\left(\mathrm{~kJ} \mathrm{moL}^{-1}\right)$ | -36.4 | -50.5 |
已知氢键和/或静电相互作用可导致负的焓变，而疏水相互作用则会引起正的熵变。负的 Δ H Δ H Delta H\Delta H 和正的 T Δ S T Δ S T Delta ST \Delta S 值表明静电与疏水相互作用共同参与了结合过程。此外，通过比较 TTR / A β 40 / A β 40 //Abeta_(40)/ \mathrm{A} \beta_{40} 与 TP / A β 40 / A β 40 //Abeta_(40)/ \mathrm{A} \beta_{40} 的 T Δ S T Δ S T Delta ST \Delta S 和 Δ H Δ H Delta H\Delta H 值，可以推测不同的 K d K d K_(d)K_{\mathrm{d}} 值主要源于静电相互作用的差异。
为验证静电相互作用对抑制能力的影响，通过改变盐浓度进行了硫黄素 T 荧光实验（图 S6）。NaCl 浓度升高会形成疏水环境，从而加速β淀粉样蛋白的聚集。实验数据显示，转甲状腺素蛋白几乎无法抑制原纤维形成，且在不同盐浓度下聚集曲线几乎无波动（图 S6B、D）。然而经 TP 处理的样本，其硫黄素 T 荧光强度随 NaCl 浓度升高而增强，这可能是高盐浓度环境下静电屏蔽效应所致（图 S6B、D），表明正电荷在 TP 与β淀粉样蛋白的静电相互作用中起关键作用。
为探究抑制剂与β淀粉样蛋白（Aβ）的详细相互作用机制，我们进行了分子对接实验并计算了结合亲和力。结合亲和力可细分为范德华力与静电能，分别对应疏水相互作用和静电相互作用。TP-Aβ复合物与 TTR-Aβ复合物的范德华力分别为-376.8 kJ/mol 和-350.0 kJ/mol，表明两者疏水相互作用程度相近（表 2）。然而两者的静电相互作用...
表 2. 通过分子动力学模拟计算的 Aβ与 TTR/TP 结合自由能
  TTR-Aβ复合物   TP-Aβ复合物
  HADDOCK 评分 − 111.3 ± 6.1 − 111.3 ± 6.1 -111.3+-6.1-111.3 \pm 6.1 − 136.9 ± 1.7 − 136.9 ± 1.7 -136.9+-1.7-136.9 \pm 1.7
范德华能 ( kJ moL − 1 ) kJ moL − 1 (kJmoL^(-1))\left(\mathrm{kJ} \mathrm{moL}^{-1}\right) − 350.5 ± 22.6 − 350.5 ± 22.6 -350.5+-22.6-350.5 \pm 22.6 − 376.8 ± 6.0 − 376.8 ± 6.0 -376.8+-6.0-376.8 \pm 6.0
  静电能 ( kJ moL − 1 ) kJ moL − 1 (kJmoL^(-1))\left(\mathrm{kJ} \mathrm{moL}^{-1}\right) − 584.8 ± 25.5 − 584.8 ± 25.5 -584.8+-25.5-584.8 \pm 25.5 − 812.0 ± 21.3 − 812.0 ± 21.3 -812.0+-21.3-812.0 \pm 21.3
TTR-A beta TP-A beta HADDOCK score -111.3+-6.1 -136.9+-1.7 van der Waals energy (kJmoL^(-1)) -350.5+-22.6 -376.8+-6.0 Electrostatic energy (kJmoL^(-1)) -584.8+-25.5 -812.0+-21.3| | TTR-A $\beta$ | TP-A $\beta$ | | :--- | :--- | :--- | | HADDOCK score | $-111.3 \pm 6.1$ | $-136.9 \pm 1.7$ | | van der Waals energy $\left(\mathrm{kJ} \mathrm{moL}^{-1}\right)$ | $-350.5 \pm 22.6$ | $-376.8 \pm 6.0$ | | Electrostatic energy $\left(\mathrm{kJ} \mathrm{moL}^{-1}\right)$ | $-584.8 \pm 25.5$ | $-812.0 \pm 21.3$ |
TP-A β β beta\beta 复合物（即 − 812.0 kJ mol − 1 − 812.0 kJ mol − 1 -812.0kJmol^(-1)-812.0 \mathrm{~kJ} \mathrm{~mol}^{-1} ）的数值显著高于 TTR（即 − 584.8 kJ mol − 1 − 584.8 kJ mol − 1 -584.8kJmol^(-1)-584.8 \mathrm{~kJ} \mathrm{~mol}^{-1} ）。因此，与 TTR 相比，静电相互作用对 TP 与 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 的结合贡献更大。
结合位点被进一步分析。如图 S7 的三维快照所示，尽管 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 位于 TTR 和 TP 单体的 C 端，但结合位点存在明显差异。TTR 的 Arg103 胍基与 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的 Val36 残基氧原子可形成分子间氢键。另一氢键形成于 TTR 的 Asn124 残基羧基与 Gly38 残基酰胺基之间（图 S7A,B）。相比之下，TP 与 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 上的 Asp7、Gly9 和 Lys28 残基间存在三个氢键（图 S7C,D）。值得注意的是，Asp7 和 Gly9 残基均可与 TP 的 Arg103 残基形成双氢键。此外，带正电的 Arg153 残基与带负电的 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的 Glu3 残基间形成了分子间盐桥（图 S7D），这有助于 TP 获得高静电能量。综上，疏水作用稳定了 TTR/TP-A β β beta\beta 复合物，而静电作用进一步强化了相互作用。基于该结论，未来研究可尝试通过 TTR 蛋白质工程增强相互作用并提升疗效。 通过蛋白质工程对 TTR 序列进行突变，或对 TTR 进行化学修饰，可以增强这些相互作用并提高抑制效力。此外，蛋白质的构象对维持活性至关重要。因此，在未来的研究中，我们可以向 TTR 引入盐桥和二硫键以增强构象稳定性，这应能提升抑制效果。
Aβ诱导细胞毒性的缓解作用。SH-SY5Y 细胞与 TTR 和 TP 共培养后，采用 MTT 法检测细胞毒性。细胞活力实验表明，即使在超高浓度 50 μ M 50 μ M 50 muM50 \mu \mathrm{M} 下，TTR 和 TP 几乎无毒性，显示出良好的生物相容性（图 S8）。图 5A 显示 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 使细胞活力显著降至@3%，证实了 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的神经毒性。TTR 在 2.5 μ M 2.5 μ M 2.5 muM2.5 \mu \mathrm{M} 浓度下将细胞活力轻微提升至@5%，显示其适度解毒作用。相比之下，TP 在 2.5 μ M 2.5 μ M 2.5 muM2.5 \mu \mathrm{M} 浓度下显著恢复细胞活力（最高达@9%），消除了大部分 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 诱导的细胞毒性；在 25 μ M 25 μ M 25 muM25 \mu \mathrm{M} 浓度下更将细胞活力提升至@10%，凸显 TP 在较低浓度下保护神经元免受 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 诱导毒性的卓越能力。
通过荧光素二乙酸酯/碘化丙啶(FDA/PI)双染色法进一步检测 TP 的解毒效果。图 5B 显示， A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 组较对照组明显出现更多红色荧光点，表明 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 聚集体可引发严重细胞毒性。与 MTT 实验结果一致，经老化 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 和 TTR 孵育后，PI 阳性细胞数量减少。值得注意的是，TP 处理组几乎未见死亡细胞。上述结果证明 TP 能有效抑制通路聚集和细胞毒性。
体内淀粉样蛋白抑制能力研究。采用 CL2006 线虫作为阿尔茨海默病体内模型评估治疗效果。如图 6A 所示，可观察到大量绿色荧光斑点，表明 AD 线虫体内出现 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 积累与沉积。经处理的 CL2006 线虫体内存在许多明显绿色斑块
图 5. 减轻 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 诱导的细胞毒性。(A)不同浓度蛋白与 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 共孵育后的 MTT 实验结果。仅用 PBS 缓冲液处理的细胞存活率定义为 100 % 100 % 100%100 \% 。误差线表示标准偏差( n = 6 n = 6 n=6n=6 )，### P < 0.001 P < 0.001 P < 0.001P<0.001 与对照组相比； ∗ P < 0.05 ∗ P < 0.05 ^(**)P < 0.05{ }^{*} P<0.05 、**P < 0.01 < 0.01 < 0.01<0.01 及***P < 0.001 < 0.001 < 0.001<0.001 表示与 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 处理组相比的显著性差异。(B)通过 FDA/PI 双染色观察蛋白对 SH-SY5Y 细胞的保护作用。TTR 与 TP 的浓度均为 2.5 μ M 2.5 μ M 2.5 muM2.5 \mu \mathrm{M} 。比例尺为 200 μ m 200 μ m 200 mum200 \mu \mathrm{~m} 。
与 TTR 的 5 μ M 5 μ M 5muM5 \mu \mathrm{M} 相比，TP 未能抑制 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 斑块沉积。TP 处理组 AD 线虫的 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 斑块沉积被显著抑制，在 2.5 μ M 2.5 μ M 2.5 muM2.5 \mu \mathrm{M} 仅出现微弱绿色荧光斑点，且 5 μ M 5 μ M 5muM5 \mu \mathrm{M} 处未见明显 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 沉积物。如图 S9 所示，经不同浓度 TTR 和 TP 处理的 N2 线虫寿命基本无变化，表明 TTR 与 TP 具有良好的生物相容性。寿命实验进一步显示， 5 μ M 5 μ M 5muM5 \mu \mathrm{M} 浓度的 TP 将 AD 线虫死亡时间从 14 天延迟至 18 天（图 6B）。上述体外/体内实验结果证实了 TP 治疗 AD 的潜力。尽管 TP 能有效清除淀粉样斑块并延长线虫寿命，但线虫模型缺乏血脑屏障。后续研究应在更复杂的动物模型（如转基因 AD 小鼠）中验证 TP 的治疗潜力。
血脑屏障穿透能力及 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 转运促进作用。通过小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）单层模型的 Transwell 实验评估 Pen 对血脑屏障通透性的影响（图 7A 和 B）。蛋白质首先用 Cy5 标记（TTR-Cy5/TP-Cy5）。 52 , 53 52 , 53 ^(52,53){ }^{52,53} 同时，TTR-Cy5 和 TP-Cy5 的 ThT 荧光强度与 TTR/TP 几乎相同
治疗结果表明，TTR-Cy5/TP-Cy5 并未改变对β淀粉样蛋白聚集的抑制作用（图 S10）。随后将 TTR、TP、TTR-Cy5 和 TP-Cy5 分别滴入上室，根据下室中蛋白质浓度定量分析血脑屏障通透性（图 S11）。图 7C 和 S12 显示，TTR 与 TTR-Cy5 的血脑屏障通透性相近，TP 与 TP-Cy5 的通透性也相当。TP 在 3 小时后的通透效率达到 15 % 15 % 15%15 \% ，约为 TTR（ 2 % 2 % 2%2 \% ）的 7 倍，证实 TP 具有高效跨血脑屏障能力。当共孵育时间延长至 6 小时，TP 处理细胞的通透性（ 30 % 30 % 30%30 \% ）约为 TTR（ 3 % 3 % 3%3 \% ）的 10 倍。事实上，TP 的血脑屏障渗透率明显高于 RVG 修饰的纳米药物（孵育 10 小时后渗透效率达 25 % 25 % 25%25 \% ）。 54 54 ^(54){ }^{54} 此外，通过荧光显微镜观察到 SH-SY5Y 细胞内化的 TTR-Cy5/TP-Cy5。 与 TTR-Cy5 组相比，检测到更多分散的 TP-Cy5 红色荧光信号（图 7D），这表明带正电荷且具有疏水性的 Pen 增强了 TP 的细胞摄取。这些
图 6. (A) 线虫与 TTR/TP 共培养 3 天后的代表性图像。采用 ThT（绿色荧光）作为特异性荧光探针在培养结束时对线虫进行染色。激发波长范围： 450 − 490 nm 450 − 490 nm 450-490nm450-490 \mathrm{~nm} 。比例尺： 30 μ m 30 μ m 30 mum30 \mu \mathrm{~m} 。(B) N2 和 CL2006 品系线虫与 TTR 及 TP 共培养后的存活曲线。TTR 和 TP 浓度均为 5 μ M 5 μ M 5muM5 \mu \mathrm{M} 。
图 7. 体外血脑屏障实验。(A 和 B) TTR-Cy5 与 TP-Cy5 穿越血脑屏障的模型。(C) 蛋白质通过血脑屏障的转运效率。(D) 孵育 6 小时后 SH-SY5Y 细胞中 TTR-Cy5 与 TP-Cy5(红色)的代表性图像。比例尺：200 微米。
实验结果表明，TP 能显著增强穿越血脑屏障的能力及进入神经元的效率，为阿尔茨海默病治疗奠定了坚实基础。体内血脑屏障通透性实验是评估中枢神经系统疾病治疗药物的重要环节。体外实验结果与体内血脑屏障穿透生物反应的相关性，对于验证 TP 的治疗潜力至关重要。后续研究应着重开展详尽的体内实验，以验证融合蛋白的血脑屏障
通透性，检验其在神经系统疾病中的临床应用价值。
我们进一步采用 Transwell 模型研究 TTR/TP 的转运能力。将荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的β淀粉样蛋白（其聚集特性与未标记蛋白保持一致，图 S13）加入下室，随后加入 Cy5 标记的 TTR/TP。培养 12 或 24 小时后检测 FITC 标记β淀粉样蛋白的荧光强度。如图 8B 所示，与 Cy5-TTR 和 Cy5-TP 混合后，β淀粉样蛋白的渗透性显著增加。值得注意的是，Cy5-TP 使β淀粉样蛋白单层转运率从 26.2%提升至 43.8%，而 Cy5-TTR 组 24 小时培养后的转运率仅为 29.5%。为考察 TTR 和 TP 在促进β淀粉样蛋白跨血脑屏障转运中的变化，我们记录了上下室中 Cy5-TTR/TP-Cy5 的含量。使用 Cy5-TTR 和 Cy5-TP 重复实验（图 8C）获得相似结果，进一步证实 TP 可能促进β淀粉样蛋白从脑组织中外排。

  - 结论

本研究通过将 TTR 与 Pen 融合，开发出具有血脑屏障穿透能力的蛋白质抑制剂 TP。一系列实验研究表明，TP 对 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 展现出增强的抑制活性，能有效调控通路 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 的聚集过程，降低 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 诱导的毒性，促进 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 亚型的清除，延缓 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 触发的麻痹症状，并且
图 8. A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的脑血渗透性。(A) A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 穿越血脑屏障的示意图。在未添加或添加 TTR-Cy5/TP-Cy5 条件下，将 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 加入脑侧室。(B) 存在 TTR-Cy5 或 TP-Cy5 时 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的脑血渗透性。TTR、TP 和 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 的浓度均为 25 μ M 25 μ M 25 muM25 \mu \mathrm{M} 。(C) 脑侧与血液侧 TTR-Cy5 或 TP-Cy5 的标准化荧光强度。
在极低浓度下即可延长 CL2006 线虫寿命。这主要归因于 TP 与 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 物种间的静电相互作用。值得注意的是，血脑屏障穿透实验表明 TP 的穿透率约为 TTR 的 10 倍，意味着 TP 能高效穿越血脑屏障。因此相较于 TTR，TP 更有利于将 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 转运跨越血脑屏障，从而提升脑内 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 的清除效率。由此可预见，兼具高效抑制性和血脑屏障穿透性的融合蛋白将成为神经退行性疾病极具前景的临床药物。

- 材料与方法

材料。氨苄青霉素（Amp）、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）、硫黄素 T（ThT）、MTT、荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）均购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）。DMEM/F12 培养基、DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（PS）溶液购自 Gibco（美国纽约）。DAPI 和 Cy5- NH 2 NH 2 NH_(2)\mathrm{NH}_{2} 染料由江天化学（中国天津）提供。A β β beta\beta （ > 95 % > 95 % > 95%>95 \% ，冻干粉）和 FITC-A β β beta\beta 蛋白购自吉尔生化（中国上海）。人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞和 bEnd.3 细胞来源于中国科学院细胞库（中国上海）。野生型线虫品系（N2）和 AD 转基因品系（CL2006）由美国明尼苏达大学线虫遗传学中心（CGC）提供，大肠杆菌 OP50 由河南大学（中国河南）馈赠。其余化学试剂均为本地采购的最高纯度产品。
TTR 与 TP 蛋白的表达与纯化。TTR 和 TP 两种蛋白均在大肠杆菌 BL21 中表达
按照先前描述的方法进行纯化，并稍作修改。具体而言，基于 TTR 和 TP 的氨基酸序列，设计了 pCold II-TTR 和 TP 表达载体。随后将载体转化至大肠杆菌 BL21 中，选取阳性克隆接种于含氨苄青霉素的 LB 培养基中过夜培养。当 OD600 值达到设定值时，加入 1 mM IPTG 并在摇床条件下继续培养。接着以 5000 转/分钟离心 30 分钟收集菌体，用裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM 咪唑，1 mM DTT）通过超声破碎细胞。破碎 25 分钟后，离心收集上清液并过滤。随后使用填充 Ni-NTA 琼脂糖树脂的亲和层析柱进行纯化，先用裂解缓冲液冲洗去除未结合蛋白，最后用洗脱缓冲液（20 mM Tris，500 mM 咪唑，pH 7.5）洗脱获得纯化蛋白组分。最终将纯化蛋白溶液透析 3 天，冻干后保存。 使用 BCA 蛋白定量试剂盒（Solarbio，中国北京）测定浓度。
TTR 与 TP 的特性表征。采用 Zetasizer Nano 粒度分析仪（Malvern Instruments，英国伍斯特郡）测定 TTR 和 TP 的粒径分布及 ζ ζ zeta\zeta 电位。分子量通过凝胶渗透色谱（日本岛津）测定。在 PBS 缓冲液（100 mM 磷酸钠，10 mM NaCl，pH 7.4）中配制 0.1 mg mL − 1 mL − 1 mL^(-1)\mathrm{mL}^{-1} 溶液，使用荧光分光光度计（PerkinElmer LS-55，美国马萨诸塞州）于 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 条件下测定 TTR 和 TP 的固有荧光光谱。 55 , 56 55 , 56 ^(55,56){ }^{55,56}
采用圆二色谱仪（J-810，日本 Jasco）记录 TTR 和 TP 的结构信息，并利用 BeStSeL 算法（https://bestsel.elte.hu）分析其二级结构含量。 57 57 ^(57){ }^{57}
SDS-PAGE 分析。为测定 TTR 和 TP 的纯度，进行 SDS-PAGE 实验。将 20 微升纯化样品与上样缓冲液（含或不含 5 % β 5 % β 5%beta5 \% \beta -巯基乙醇）孵育后进行电泳分析。采用考马斯亮蓝 R-250 染色后，通过灰度分析对目标蛋白进行定量。
A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 单体制备。将冻干的 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 和 A β 42 A β 42 Abeta_(42)\mathrm{A} \beta_{42} 单体溶于六氟异丙醇(HFIP)，冰浴条件下超声处理 20 分钟以去除预存的淀粉样蛋白聚集体。随后通过离心收集上清液并冷冻干燥过夜。最终处理后的 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 单体储存于 − 20 ∘ C − 20 ∘ C -20^(@)C-20^{\circ} \mathrm{C} 备用。
硫磺素 T(ThT)荧光检测。使用 20 mM NaOH 溶液溶解配制新鲜 A β 42 A β 42 Abeta_(42)\mathrm{A} \beta_{42} 溶液，并用 PBS 缓冲液稀释。将单体形式的 A β 42 ( 25 μ M ) A β 42 ( 25 μ M ) Abeta_(42)(25 muM)\mathrm{A} \beta_{42}(25 \mu \mathrm{M}) 在 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 条件下与蛋白质共孵育（设含蛋白组与无蛋白对照组）。48 小时后加入 ThT（ 25 μ M 25 μ M 25 muM25 \mu \mathrm{M} ），采用荧光分光光度计（PerkinElmer LS55，美国沃尔瑟姆）在 480 nm ( λ e x = 440 nm ) 480 nm ( λ e x = 440 nm ) 480nm(lambda ex=440nm)480 \mathrm{~nm}(\lambda e x=440 \mathrm{~nm}) 波长处记录荧光发射强度，每组设三个复孔，数据使用 Origin 2021b 软件处理。 58 58 ^(58){ }^{58} 最终数据取三次独立实验的平均值。
在动力学实验中，预处理后的 A β 40 ( 25 μ M ) A β 40 ( 25 μ M ) Abeta_(40)(25 muM)\mathrm{A} \beta_{40}(25 \mu \mathrm{M}) 单体分别与硫磺素 T（ThT）单独共孵育，或在不同浓度 TTR 或 TP 存在下共孵育。使用荧光酶标仪（Infinite M200 Pro，TECAN，奥地利萨尔茨堡）在 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 条件下每隔 10 分钟监测一次 ThT 荧光强度，以研究原纤维形成动力学。 59 59 ^(59){ }^{59} ThT 的激发和发射波长分别为 440 nm 和 480 nm。未添加 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的样品荧光值作为背景扣除。所有动力学曲线均为三次独立实验的平均值。
实验数据采用玻尔兹曼公式（公式1）进行拟合，其中 t 1 / 2 t 1 / 2 t_(1//2)t_{1 / 2} 表示荧光强度达到最大值一半时所需时间； K K KK 代表一级动力学常数； y max y max  y_("max ")y_{\text {max }} 和 y 0 y 0 y_(0)y_{0} 分别为最大荧光值和初始荧光值。
y = y 0 + y max − y 0 1 + exp ⁡ [ − ( t − t 1 / 2 ) k ] y = y 0 + y max − y 0 1 + exp ⁡ − t − t 1 / 2 k y=y_(0)+(y_(max)-y_(0))/(1+exp[-(t-t_(1//2))k])y=y_{0}+\frac{y_{\max }-y_{0}}{1+\exp \left[-\left(t-t_{1 / 2}\right) k\right]}
滞后时间（ T lag T lag  T_("lag ")T_{\text {lag }} ）可通过公式2计算得出
T l a g = t 1 / 2 − 2 k T l a g = t 1 / 2 − 2 k T_(lag)=t_(1//2)-(2)/(k)T_{l a g}=t_{1 / 2}-\frac{2}{k}
原子力显微镜（AFM）检测。将样品（ 50 μ L 50 μ L 50 muL50 \mu \mathrm{~L} ）滴加至新鲜剥离的云母基底上，室温静置 5 分钟。用无菌水（5 mL）冲洗基底后室温干燥过夜。采用原子力显微镜（CSPM5500，中国本原）的轻敲模式观察样品形貌。
圆二色谱分析。采用圆二色谱技术研究 TTR 和 TP 对 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 二级结构的影响。在室温条件下使用光程为 1 nm 的石英比色皿监测样品椭圆率，扫描范围为 190-260 nm，扫描速度为 200 nm min − 1 200 nm min − 1 200nmmin^(-1)200 \mathrm{~nm} \mathrm{~min}^{-1} ，每个光谱数据为三次扫描的平均值。
等温滴定量热实验。使用 Affinity ITC 等温滴定量热仪（TA Instruments 公司，美国特拉华州纽卡斯尔）测定 TTR/TP 与 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的结合亲和力。将新鲜配制的 A β 40 ( 20 μ M ) A β 40 ( 20 μ M ) Abeta_(40)(20 muM)\mathrm{A} \beta_{40}(20 \mu \mathrm{M}) 溶于磷酸盐缓冲液（100 mM 磷酸钠，pH 7.4）后加入样品池，TTR 或 TP 溶液（ 50 μ M 50 μ M 50 muM50 \mu \mathrm{M} ）在 25 ∘ C ∘ C ^(@)C{ }^{\circ} \mathrm{C} 条件下以 500 s 为间隔连续滴定至 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 溶液中。通过将相同浓度蛋白滴定至缓冲液获得稀释热作为背景值。所有样品均经真空脱气处理至少 10 分钟。采用 Launch Nano Analyze 软件（3.11.0 版，TA Instruments）进行数据拟合，使用独立位点模型拟合确定解离常数 K d K d K_(d)K_{\mathrm{d}} 、焓变 Δ H Δ H Delta H\Delta H 及熵变 Δ S Δ S Delta S\Delta S 。
细胞活性检测。SH-SYSY 细胞在细胞培养条件下（ 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37{ }^{\circ} \mathrm{C} 和 5 % CO 2 5 % CO 2 5%CO_(2)5 \% \mathrm{CO}_{2} ）使用含 10%胎牛血清（FBS）和 1%青霉素-链霉素（PS）的 DMEM/F-12 培养基培养。为探究 TTR 或 TP 对 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 诱导细胞毒性的影响，进行 MTT 实验。将 SH-SY5Y 细胞（每孔 80 μ L , 8 × 10 3 80 μ L , 8 × 10 3 80 muL,8xx10^(3)80 \mu \mathrm{~L}, 8 \times 10^{3} 个细胞 − 1 − 1 ^(-1){ }^{-1} ）接种于 96 孔板，与预先孵育 24 小时的 25 μ M 25 μ M 25 muM25 \mu \mathrm{M} 浓度单体蛋白溶液共培养 24 h . A β 40 24 h . A β 40 24h.Abeta_(40)24 \mathrm{~h} . \mathrm{A} \beta_{40} 小时后，向每孔加入 20 μ L 20 μ L 20 muL20 \mu \mathrm{~L} 处理样本。继续培养 24 小时待高细胞毒性的 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 寡聚体形成后，加入 5.5 mg mL − 1 5.5 mg mL − 1 5.5mgmL^(-1)5.5 \mathrm{mg} \mathrm{mL}^{-1} 浓度 MTT 溶液 10 μ L 10 μ L 10 muL10 \mu \mathrm{~L} ，再孵育 4 h . 55 , 56 , 61 4 h . 55 , 56 , 61 4h.^(55,56,61)4 \mathrm{~h} .{ }^{55,56,61} 小时。随后用 100 μ L 100 μ L 100 muL100 \mu \mathrm{~L} 浓度 DMSO 溶液替代培养基溶解甲臜结晶，采用酶标仪（Infinite M200，Tecan，奥地利）于 570 nm 波长测定吸光度值，以未处理对照组为基准计算细胞存活率（%）。所有实验均重复六次。
FDA/PI 双染色实验。通过 FDA/PI 双染色法鉴别死细胞与活细胞。首先将 SH-SY5Y 细胞（2 mL）以每孔 10 万个细胞的密度接种于 6 孔板中，在 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 条件下培养 24 小时。随后向各孔中加入 200 μ L 200 μ L 200 muL200 \mu \mathrm{~L} 处理后的样品。共培养 24 h , 1 mL 24 h , 1 mL 24h,1mL24 \mathrm{~h}, 1 \mathrm{~mL} 后，用 FDA/PI 工作液（含 10 μ g mL − 1 10 μ g mL − 1 10 mugmL^(-1)10 \mu \mathrm{~g} \mathrm{~mL}^{-1} FDA 与 5 μ g mL − 1 5 μ g mL − 1 5mugmL^(-1)5 \mu \mathrm{~g} \mathrm{~mL}^{-1} PI）替换原培养基，避光孵育 10 分钟。成像前使用新鲜 PBS 缓冲液洗涤 5 次。所有图像均采用倒置荧光显微镜（TE2000-U，日本尼康）采集。
血脑屏障转运研究。采用 bEnd.3 细胞进行体外血脑屏障实验。细胞在含 10 % FBS 10 % FBS 10%FBS10 \% \mathrm{FBS} 和 1 % PS 1 % PS 1%PS1 \% \mathrm{PS} 的 DMEM 培养液中，于 5 % CO 2 5 % CO 2 5%CO_(2)5 \% \mathrm{CO}_{2} 培养箱 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 条件下培养于细胞培养皿中。体外血脑屏障模型参照文献方法建立。将 bEnd.3 细胞（ 2.5 × 10 4 2.5 × 10 4 2.5 xx10^(4)2.5 \times 10^{4} 个细胞/孔 − 1 − 1 ^(-1){ }^{-1} ）接种于 24 孔 transwell 小室（Corning, NY）上室，下室加入不含细胞的新鲜培养基。为验证单层细胞完整性，在转运实验前于顶侧培养基中加入 FITC 标记的葡聚糖（分子量 40 kDa）。随后收集基底侧培养基中的 FITC 标记葡聚糖浓度，使用荧光酶标仪（ λ λ lambda\lambda 激发 = 492 = 492 =492=492 nm ; λ em = 518 nm nm ; λ em = 518 nm nm;lambdaem=518nm\mathrm{nm} ; \lambda \mathrm{em}=518 \mathrm{~nm} ）进行测定。若基底侧 FITC 标记葡聚糖浓度超过 125 ng mL − 1 125 ng mL − 1 125ngmL^(-1)125 \mathrm{ng} \mathrm{mL}^{-1} ，表明细胞层完整性受损，该孔数据予以剔除。通过测量跨内皮电阻（TEER）评估单层细胞完整性
使用 Millicell-ERS 伏欧计（美国 Millipore 公司）测定数值。选择跨内皮电阻值（TEER）大于 200 Ω cm 2 200 Ω cm 2 200 Omegacm^(2)200 \Omega \mathrm{~cm}^{2} 的细胞单层作为血脑屏障模型用于渗透性研究。 53 , 64 − 67 53 , 64 − 67 ^(53,64-67){ }^{53,64-67} 随后，将 TTR、TP、TTR-Cy5 或 TP-Cy5（ 50 μ L 50 μ L 50 muL50 \mu \mathrm{~L} ， 25 μ M 25 μ M 25 muM25 \mu \mathrm{M} ）以 50 μ M 50 μ M 50 muM50 \mu \mathrm{M} 浓度加入上室，下室加入无血清培养基。分别孵育 3 小时和 6 小时后，收集底室培养基作为样本，通过检测 Cy5 荧光强度，使用酶标仪测定各样本中蛋白含量。
荧光实验中，待 SH-SYSY 细胞 TEER 值超过 200 Ω cm 2 , 1 mL 200 Ω cm 2 , 1 mL 200 Omegacm^(2),1mL200 \Omega \mathrm{~cm}^{2}, 1 \mathrm{~mL} 后，将其接种至底室培养 24 小时。随后分别在上室加入 TTR-Cy5 或 TP-Cy5 蛋白（ 50 μ L , 25 μ M 50 μ L , 25 μ M 50 muL,25 muM50 \mu \mathrm{~L}, 25 \mu \mathrm{M} ）。继续培养 6 小时，弃去底室培养基。用 PBS 缓冲液缓慢洗涤 SH-SY5Y 细胞 3-4 次，加入 1 mL PBS 后通过倒置荧光显微镜观察。
细胞对 A β A β Abeta\mathrm{A} \boldsymbol{\beta} 和 TP 的渗透性。在血脑屏障转运实验中，bEnd.3 细胞被接种于 24 孔 Transwell 小室滤膜上形成紧密单层。当跨内皮电阻值(TEER)达到 200 Ω cm 2 200 Ω cm 2 200 Omegacm^(2)200 \Omega \mathrm{~cm}^{2} 时，在脑侧腔室加入 FITC 标记的 β ( 25 μ M , 50 μ L ) β ( 25 μ M , 50 μ L ) beta(25 muM,50 muL)\beta(25 \mu \mathrm{M}, 50 \mu \mathrm{~L}) 样品与 TTR-Cy5 或 TP-Cy5( 25 μ M , 50 μ L 25 μ M , 50 μ L 25 muM,50 muL25 \mu \mathrm{M}, 50 \mu \mathrm{~L} )。随后将细胞置于 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 培养箱中孵育，分别在 12 小时和 24 小时后收集脑侧与血液侧样本。通过荧光酶标仪定量测定两腔室中 A β A β Abeta\mathrm{A} \beta 、TTR-Cy5 及 TP-Cy5 的含量。
线虫品系实验。采用 CL2006 阿尔茨海默病模型线虫与 N2 野生型线虫，在含大肠杆菌 OP50 的线虫生长培养基(NGM)中 20 ∘ C 20 ∘ C 20^(@)C20^{\circ} \mathrm{C} 条件下培养。 50 50 ^(50){ }^{50}
为验证 TTR 与 TP 对线虫淀粉样斑块的清除能力，将两种蛋白( 2.5 , 5 2.5 , 5 2.5,52.5,5 或 25 μ M , 200 μ L 25 μ M , 200 μ L 25 muM,200 muL25 \mu \mathrm{M}, 200 \mu \mathrm{~L} )均匀涂布于含新鲜大肠杆菌 OP50( E E EE )的培养基表面。CL2006 线虫在含蛋白/不含蛋白的 NGM 培养基中培养 3 天。经 4 % 4 % 4%4 \% 多聚甲醛 4 ∘ C 4 ∘ C 4^(@)C4{ }^{\circ} \mathrm{C} 固定 24 小时后，使用 10 μ M 10 μ M 10 muM10 \mu \mathrm{M} 硫黄素 T(ThT)溶液染色 4 小时，最后通过荧光显微镜成像观察。
寿命测定实验中，选取 60 条 L4 期线虫转移至含 TTR 或 TP ( 2.5 μ M , 300 μ L ) TP ( 2.5 μ M , 300 μ L ) TP(2.5 muM,300 muL)\operatorname{TP}(2.5 \mu \mathrm{M}, 300 \mu \mathrm{~L}) 的 NGM 培养基。每日观察记录存活线虫数量直至全部死亡。 68 68 ^(68){ }^{68} 培养期间每 3 天更换新平板以确保线虫食物充足。数据经标准化处理，同时以未加抑制剂的 N2 线虫作为对照组。
分子对接。采用能持续生成可靠计算结构模型的 AlphaFold2 预测 TP 蛋白结构。 69 , 70 69 , 70 ^(69,70){ }^{69,70} 为研究 TTR 与 TP 蛋白同 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 分子的结合区域及相互作用模式，使用高模糊度驱动的蛋白质-蛋白质对接程序（HADDOCK）将 TTR/TP 与 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} （PDB ID：1BA4）进行对接。 71 , 72 71 , 72 ^(71,72){ }^{71,72} 选取 HADDOCK 评分最低的结构及其范德华能、静电能作为对接评价标准，通常选择 HADDOCK 评分最低的复合物作为最优构象进行分析。

  - 相关资源

(5) 支撑材料

理论分子量（MW）及通过 SDS-PAGE 和 SEC 测定的分子量（表 S1）；不同浓度 TTR 与 TP 存在/不存在条件下 A β 40 ( 25 μ M ) A β 40 ( 25 μ M ) Abeta_(40)(25 muM)\mathrm{A} \beta_{40}(25 \mu \mathrm{M}) 的滞后时间（表 S2）；TTR 和 TP 蛋白的表达与纯化（图 S1）；TTR 和 TP 的尺寸排阻色谱分析（图 S2）；含/不含抑制剂孵育时 A β β beta\beta 的标准化硫黄素 T 荧光强度（图 S3）；TTR 与 TP 存在下 A β 40 A β 40 Abeta_(40)\mathrm{A} \beta_{40} 的聚集动力学（图 S4）； 25 ∘ C 25 ∘ C 25^(@)C25{ }^{\circ} \mathrm{C} 条件下 TTR 和 TP 滴定 A β 40 ( 20 μ M ) A β 40 ( 20 μ M ) Abeta_(40)(20 muM)\mathrm{A} \beta_{40}(20 \mu \mathrm{M}) 的量热数据（图 S5）；不同 NaCl 浓度下 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37{ }^{\circ} \mathrm{C} 孵育时 TTR 或 TP 对 25 μ M A β 40 25 μ M A β 40 25 muMAbeta_(40)25 \mu \mathrm{M} \mathrm{A} \beta_{40} 单体聚集动力学的硫黄素 T 荧光监测（图 S6）；TTR/TP 与 A β 40 β 40 beta_(40)\beta_{40} 的相互作用模式（图 S7）；SH-SY5Y 细胞与 TTR 和 TP 孵育 24 小时的存活率（图 S8）；野生型线虫（N2）与 TTR 和 TP 孵育的生存曲线（图 S9）；TTR、TP、TTR-Cy5 及 TP-Cy5 孵育下 A β 40 β 40 beta_(40)\beta_{40} 单体的硫黄素 T 荧光（图 S10）；TTR、TP、TTR-Cy5 和 TP-Cy5 荧光强度与浓度的线性关系（图 S11）；TTR 和 TP 的转运效率 穿过血脑屏障（图 S12）；与 TTR 或 TP 共孵育的 Aβ9# FITC-Aβ10#单体聚集动力学硫黄素 T 荧光（图 S13）；FITC-Aβ11#标准曲线（图 S14）（PDF）

  - 作者信息

  通讯作者

刘伟 - 中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室，天津 300192；© orcid.org/0000-0003-2921-7775; 电子邮箱：liuwei@irm-cams.ac.cn
董晓燕 - 天津大学化工学院生物化工系，系统生物工程教育部重点实验室及合成生物学前沿科学中心，天津 300350；© orcid.org/0000-0002-8040-5897; 邮箱：d_xy@tju.edu.cn

  作者

  作者贡献

X.D.和 Y.S.设计研究方案；Y.W.进行实验操作；Y.W.和 W.L.分析数据；Y.W.、W.L.、X.D.及 Y.S.共同参与论文撰写工作。

  备注

作者声明无竞争性经济利益冲突。

  致谢

本研究由国家自然科学基金项目（编号：22178259和21978207）资助。

  - 参考文献

(1) Canter, R. G.; Penney, J.; Tsai, L. H. 阿尔茨海默病神经回路修复治疗之路。《自然》2016 年第 539 卷，第 187-196 页。
(2) Hernando, S.; Santos-Vizcaino, E.; Igartua, M.; Hernandez, R. M. 靶向中枢神经系统：从合成纳米颗粒到细胞外囊泡——聚焦阿尔茨海默病与帕金森病。WIREs 纳米医学与纳米生物技术 2023, 15, 编号 e1898.
(3) Selkoe, D. J. 阿尔茨海默病早期神经网络功能障碍。科学 2019, 365, 540-541.
(4) Polanco, J. C.; Li, C.; Bodea, L. G.; Martinez-Marmol, R.; Meunier, F. A.; Gotz, J. β淀粉样蛋白与 tau 蛋白的复杂性——迈向改良生物标志物与靶向治疗。神经病学自然综述 2018, 14, 22-39.
(5) Hardy, J.; Selkoe, D. J. 阿尔茨海默病淀粉样蛋白假说：治疗药物研发道路上的进展与困境。科学 2002, 297, 353-356.
(6) 尹志; 张哲; 高东; 罗刚; 马涛; 王毅; 卢琳; 高翔. 基于逐步配位驱动的金属-酚醛纳米颗粒作为阿尔茨海默病治疗的神经保护增强剂. 美国化学会应用材料与界面 2023, 15, 524-540.
(7) 德斯特鲁珀, B.; 卡兰, E. 阿尔茨海默病的细胞阶段. 细胞 2016, 164, 603-615.
(8) 高希, S.; 维尔马, S. 卡维地洛通过干预早期螺旋中间体形成抑制β淀粉样蛋白纤维化: 一项生物物理学研究. 国际生物大分子杂志 2021, 188, 263-271.
(9) 木村, A.M.; 辻, M.; 安本, T.; 森, Y.; 小口, T.; 辻, Y.; 海野, M.; 海野, A.; 西川, T.; 中村, S.; 等. 杨梅素通过细胞膜和线粒体的抗氧化作用预防高分子量β淀粉样蛋白寡聚体诱导的神经毒性. 自由基生物学与医学 2021, 171, 232-244.
(10) 贾立国; 赵文平; 桑建超; 王伟杰; 魏巍; 王岩; 赵峰; 卢凤萍; 刘飞飞. 黄酮类化合物二氢杨梅素抑制β淀粉样蛋白纤维化及其相关细胞毒性的研究. 美国化学会化学神经科学 2019, 10, 4696-4703.
(11) 熊宁; 董晓燕; 郑捷; 刘飞飞; 孙洋. LVFFARK 肽及 LVFFARK 功能化纳米颗粒抑制β淀粉样蛋白纤维化和细胞毒性的设计. 美国化学会应用材料与界面 2015, 7, 5650-5662.
(12) 王伟; 董晓; 孙洋. 通过高转化率羧基氨基修饰血清白蛋白创制强效β淀粉样蛋白纤维化抑制剂. 生物共轭化学 2019, 30, 1477-1488.
(13) 威廉姆斯; 波伦斯; 奥特-霍勒; 坎普斯; 德瓦尔; 费尔贝克. 小热休克蛋白抑制β淀粉样蛋白聚集及脑血管β淀粉样蛋白毒性. 脑研究 2006, 1089, 67-78.
(14) Panza, F.; Lozupone, M.; Logroscino, G.; Imbimbo, B. P. 阿尔茨海默病β淀粉样蛋白靶向疗法的批判性评估。Nat. Rev. Neurol. 2019, 15, 73-88.
(15) Yasir Khan, H.; Ahmad, A.; Nadir Hassan, M.; Hasan Khan, Y.; Arjmand, F.; Hasan Khan, R. 金属药物-淀粉样β聚集抑制剂在神经退行性疾病治疗中的研究进展：作用机制与神经毒性评估。Coordin. Chem. Rev. 2024, 501, No. 215580.
(16) La Manna, S.; Florio, D.; Iacobucci, I.; Napolitano, F.; De Benedictis, I.; Malfitano, A. M.; Monti, M.; Ravera, M.; Gabano, E.; Marasco, D. 铂(II)配合物对β-淀粉样蛋白聚集影响的比较研究：潜在神经药物应用。Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3015.
(17) Florio, D.; Iacobucci, I.; Ferraro, G.; Mansour, A. M.; Morelli, G.; Monti, M.; Merlino, A.; Marasco, D. 含 2-(2'-吡啶基)苯并咪唑配体的平面四方配合物在淀粉样蛋白模型系统聚集调控中金属中心的作用。Pharmaceuticals-Base 2019, 12, 154.
(18) Mukherjee, S.; Madamsetty, V. S.; Bhattacharya, D.; Chowdhury, S. R.; Paul, M. K.; Mukherjee, A. 纳米医学在神经退行性疾病诊疗中的最新进展。Adv.
Funct. Mater. 2020, 30, 2003054.
(19) Liu, W.; Wang, W. J.; Dong, X. Y.; Sun, Y. 近红外光驱动 Janus 纳米马达显著抑制β-淀粉样蛋白纤维化。ACS Appl. Mater. Interfaces 2020, 12, 12618-12628.
(20) Gao, W.; Wang, W.; Dong, X.; Sun, Y. 氮掺杂碳化聚合物点：一种靶向阿尔茨海默病β-淀粉样斑块的高效清除剂与检测器。Small 2020, 16, No. e2002804.
(21) Alemi, M.; Silva, S. C.; Santana, I.; Cardoso, I. 运甲状腺素蛋白稳定性对协助β淀粉样蛋白清除至关重要——运甲状腺素蛋白稳定化在阿尔茨海默病中的意义. 中枢神经科学与治疗学 2017, 23, 605-619.
(22) Ben Khedher, M. R.; Haddad, M.; Laurin, D.; Ramassamy, C. APOE Epsilon4 等位基因对认知障碍未达痴呆标准但转化为阿尔茨海默病受试者循环细胞外囊泡中载脂蛋白 E、J、D 水平及氧化还原特征的影响. 阿尔茨海默病与痴呆症诊断评估与疾病监测 2021, 13, 编号 e12231.
(23) Beeg, M.; Stravalaci, M.; Romeo, M.; Carra, A. D.; Cagnotto, A.; Rossi, A.; Diomede, L.; Salmona, M.; Gobbi, M. 簇集蛋白高亲和力结合 Aβ1-42 寡聚体并通过抑制初级与次级成核干扰多肽聚集. 生物化学杂志 2016, 291, 6958-6966.
(24) Del Campo, M.; Stargardt, A.; Veerhuis, R.; Reits, E.; Teunissen, C. E. BRI2-BRICHOS 胞外域积累与阿尔茨海默病中胰岛素降解酶(IDE)清除 Aβ能力下降相关. 神经科学快报 2015, 589, 4751.
(25) Gharibyan, A. L.; Jayaweera, S. W.; Lehmann, M.; Anan, I.; Olofsson, A. 干扰淀粉样蛋白形成的内源性人类蛋白质。Biomolecules 2022, 12, 446.
(26) Schwarzman, A. L.; Gregori, L.; Vitek, M. P.; Lyubski, S.; Strittmatter, W. J.; Enghilde, J. J.; Bhasin, R.; Silverman, J.; Weisgraber, K. H.; Coyle, P. K.; 等. 转甲状腺素蛋白捕获β淀粉样蛋白并抑制淀粉样斑块形成。Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994, 91, 8368-8372.
(27) Du, J.; Murphy, R. M. β-淀粉样蛋白与转甲状腺素蛋白单体及四聚体相互作用的表征。Biochemistry 2010, 49, 8276-8289.
(28) Costa, R.; Goncalves, A.; Saraiva, M. J.; Cardoso, I. 转甲状腺素蛋白与 Aβ肽段的结合——对 Aβ纤维形成及毒性的影响。FEBS Lett. 2008, 582, 936-942.
(29) Cascella, R.; Conti, S.; Mannini, B.; Li, X.; Buxbaum, J. N.; Tiribilli, B.; Chiti, F.; Cecchi, C. 运甲状腺素蛋白在体外抑制错误折叠蛋白形成的寡聚体毒性。《生物化学与生物物理学报》2013 年第 1832 卷，2302-2314 页。
(30) Link, C. D. 人类β淀粉样肽在转基因秀丽隐杆线虫中的表达。《美国国家科学院院刊》1995 年第 92 卷，9368-9372 页。
(31) Choi, S. H.; Leight, S. N.; Lee, V. M.; Li, T.; Wong, P. C.; Johnson, J. A.; Saraiva, M. J.; Sisodia, S. S. 运甲状腺素蛋白半缺失的 APPswe/PS1deltaE9 小鼠模型中β淀粉样蛋白沉积加速。《神经科学杂志》2007 年第 27 卷，7006-7010 页。
(32) Dubrey, S.; Ackermann, E.; Gillmore, J. 运甲状腺素蛋白淀粉样变性：治疗进展。《研究生医学杂志》2015 年第 91 卷，439-448 页。
(33) Alemi, M.; Gaiteiro, C.; Ribeiro, C. A.; Santos, L. M.; Gomes, J. R.; Oliveira, S. M.; Couraud, P.-O.; Weksler, B.; Romero, I.; Saraiva, M. J.; Cardoso, I. 甲状腺素运载蛋白参与β-淀粉样蛋白从脑部向肝脏的转运——低密度脂蛋白受体相关蛋白 1 的作用机制？《科学报告》2016 年第 6 卷，文章编号 20164。
(34) Giao, T.; Saavedra, J.; Cotrina, E.; Quintana, J.; Llop, J.; Arsequell, G.; Cardoso, I. 甲状腺素运载蛋白的未知功能：从转运蛋白到阿尔茨海默病的新治疗靶点。《国际分子科学杂志》2020 年第 21 卷，第 2075 页。
(35) Serot, J. M.; Christmann, D.; Dubost, T.; Couturier, M. 脑脊液甲状腺素运载蛋白：衰老与晚发型阿尔茨海默病的关系。《神经病学、神经外科与精神病学杂志》1997 年第 63 卷，第 506-508 页。
(36) Ribeiro, C. A.; Santana, I.; Oliveira, C.; Baldeiras, I.; Moreira, J.; Saraiva, M. J.; Cardoso, I. 轻度认知障碍与阿尔茨海默病患者血浆甲状腺素运载蛋白水平下降：疾病调节机制的探究。《当代阿尔茨海默病研究》2012 年第 9 卷，第 881-889 页。
(37) Tooyserkani, R.; Lipinski, W.; Willemsen, B.; Lowik, D. 通过二硫键形成激活细胞穿透肽片段. 氨基酸 2020, 52, 1161-1168.
(38) Liu, L.; Hou, J.; Du, J. L.; Chumanov, R. S.; Xu, Q. G.; Ge, Y.; Johnson, J. A.; Murphy, R. M. Cys10 位点差异化修饰改变转甲状腺素蛋白对β-淀粉样蛋白聚集及毒性的调控作用. 蛋白质工程设计与选择 2009, 22, 479-488.
(39) Tsuzuki, K.; Fukatsu, R.; Yamaguchi, H.; Tateno, M.; Imai, K.; Fujii, N.; Yamauchi, T. 转甲状腺素蛋白结合淀粉样β肽（Aβ1-42 与 Aβ1-40）在人类尸检肾脏中形成复合物——转甲状腺素蛋白对 Aβ隔离的潜在作用. 神经科学快报 2000, 281, 171-174.
(40) Ghadami, S. A.; Chia, S.; Ruggeri, F. S.; Meisl, G.; Bemporad, F.; Habchi, J.; Cascella, R.; Dobson, C. M.; Vendruscolo, M.; Knowles, T. P. J.; 等. 转甲状腺素蛋白抑制淀粉样β肽聚集的初级与次级成核过程并降低其寡聚体毒性. 生物大分子 2020, 21, 1112-1125.
(41) Liu, L.; Murphy, R. M. 运甲状腺素蛋白抑制β-淀粉样蛋白聚集的动力学研究. 生物化学 2006, 45, 15702-15709.
(42) Quintas, A.; Saraiva, M. J.; Brito, R. M. 四聚体蛋白运甲状腺素蛋白在溶液中解离为非天然单体：淀粉样蛋白生成的新模型. 生物化学杂志 1999, 274, 32943-32949.
(43) Lai, Z.; Colon, W.; Kelly, J. W. 运甲状腺素蛋白的酸介导变性途径产生可自组装成淀粉样蛋白的构象中间体. 生物化学 1996, 35, 6470-6482.
(44) Blake, C. C.; Geisow, M. J.; Oatley, S. J.; Rerat, B.; Rerat, C. 前白蛋白结构：通过 1.8 埃傅里叶精修确定的二级、三级和四级相互作用. 分子生物学杂志 1978, 121, 339-356.
(45) Bertrand, J. R.; Malvy, C.; Auguste, T.; Toth, G. K.; KissIvankovits, O.; Illyes, E.; Hollosi, M.; Bottka, S.; Laczko, I. 细胞穿透肽的合成与研究. 生物共轭化学. 2009, 20, 1307-1314.
(46) Yang, L. C.; Cui, Y. N.; Liang, H. J.; Li, Z. W.; Wang, N.; Wang, Y. B.; Zheng, G. D. 不同表面修饰的多功能硒纳米颗粒通过肠道菌群-NLRP3 炎症小体-脑轴改善 APP/PS1 小鼠的神经炎症. 美国化学会应用材料与界面. 2022, 14, 30557-30570.
(47) Economou, N. J.; Giammona, M. J.; Do, T. D.; Zheng, X.; Teplow, D. B.; Buratto, S. K.; Bowers, M. T. β-淀粉样蛋白聚集与阿尔茨海默病：Aβ42 十二聚体而非 Aβ40 可引发纤维形成. 美国化学会志. 2016, 138, 1772-1775.
(48) Agrawal, N.; Skelton, A. A. 阿尔茨海默病β淀粉样蛋白从单体到纤维的结构与功能研究综述. 蛋白质杂志. 2019, 38, 425-434.
(49) 李翔; 谢柏林; 孙洋. 碱化人溶菌酶：一种高效抑制β-淀粉样蛋白纤维化的抑制剂. 朗缪尔 2018, 34, 15569-15577.
(50) 王伟杰; 刘伟; 徐思远; 董晓阳; 孙洋. 基于碱化血清白蛋白的多功能制剂设计用于高效体内β-淀粉样蛋白抑制与成像. 美国化学会应用生物材料 2020, 3, 3365-3377.
(51) 梁勇. 等温滴定量热法在蛋白质科学中的应用. 生物化学与生物物理学报 2008, 40, 565-576.
(52) 刘瑞阳; 杨健; 邱晓阳; 纪文浩; 沈洁; 李岩; 卢志刚; 吴永毅; 王伟力; 王静; 等. 具有时空分离特性的"级联火箭"纳米系统用于阿尔茨海默病三重协同治疗. 先进医疗材料 2022, 11, 编号2101748.
(53) 张宏; 姜伟; 赵阳; 宋涛; 席勇; 韩刚; 金毅; 宋明; 白坤; 周杰; 等. 受脂蛋白启发的纳米清除剂在阿尔茨海默病治疗中实现小胶质细胞源性神经炎症的三重调控. 《纳米快报》2022年第22卷, 第2450-2460页.
(54) 徐明明; 周航; 刘亚男; 孙静; 谢文杰; 赵鹏; 刘杰. 超声激发的原卟啉 IX 修饰多功能纳米颗粒作为 Tau 蛋白磷酸化和β-淀粉样蛋白聚集的强效抑制剂. 《美国化学会应用材料与界面》2018 年第 10 卷, 第 32965-32980 页.
(55) 王欣; 张伟; 侯磊; 耿伟; 王晶; 孔毅; 刘超; 曾祥; 孔德. 基于仿生上转换纳米诱饵的近红外光引导光动力疗法通过抑制β-淀粉样蛋白聚集缓解阿尔茨海默病. 《先进医疗材料》2023 年, 编号 e2303278.
(56) 尹翔; 周航; 张敏; 苏静; 王欣; 李松; 杨震; 康振; 周荣. C₃N 纳米点抑制阿尔茨海默病中 Aβ肽聚集的致病途径. 《自然·通讯》2023 年第 14 卷, 第 5718 页.
(57) Micsonai, A.; Moussong, E.; Wien, F.; Boros, E.; Vadaszi, H.; Murvai, N.; Lee, Y. H.; Molnar, T.; Refregiers, M.; Goto, Y.; 等. BeStSel：基于蛋白质圆二色谱的二级结构与折叠预测网络服务器. 核酸研究 2022, 50, W90-W98.
(58) 刘芳; 王洋; 桑晶; 魏伟; 赵伟; 陈斌; 赵峰; 贾力; 卢福. 巴西苏木素抑制α-突触核蛋白纤维形成、解聚成熟纤维并保护淀粉样蛋白诱导的细胞毒性. 农业与食品化学杂志 2019, 67, 11769-11777.
(59) 王峰; 王洋; 姜磊; 王伟; 桑晶; 王欣; 卢福; 刘芳. 食品添加剂坚牢绿 FCF 抑制α-突触核蛋白聚集、解聚成熟纤维并保护淀粉样蛋白诱导的神经毒性. 食品功能 2021, 12, 5465-5477.
(60) Nguyen, P. T.; Zottig, X.; Sebastiao, M.; Bourgault, S. 位点特异性天冬酰胺脱酰胺化在胰岛淀粉样多肽淀粉样形成中的作用：第 14 和 21 位残基的关键贡献. 生物化学 2017, 56, 3808-3817.
(61) 韩广超, 白开伟, 杨晓燕, 孙春华, 纪阳, 周建平, 张海清, 丁一. 基于仿生脂质纳米复合组装的"药物-载体"协同疗法实现β淀粉样蛋白清除及 tau 蛋白磷酸化抑制. 先进科学, 2022, 9, 2106072.
(62) Clarke, J. M.; Gillings, M. R.; Altavilla, N.; Beattie, A. J. 天然产物抗菌活性检测中荧光素二乙酸酯细胞活力测定法的潜在问题. 微生物学方法杂志, 2001, 46, 261-267.
(63) Samanta, A.; Paul, B. K.; Guchhait, N. 生物模拟胶束与鱼类精子基因组 DNA 中 DNA 染色剂碘化丙啶的光物理特性. 光化学与光生物学 B 辑, 2012, 109, 58-67.
(64) 李超, 王宁, 郑刚, 杨力. 口服白藜芦醇-硒-肽纳米复合物通过抑制 Aβ聚集和调节肠道菌群缓解阿尔茨海默病样病理. ACS 应用材料与界面, 2021, 13, 46406-46420.
(65) 欧阳强; 刘凯; 朱琦; 邓辉; 乐毅; 欧阳文; 严晓; 周伟; 童俊. 兼具脑穿透与神经元靶向功能的 DNA 纳米花共递送 miR-124 和芦丁协同治疗阿尔茨海默病.《Small》2022 年第 18 卷，论文编号 e2107534.
(66) 柯剑; 余超; 李松; 洪洋; 徐阳; 王坤; 孟涛; 平毅; 付强; 袁航; 胡飞. 多功能递送系统联合血脑屏障可逆开放策略增强阿尔茨海默病治疗效果.《先进医疗材料》2023 年，论文编号 e2302939.
(67) 李志伟; 郑国栋; 王宁; 梁红杰; 李长军; 王玉波; 崔艳安; 杨立才. 花状脑靶向硒纳米簇降低绿原酸改善 APP/PS1 小鼠认知障碍的剂量.《农业与食品化学杂志》2023 年第 71 卷，2883-2897 页.
(68) 加西亚-莫雷诺·J·C; 波尔塔·德拉里瓦·M; 马丁内斯-拉拉·E; 西莱斯·E; 卡努埃洛·A. 橄榄油简单酚类酪醇靶向帕金森病线虫模型神经退行性变的多种致病机制.《神经生物学衰老》2019 年第 82 卷，6068 页.
(69) Aderinwale, T.; Bharadwaj, V.; Christoffer, C.; Terashi, G.; Zhang, Z.; Jahandideh, R.; Kagaya, Y.; Kihara, D. AlphaFold 蛋白质模型的实时结构搜索与结构分类. 通讯-生物学 2022, 5, 316.
(70) Jumper, J.; Evans, R.; Pritzel, A.; Green, T.; Figurnov, M.; Ronneberger, O.; Tunyasuvunakool, K.; Bates, R.; Zidek, A.; Potapenko, A.; 等. 基于 AlphaFold 的高精度蛋白质结构预测. 自然 2021, 596, 583-589.
(71) van Zundert, G. C. P.; Rodrigues, J. P. G. L. M.; Trellet, M.; Schmitz, C.; Kastritis, P. L.; Karaca, E.; Melquiond, A. S. J.; van Dijk, M.; de Vries, S. J.; Bonvin, A. M. J. J. HADDOCK2.2 网络服务器：用户友好的生物分子复合体整合建模平台. 分子生物学杂志 2016, 428, 720-725.
(72) Honorato, R. V.; Koukos, P. I.; Jimenez-Garcia, B.; Tsaregorodtsev, A.; Verlato, M.; Giachetti, A.; Rosato, A.; Bonvin, A. 云端结构生物学：WeNMR-EOSC 生态系统. 分子生物科学前沿 2021, 8, 文献编号 729513.
  1. 收稿日期：2024年2月20日
    修回日期：2024年2月26日
    录用日期：2024年2月27日
    出版日期：2024年3月7日