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炎症性肠病 (IBD)，包括溃疡性结肠炎 (UC) 和克罗恩病 (CD)，是一种以肠道炎症为特征的慢性疾病。几乎所有类型的肠道细胞，包括免疫细胞、上皮细胞和基质细胞，均已在这些疾病中被报道发生改变。IBD 的研究历来依赖于批量转录组学，但这种方法会平均不同细胞类型的信号，从而限制了研究的深入。单细胞组学技术克服了批量分析的固有局限性，并以逐个细胞的分辨率揭示了多细胞组织的复杂性。在健康和炎症的肠道组织中，单细胞组学，尤其是单细胞 RNA 测序，有助于发现与疾病活动或并发症发展相关的新型细胞类型和细胞功能。总而言之，这些结果有助于确定难治性并发症的治疗靶点，例如纤维狭窄、脂肪匍匐堆积、肛周瘘或袋状炎症。近年来，单细胞组学逐渐被应用于研究，以了解治疗反应、识别药物失效机制以及开发具有临床应用潜力的预测因子。尽管目前尚处于起步阶段，但此类研究为将新技术应用于疾病诊断、监测和预后预测的临床实践奠定了基础。本综述旨在全面概述将单细胞组学应用于溃疡性结肠炎 (UC) 或克罗恩病 (CD) 研究的研究，并就这些研究的主要发现提出我们的观点。最后，我们探讨了将单细胞组学整合到临床实践和药物研发中的局限性以及可能带来的潜在益处。
- CROHN'S DISEASE
- IBD
- ULCERATIVE COLITIS
- RNA EXPRESSION
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单细胞组学在炎症性肠病研究中的优势
炎症性肠病 (IBD)，包括溃疡性结肠炎 (UC) 和克罗恩病 (CD)，是一组导致肠道炎症的慢性疾病。虽然驱动这些疾病的机制尚不清楚，但我们知道，它们可能是由遗传易感个体对共生微生物抗原的免疫反应失调引起的。重要的是，几乎所有肠道细胞类型，包括免疫细胞、上皮细胞和基质细胞，在 IBD 患者中均有报道出现显著变化。
几十年来，对这些疾病潜在机制的研究一直依赖于免疫表型分析或组织或血液的批量转录分析等技术。然而，批量方法会从大量细胞中生成基因组数据，并将样本中所有细胞类型的信号平均化。这是一个显著的局限性，尤其是在肠道等复杂组织中，因为其中存在多种细胞类型和/或细胞状态。
单细胞组学技术的出现1为克服体细胞组学的固有局限性提供了机会，可以在逐个细胞的分辨率下揭示多细胞组织的复杂性。事实上，一项前所未有的国际合作正在进行中，以生成所有人体细胞的参考图谱：人类细胞图谱（ HCA ）2 3 （https://data.humancellatlas.org/ ），最近发布了肠道细胞图谱的初稿4 。在 HCA 内部，肠道生物网络正在积极致力于生成人类肠道单细胞组学数据集的扩展库，其中包括来自 IBD患者的大量数据集。该生物网络正在整合和共识注释数百万个细胞转录组，并提供详细的患者元数据，这将成为科学界的宝贵资源5 。整合大型 IBD患者队列对于涵盖疾病的内在异质性至关重要，而研究小型患者队列时可能不一定能反映出这种异质性。例如，对大量细胞进行协调可能会提高揭示可能隐藏在单个数据集中的稀有细胞亚群的能力。在此背景下，全面的整合分析，例如 scIBD 6 （包括来自 UC、CD 和对照的 12 个数据集，涵盖113 万个细胞，http://scibd.cn ）或 Oliver等人最近发表的单细胞整合全胃肠道细胞图谱4 （来自整个胃肠道的 37 个数据集，共涵盖160 万个细胞，包括 UC、CD 和对照，gutcellatlas.org ），都是 IBD 界的宝贵资源。
自首个IBD单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集发布以来，已有数百万个肠道细胞得到分析（在线补充表1）。该方法对单个细胞的RNA进行分析，并根据其转录组相似性识别细胞群体/状态。此外，该方法还可以与表观基因组学和蛋白质组学数据整合，以更好地表征特定基因在特定细胞类型中的功能。
单细胞组学相较于传统方法具有诸多优势。首先，通过使用scRNA测序，研究人员能够以前所未有的分辨率绘制不同组织和条件下细胞类型的多样性图谱。目前，肠黏膜中至少已鉴定出60-80种不同的细胞类型或细胞状态。稀有细胞类型和新型细胞标记物已被描述，这不仅有助于我们了解这些细胞的功能，还可用于在不同样本和技术之间追踪它们。其次，可以测量不同疾病表型和状态下所有细胞类型的细胞丰度变化，从而对组织成分的变化进行客观评估。第三，纵向研究表明，对细胞区室（包括稀有亚群）进行转录分析可以揭示不同疾病状态下基因表达的变化，这对于药物反应研究尤为重要。
最近，各种空间组学方法已经面世，可以在组织切片上以单细胞分辨率测量基因和蛋白质的表达8–10。虽然这是一个新兴领域，但由于其在原位揭示细胞间相互作用和细胞微环境方面的潜力，它已迅速被转化医学所采用11 12。
在本综述中，我们旨在全面概述将单细胞组学应用于溃疡性结肠炎 (UC) 或克罗恩病 (CD) 的研究，阐述我们对主要研究结果相关性的看法，并讨论我们认为在不久的将来最有可能的应用。我们的目标是为 IBD 领域的研究人员提供资源，无论他们之前是否具备这些技术的应用知识或经验。
技术概述
单细胞（包括空间分辨）技术的数量持续增长8 10 13 14。大多数检查 IBD 患者样本的研究都使用了基于液滴的总 RNA 测序 (scRNA-seq)，而少数研究应用了单核 RNA 测序或单细胞表观基因组分析（图 1）。这些方法依靠流体技术将单个细胞或单个细胞核捕获到含有 DNA 条形码珠子的油滴中。捕获总 RNA 并对其进行条形码编码，以便可以通过转录成 cDNA、下游扩增和测序将读取内容追溯到单个基因。其他 scRNA-seq 方法包括纳米孔（Seq-well、BD Rhapsody）、微流体方法（Fluidigm C1）和基于板的方法（Smart-seq2），并在其他评论和基准论文13 15 16中进行了详细描述。类似地，捕获 DNA 进行表观遗传分析的应用（转座酶可及染色质测序 -ATAC-seq-、染色质免疫沉淀后测序 -ChiP-seq-）已经实现（详见17 18）并应用于 IBD 研究19 20。此外，单细胞 T 细胞受体（TCR）和 B 细胞受体（BCR）测序可以追踪单个克隆以及细胞表型与克隆扩增和免疫细胞库多样性的相关性21–24。最近，单细胞多组学方法的进展（详见10 14）例如转录组和表位的细胞索引（CITE-seq）和 10x Multiome（RNA-seq 和 ATAC-seq）和综合计算流程25使得同时分析同一细胞上的几种模态成为可能。
炎症性肠病 (IBD) 研究中使用的单细胞和空间技术概述。(A) 在 IBD 研究中，scRNA-seq 分析采用了不同的样本处理策略。通常，新鲜或冷冻保存的肠道组织（来自活检或手术切除）经酶消化后获得单细胞悬浮液。在某些情况下，某些类型的细胞会使用 FACS 或磁性分选方法进行富集。或者，也可以使用从新鲜冷冻组织中分离的单细胞核作为起始材料。(B) IBD 研究中用于单细胞和单核转录组分析的主要悬浮方法总结。(C) 单细胞组学技术涵盖多种模式。单模式方法包括分析来自 DNA 的基因组和表观基因组数据（例如染色质可及性、DNA 甲基化和组蛋白修饰）、来自 RNA 的转录组数据以及来自免疫组库和蛋白质的数据。单细胞多组学方法（详见10 14），例如CITE-seq和10x Multiome（RNA-seq和ATAC-seq），能够同时分析同一细胞的多种模式。空间技术能够将细胞类型和细胞状态的信息置于相关组织的背景下。（D）IBD研究中RNA分析的空间分辨方法概述。（E）用于IBD样本分析的主要蛋白质分析空间分辨平台。图片使用BioRender创建。ATAC-seq，转座酶可及染色质测序；CITE-seq，转录组和表位的细胞索引；scRNA-seq，单细胞RNA测序；snRNA-seq，单核RNA测序。
空间转录组学是指对组织切片上的 RNA 分子进行定量分析。现有的方法（图 1）在细胞分辨率、转录组覆盖度、成本、商业可用性以及对固定或冷冻组织的适用性方面各不相同。所有这些因素都会影响其适用性和最终在临床中的应用。标准 Visium（10x Genomics）可以进行全转录组测序，但缺乏单细胞分辨率。该方法将捕获细胞的 RNA 组合到底层载玻片上的预定点（半径为 55µm）中，点之间间隔 100µm。因此，尽管覆盖度相对较高且仅受测序深度的限制，但它缺乏单细胞分辨率。为了解决这个问题，还开发了用于 Visium 点的细胞反卷积（例如 Cell2location）26和空间细胞共现分析27的计算方法（有关空间分析计算工具的摘要，请参阅 Gulati等人）28。另外，其他空间平台如 Vizgen MERSCOPE 或 NanoString CosMx，基于预先设计的探针的连续杂交和高分辨率成像，也已应用于 IBD 研究29 30。虽然可以使用细胞分割方法将转录本分配到单个细胞，但目前可用的技术对于最新版本的 CosMx 每个样本最多可测量 6000 个基因。其他基于探针的平台，如 10x Genomics 的 Xenium，采用高信噪比的预定义基因集的原位测序。虽然提高细胞分辨率（即具有 2µm 2箱的 Visium HD）和基因覆盖率（基于全转录组探针的方法）的改进方法正在变得可用，但目前还没有使用这些最新技术的 IBD 公共数据集。
空间蛋白质组学方法，例如通过索引进行共检测（CODEX，现为 Phenocycler）或成像质谱流式细胞术（飞行时间流式细胞术 -CyTOF-），将亚细胞分辨率的形态学分析与空间分辨的蛋白质表达相结合，为组织解离单细胞方法提供了补充信息，为了解健康肠道中的多细胞结构生态位和分区模式增加了新的见解31 32。一些研究已经将这些空间蛋白质组学方法应用于 IBD 样本33–38。作为一个限制，这些方法依赖于数量减少的抗体靶标，使其不适合发现新的细胞类型。此外，已经开发出新的协议，将基于测序（Visium）和基于抗体（CODEX）的空间分析结合在同一载玻片上39。我们预见整合多组学方法的新空间方法将在未来几年内开发出来。
IBD 的单细胞组学研究为了解所有肠道谱系的细胞变化提供了新的见解
将scRNA-seq应用于肠道组织的研究通常使用多种样本处理策略，包括完整的消化切除/活检样本或分选细胞（例如CD45+细胞、T细胞或上皮细胞）（在线补充表1）。无论采用何种实验方法，我们都整合了scRNA-seq的主要发现，这些发现加深了我们对IBD中各细胞区室（例如上皮细胞、基质细胞或免疫细胞）的组成和潜在作用的理解，并重点介绍了一些基于空间组学的发现。
上皮
在炎症期间，上皮细胞的数量会显著减少，尤其是在 UC 患者的粘膜中29 ，这种情况下浅表溃疡更常见。根据 scRNA-seq 数据（在线补充表 1），IBD 患者的上皮发生了两个主要变化：再生能力增强和获得炎症特征。为了促进增强的增殖能力，正常分化受到干扰并偏向分泌谱系。这反映在杯状细胞与肠细胞相比的富集（特别是在回肠40）和隐窝底部表型的获得，其中隐窝底部限制基因（即OLFM4、SPINK4或SPINK1）在发炎粘膜的整个隐窝轴中表达29 41。在炎症组织中常见的另一个事件是终末分化细胞（即AQP8、KRT20）42失去谱系分化标志物。这强调了它们的去分化能力，这种能力此前已在炎症或致癌损伤后的肠道类器官中观察到43 44。此外，增殖细胞和非增殖细胞在活动性疾病期间会显着改变其转录组，从而导致新的细胞状态。肠道细胞和杯状细胞中的炎症相关细胞状态可能由共同的上游调节器驱动，正如最近对转录因子 STAT3 42提出的一样。IBD 数据集中常见的新细胞群是 DUOX2+ 或 LND（LCN2、NOS2和DUOX2）肠细胞，它们获得宿主防御和抗菌基因的表达29 45。虽然这些细胞状态在溃疡性结肠炎 (UC) 和克罗恩病 (CD) 患者中均有观察到，但炎症性 CD 患者中存在大量高表达磷脂酶PLCG2 的肠细胞46。在活动性 CD 中观察到的其他改变与代谢物感应和激素分泌的肠内分泌细胞 (EEC) 有关。尽管这类改变罕见且难以通过 scRNA 测序捕获，但通过对大量患者进行测序，我们得以识别出不同亚型的 EEC。这些 EEC 在炎症期间会发生代谢变化，这可能会影响其分泌功能及其与神经系统沟通的能力40。。令人惊讶的是，LGR5+ 干细胞的频率在 IBD 样本中几乎没有变化，这表明上皮再生可能依赖于其他细胞类型，包括暂时重编程为胎儿阶段的细胞和通过 Wnt 独立信号增殖的细胞47 48。与该假设一致的是，与非炎症或健康患者不同，儿童 CD 患者的炎症上皮表达与胚胎和胎儿上皮共享的转录因子49。分化改变的其他证据是在患病样本中发现了小肠（Paneth 样细胞4 29）和胃化生细胞（MUC1 40或MUC5AC和MUC6 4）。重要的是，scRNA-seq 分析表明，与健康细胞相比，化生细胞存在转录组差异，包括炎症基因的表达4。总的来说，这表明，在再生未得到满足的情况下，上皮细胞可能能够重新编程，并产生具有潜在炎症作用的化生细胞。
总体而言，scRNA-seq 使我们能够阐明每种上皮细胞类型的基因特征，推断其功能和个体发育，并识别炎症诱导和消退阶段所必需的转录程序。
基质
肠道组织的scRNA测序对成纤维细胞亚型的定义和表征在稳态和疾病状态下的差异有显著贡献。除了肌成纤维细胞/平滑肌细胞（ACTA2、MYH11）和成纤维细胞网状细胞（CCL19、CCL21）50外，在健康肠道scRNA测序数据集中，还有三种不同的成纤维细胞亚型被一致报道：固有层（LP）S1/ADAMDEC1+/ABCA8+成纤维细胞、上皮下S2/SOX6+/F3+成纤维细胞以及下层隐窝/黏膜下S3/GREM1+/RSPO3+成纤维细胞51–56（图2）。这些独特成纤维细胞群的鉴定强调了肠成纤维细胞在健康肠道中所能发挥的多种功能及其在炎症背景下的显著可塑性52 53 57 。在 IBD 中，Kinchen等人57首次描述的炎症相关成纤维细胞 (IAF 或 S4) 群通常伴有稳态成纤维细胞的减少7 40 57。此外，稳态成纤维细胞（特别是 LP/S1 和粘膜下/S3 成纤维细胞）也通过诱导参与炎症、纤维化和组织修复的基因表达（即TNFRSF11B、INHBA、CHI3L1、MMP3）7 40 58获得炎症样特征。这表明在以促炎基因表达增加为特征的疾病背景下成纤维细胞区室的适应性。虽然 IAF 等炎症相关细胞类型的出现并不一定意味着疾病的因果关系，但 IAF 可能通过产生趋化因子和促炎细胞因子（CXCL5、CXCL1、IL11和IL6）以及表达细胞因子受体（TNFRSF1A、TNFRSF1B或OSMR）来增强炎症反应。对来自不同炎症条件的样本进行跨组织分析，揭示了一个共同的成纤维细胞活化程序，参与与 T 细胞（CXCL10、CCL19）和血管（SPARC、CTHRC1）的通讯57 59。根据研究数据集以及队列中是否包括具有复杂表型的患者样本，IAF 可能呈现不同的基因标记和不同的空间位置20 58 60。这些观察结果加强了成纤维细胞的可塑性，并且强烈表明 IAF 可能存在于尚未报道的多种转录不同状态中。相反，在肌成纤维细胞中，在大型患者队列数据集中描述了两个簇：胶原阳性的 HHIP+NPNT+ 和胶原阴性的 GREM1+GREM2+ 肌成纤维细胞群40。这项研究确定了一组参与向胶原蛋白生成细胞转变的基因，其中三个在功能丧失分析中被证实是原代人肠成纤维细胞产生 TGFβ 依赖性胶原蛋白所必需的（CHMP1A、TBX3、RNF168）。这一发现具有相关性，因为胶原蛋白阳性的 HHIP+NPNT+ 肌成纤维细胞群体不是在结肠中扩增，而是在 CD 患者的回肠末端扩增，而纤维化狭窄通常发生在该部位。
基于单细胞组学数据，观察活动性炎症性肠病 (IBD) 患者黏膜的细胞改变。(A) 为了促进再生，增殖区扩大，分泌相关基因（如 OLFM4）的表达增加。除了表达来自其他胃肠道区域（如胃部）基因的细胞（胃化生）外，还可能出现与胎儿上皮相关的基因（胎儿重编程细胞）。可能观察到溃疡区域，上皮丢失，两侧是萎缩的上皮。终末分化的 AQP8+ 肠细胞丢失，同时出现具有抗菌和防御特性的细胞类型/状态（LND 肠细胞）。(B) 在炎症中也观察到稳态成纤维细胞（即 S1/ABCA8+、S2/SOX6+ 和 S3/GREM1+ 亚型）。我们认为可能存在不同类型的 IAF，它们具有不同的位置和转录组特征。肌成纤维细胞存在于固有层，并且已经描述了两种基于胶原基因表达的转录状态。一层平滑肌细胞形成粘膜肌层并将粘膜与粘膜下层分开，在最复杂的 IBD 表型中，粘膜下层可能会发生变化（即增生）。被周细胞包围的内皮细胞也呈现活化状态（内皮发炎）。（C）IBD 中的先天免疫细胞和适应性免疫细胞都会发生改变。cDC2、肥大细胞、中性粒细胞、单核细胞和炎性巨噬细胞（表达促炎细胞因子和趋化因子）在 IBD 患者的粘膜中富集。表达SELL、CD193和CD69的中性粒细胞在隐窝脓肿和溃疡区域中含量丰富。在 IBD 炎症组织中发现了一种新的 IDA 巨噬细胞群。B 细胞区室也发生了重塑，出现了新的表型，例如 IFN 引发的幼稚细胞，并且浆细胞池偏向于新近募集且突变较少的 IgG1 产生浆细胞。T 细胞区室的组成发生了改变，表达 IL-17 的效应 T 细胞比例高于驻留 T 细胞，并且 CD8+CD4+ T 细胞的比例增加，尤其是在上皮中。此外，IBD 患者粘膜显示耗竭 T 细胞和表达 IL-26 的活化 T 细胞增多。Treg 细胞通常增多并表达 TNF，但其抑制功能可能受损。此外，在炎症的 IBD 组织中发现了具有 Tfh 表型的 CXCL13+ 细胞（Tph 细胞）。图片由 BioRender 创建。cDC2s，常规 2 型树突状细胞； IAF，炎症相关成纤维细胞；IDA，炎症依赖性替代巨噬细胞；IEL，上皮内淋巴细胞；LND 肠细胞、LCN2、NOS2和DUOX2表达肠细胞；Mac，巨噬细胞；Mono，单核细胞；Neutro，中性粒细胞；PC，浆细胞；Tfh，滤泡辅助性T细胞；Tph，Tfh样外周辅助性T细胞；Treg，调节性T细胞。
除了成纤维细胞外，基质区还包括内皮细胞（PLAVP、VWF）和壁细胞，后者主要对应于周细胞（RGS5、NOTCH3）。所有这些细胞在炎症期间都会显著扩增7 40 57。此外，在IBD中会出现炎症特异性内皮细胞簇，表达ACKR1 / DARC和SELP。
空间转录组学有助于将细胞类型和转录本置于组织结构中。最近一项结合 scRNA 测序、流式细胞术和高内涵成像（空间蛋白质组学）的研究描绘了非炎症组织以及 IBD（UC 和 CD）组织中不同基质亚群沿肠道各层（粘膜、粘膜下层和肌层）的定位52。另一项研究在 UC 组织切片上采用常规 Visium 和新颖的计算方法进行细胞共现分析，发现了包含与炎症相关的 M 细胞和成纤维细胞的细胞网络27。访问包含更多基质细胞的综合图谱，并将它们映射到空间转录组学数据集上，将拓宽我们对所有基质细胞类型的理解，我们才刚刚开始解开这些类型的复杂性。
免疫细胞
IBD 发病机制涉及免疫反应失调，影响免疫系统的先天性和适应性分支。最近的单细胞研究发现，与对照组相比，IBD 患者体内富含几种髓系细胞类型，包括 2 型树突状细胞、肥大细胞、中性粒细胞、单核细胞和炎性巨噬细胞7 29 36 40。IBD 样本中的中性粒细胞明显增加61，但使用基于液滴的测序平台分析这些细胞通常具有挑战性，因为它们脆弱且 mRNA 含量低62。因此，中性粒细胞在大多数 scRNA-seq 数据集中缺失或代表性不足。通过采用单细胞和空间方法，Garrido-Trigo等人证明，在 IBD 的隐窝脓肿和溃疡区域中积聚的中性粒细胞表现出不同的表型29。
尽管巨噬细胞的适应性和可塑性早已被认识到，但 scRNA-seq 研究强调了它们的高度异质性（Hegarty等人63进行了总结）。在 IBD 中，除中性粒细胞外，表达钙卫蛋白 ( S100A8/S100A9 )的髓系细胞类型，例如单核细胞 ( VCAN、FCN1、CD300E high、CD14 high、CCR2 ) 和炎症巨噬细胞（单核细胞标志物FCN1和SELL表达较低），也被发现与活动性炎症密切相关7 29 36 40 64。炎症巨噬细胞优先表达趋化因子（CXCL2、CXCL3、CXCL8）和细胞因子（IL23、IL6、IL1B、IL1A、TNF和OSM），而驻留巨噬细胞则表现出C1QA/B/C、CSF1R和MARCO 7 36的更高表达。此外，在结肠 UC 和 CD 样本中还发现了一群此前未描述的炎症依赖性替代 (IDA) 巨噬细胞29。这些发现强调了在炎症肠道中巨噬细胞的转录多样性状态。
浆细胞是 IBD 炎症组织中最丰富的淋巴细胞群，它们的扩增与疾病复发的高风险相关65。scRNA-seq 研究一致发现，健康结肠以 IgA1/IgA2 浆细胞为主，而发炎的 UC 样本中含有倾向于产生 IgG1 的浆细胞7 36 66–68，这与早期免疫组织化学研究的结果一致69。最近的一项研究证实，在发炎的 CD 中也有 IgG+ 浆细胞扩增，尽管程度低于在 UC 中观察到的46。单细胞方法表明，UC 中的 B 细胞区室已完全重塑，循环浆母细胞和新近募集的浆细胞积聚，并出现新的表型，例如 IFN 引发的幼稚 B 细胞66 67。单细胞方法可以通过分析其独特的 BCR 来追踪 B 细胞和浆细胞克隆。这项分析表明，从 UC 患者中分离出的 IgG 浆细胞比健康个体的 IgA 浆细胞显示的 VDJ 突变更少67，这表明其来源于滤泡外。此外，在 UC 炎症结肠中检测到了 CXCL13+ 滤泡辅助性 T 细胞 (Tfh) 样外周辅助性 T 细胞。这些细胞可能促进缺乏生发中心的炎症相关淋巴聚集体的形成，这可能是诱导突变较少的浆母细胞的原因。值得注意的是，scRNA-seq 有助于解开浆细胞可能增强局部炎症的细胞回路。克隆扩增的 IgG1 浆细胞可能通过 FcγR 募集炎症单核细胞和辅助性 T 细胞 17 (Th17)。此外，这些扩增的浆细胞和浆母细胞表达CXCR3，这可能与CXCL9+炎症巨噬细胞相互作用37 67，提示炎症在启动幼稚B细胞和IgG应答中发挥作用。此外，炎症样本中的浆细胞MHC-II抗原呈递基因表达增加66，这与乳糜泻等其他炎症疾病的表达一致70。总之，这些结果表明B细胞应答可能直接影响炎症T细胞应答。
与非炎症组织相比，IBD 炎症样本的 T 细胞丰度发生了改变，异常激活的 T 细胞通过 CD 和 UC 中的细胞因子和趋化因子分泌促进炎症。通过分别观察 LP 和上皮内淋巴细胞 (IEL) T 细胞区室，Jaeger 及其同事发现，与对照组相比，炎症 CD 样本中的 CD8+ 和 γδ IEL 减少，而 CD4+ IEL 增加71。然而，这种趋势与 LP 中观察到的趋势相反，LP 中 CD8+ T 细胞数量增加，总 CD4+ T 细胞减少。在 LP CD4+ T 细胞中，与非炎症组织相比，CD 炎症组织中的炎性 Th17 细胞显著增加，调节性 T 细胞 (Tregs) 和 Tfh 细胞比例较低71 。相反，与 UC 46相比，Th1 细胞在发炎的 CD 中特异性扩增。Treg 是组织稳态和对共生细菌耐受的重要参与者，它们的数量通常在炎症环境中增加。对 UC 的单细胞研究表明，炎症样本中的 Treg 比例高于对照组7 68，CD 和 UC 样本中的基因表达均发生了改变，趋向于促炎特征7 68 72 。有趣的是，Treg 是UC 样本中TNF的主要来源7，并被发现在 CD 患者的回肠末端表达促炎 TNF-alpha 反应基因特征72 。Boland 和他的同事发现 Treg 中ZEB2表达丰富，这可能与 Treg 抑制功能受损有关68。根据这些发现，Kosinsky 和他的同事发现 CD 中的 Treg 抑制活性受损，体外细胞因子反应更高72。最近一项使用肝幽门螺杆菌小鼠模型的研究强调了不同组织微生态位和局部细胞通讯网络在塑造Treg效应功能方面的重要性。值得注意的是，这种空间区域化在炎症期间会受损73。我们设想，未来采用空间转录组学方法的研究将有助于阐明Treg的功能异质性及其在IBD发病机制中的参与。
UC 炎症样本还显示出 CD8+ T 细胞库的变化，从驻留表型转变为效应/炎症状态，炎症和细胞毒性增强7 68 74。CD8 + T 细胞呈现最高的IL17表达，其中一些共表达CD4 7。此外，增加的 T 细胞表现出耗竭表型（PDCD1、HAVCR2、CTLA4），类似于肿瘤浸润细胞74，其中 CD8+ CTLA4hi TIGIThi T 细胞在炎症 UC 46中特异性增加。通过分析 TCR 库，Corridoni等人发现表达IL26的克隆扩增效应 CD8+ T 细胞随着炎症程度的增加而增加74。在UC患者的血液中也检测到了扩增的效应CD8+T细胞，这表明它们在血液和肠道组织之间循环，并可能参与肠外症状和疾病发作68。在儿科IBD中，Kokkinou及其同事报告称，T细胞的一些转录特征与先天淋巴细胞（ILC）细胞相同，ILC组成的变化与炎症活动相关75。
综上所述，scRNA-seq 有助于揭示与 IBD 相关的不同免疫细胞类型和细胞状态。未来仍需进一步研究，以阐明在慢性炎症中发挥作用的特定细胞模块和免疫细胞回路。
以单细胞技术为特征的肠道IBD并发症
IBD（尤其是CD）的进展常常与一系列并发症的发生相关。在本节中，我们将总结单细胞组学如何帮助我们更好地阐明其病理生理学。
纤维狭窄
纤维狭窄性疾病是由于肠壁中细胞外基质 (ECM) 过度积聚所致，其机制尚不完全清楚。迄今为止，已有四项研究应用 scRNA-seq 来研究纤维狭窄性 CD 58 60 76 77。它们的共同点是使用全层肠切除术而不是穿刺活检，承认了这种疾病的透壁性质。这些研究证实了间充质细胞是 ECM 的主要产生者，并确定了两种成纤维细胞特异性纤维化标志物CDH11 58和FAP 60 76。有趣的是，两项不同的研究同时描述了 FAP+ 成纤维细胞，这两项研究分别将 TWIST 确定为一种促纤维化转录因子，可调节肠成纤维细胞上FAP 的表达60 76。功能验证表明，FAP+ 和 CDH11+ 成纤维细胞具有高度促纤维化作用，可在体外促进胶原沉积，并在小鼠模型中以炎症非依赖的方式调节纤维化。值得注意的是，在没有纤维狭窄的情况下， FAP和CDH11也会在粘膜 IAF 中表达，两项分别分析炎症（非狭窄）和狭窄样本的研究58 60表明，这两种情况下细胞组成的总体差异很小。然而，FAP+ 成纤维细胞存在于肠壁深层60，而 CDH11+ 成纤维细胞在炎症和狭窄肠段中的转录差异58表明，细胞状态和相互作用伙伴的差异可能在纤维化的发展中发挥作用。事实上，成纤维细胞可能在疾病期间充当强大的信号传导枢纽58，而 CD150+ 单核细胞60或 CXCL9+ 巨噬细胞76产生的炎症细胞因子可诱导 FAP 和 TWIST 的表达。总而言之，scRNA-seq 技术已揭示了纤维化背后的细胞异质性，并揭示了髓系细胞是促进促纤维化行为的潜在细胞类型，从而证明了它们在这种并发症发展中的作用。然而，需要进一步开展利用全层组织空间转录组学的研究，以充分了解纤维化组织中的细胞身份及其关键相互作用。
蔓延的脂肪
蠕动脂肪 (CrF) 或包裹肠壁的肠系膜脂肪组织 (MAT) 过度生长，是一种肠外表现，主要与回肠 CD 有关，尤其是与纤维狭窄表型有关。虽然 CrF 的存在与较差的预后相关78，但尚不清楚 CrF 是否具有有益或有害的影响，是通过限制细菌易位的扩散还是通过调节炎症反应79。为了更好地了解纤维狭窄性 CD 中 CrF 的细胞组成和潜在功能，三项研究将 scRNA-seq 应用于 MAT 的基质血管部分或非脂肪细胞成分80–82。非常一致的是，所有这三项研究都表明，与正常 MAT 相比，CrF 含有较少的成纤维细胞，但内皮细胞和免疫细胞（特别是 B 细胞）有所扩增。其中一项研究集中于微生物群以及细菌如何使 CrF 巨噬细胞极化为更促纤维化的表型80，而另外两项研究旨在描述 MAT 的细胞景观和与 CrF 形成相关的改变81 82。具体来说，Wu等人在 MAT (MSC1-3) 82中发现了三个间充质干细胞 (MSC) 簇。MSC2 和 MSC3 比 MSC1 呈现出更多的脂肪形成表型，在 CD-MAT 和 CrF 中扩增，这与在 CrF 83中组织学观察到的脂肪细胞增生一致。反过来，对应于大多数祖细胞亚型的 MSC1 较少，并呈现出 CrF 特有的致病转录状态，CCL2和IL6表达增加。有趣的是，这与 Shu等人(GREM1+RFLNB+ 成纤维细胞) 81观察到的间充质亚群非常相似，进一步支持了富含 CrF 的间充质群体的存在。此外，MAT 的大量转录组学和脂质组学分析表明，CrF 中的脂肪细胞比健康 MAT 中的细胞更具有促炎性和脂肪形成性，如偏向脂质代谢途径的 MSCs 代谢异常缺陷所示82。这些代谢变化伴随着髓系区室的改变，髓系区室通过产生 IL-6 等炎性细胞因子可能维持富含 CrF 的基质细胞的脂肪形成作用82。因此，髓系细胞似乎在 CrF 的促炎和/或促纤维化行为中发挥作用，无论是作为 CrF 相关细菌的介质还是通过直接影响基质细胞。
肛周瘘管疾病
主要与 CD 相关的另一种并发症是肛周瘘管病 (PFD) 84。一些研究表明，肛周瘘管的形成部分是由粘膜上皮细胞对 TGFβ、TNF 或 IL-13 等细胞因子作出反应而发生上皮-间质转化 (EMT) 所致85 86。然而，我们对瘘管形成机制的理解仍然很肤浅，限制了我们制定针对这种难治并发症的策略的能力。到目前为止，只有一项研究应用单细胞组学（scRNA 测序和多组单核 ATAC 测序和 RNA 测序）来研究 PFD 20。通过比较直肠和配对瘘管之间的细胞频率，他们观察到瘘管中的炎症环境，其中髓系细胞（树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞）、T 细胞（CD4+ Tfh 样细胞、CD8+ 细胞）和自然杀伤 (NK) 细胞丰富，并且表达CHI3L1和基质降解酶（MMP1、MMP3和MMP13）的 IAF 丰富。值得注意的是，虽然他们没有通过转录组学或表观基因组学分析观察到 EMT 特征，但他们表明存在与衰老相关的分泌组，这由衰老标志物FTL（铁蛋白）与瘘管内壁的SCARA5的髓系-基质相互作用支持。本研究和之前研究的局限性在于将直肠粘膜与瘘管进行比较，因为它们代表两种完全不同的组织，并且在我们看来，从它们的比较中推断出的差异可能很难解释为瘘管形成事件。在未来，比较 CD 相关瘘管与非 IBD 瘘管（如隐窝腺瘘87 ）的研究，或分析患有和不患有 PFD 并发症的 CD 患者的肠组织，可能会为导致瘘管形成的分子机制提供新的见解。此外，目前还没有将单细胞或空间转录组技术应用于其他非肛周瘘管的研究，这仍然是一个具有高度临床相关性的重要研究领域。
造口袋的并发症
恢复性直肠结肠切除术联合回肠袋肛管吻合术 (IPAA) 是难治性 UC 患者的常见手术方式。然而，术后并发症常见，包括袋内炎症（袋炎）或袋内 CD 样疾病 (CDP)，后者炎症伴有腔内 CD 特征，例如袋前回肠炎、狭窄或瘘管88。已有研究利用 scRNA 测序和 scATAC 测序对袋炎患者的袋内免疫细胞89和上皮细胞90进行了鉴定。这些研究表明患者获得了结肠样特征，如 IPAA 90的结肠上皮化生和类似于结肠 UC 炎症的炎症细胞类型的扩增。这包括 FOXP3+/BATF+ Treg 和与袋炎特异性微生物群相关的 IL1B+/LYZ+ 炎性单核细胞群89。相反，CDP 表现出强烈的 T 细胞反应，存在克隆过度扩增的效应 T 细胞和 T 细胞耗竭标志物的下调35。有趣的是，在出现炎症之前，正常的袋已经呈现出在回肠正常前袋或非 IBD 患者袋中未观察到的炎症样特征。这些变化包括上皮代谢改变、T 细胞扩增和 IL1B+/CCL3+ 巨噬细胞增加35。这表明 IBD 患者的袋发生基底粘膜重塑，可能导致这种并发症，这可能为治疗干预打开机会之窗。总体而言，scRNA-seq 数据显示，袋内炎症更类似于溃疡性结肠炎 (UC) 炎症，伴有强烈的细菌诱导炎症反应，而囊性乳头状癌 (CDP) 则类似于腔内 CD。这些细胞差异可能为个体化治疗提供依据。
利用单细胞组学了解药物反应或耐药性的机制
管理 IBD 患者最重要的挑战之一是药物反应的不可预测性91 92。因此，识别能够解释和预测治疗效果的分子和细胞特征仍然是一个激烈的研究领域。进行大量 RNA 分析的众多研究均未能提供经得起验证的稳健预测因子93，这可能是因为大量分析的整体分辨率较低。基于单细胞组学的潜力，一些研究小组已开始应用这种方法来揭示此类机制。一些研究分析了开始接受抗 TNF 46 94、维多珠单抗（抗整合素）30或托法替尼（JAK 抑制剂）95治疗的患者的肠道细胞。这些研究强调了 scRNA-seq 揭示伴随药物反应的变化的潜力，以及重要的是，揭示那些可以解释并因此可能预测耐药性的变化。
最早利用 scRNA-seq 识别预测反应特征的研究之一使用了回肠切除术来定义一个评分，将发炎的切除回肠分成两组36。该细胞模块（标记为 GIMATS）包括炎性巨噬细胞、活化的树突状细胞、高度活化的 T 细胞、IgG 浆细胞、活化的成纤维细胞和 ACKR1+ 活化的内皮细胞，所有这些都与疾病活动有关。从已识别的 GIMATS 模块衍生的评分函数被应用于来自大型儿科起始队列的活检大量 RNA 数据。尽管在抗 TNF 治疗后未能达到持久缓解的患者的大量 RNA 中发现基线时较高的 GIMATS 评分，但分类的准确性仍然适中（曲线下面积 = 0.69）。
另一项研究30采用多组学方法分析了少量UC患者的血液和组织样本，比较了接受和未接受抗α4β7抗体（维多珠单抗）治疗的UC患者。虽然scRNA-seq分析的样本数量较少，且并非纵向收集，但这是第一项比较接受不同疗法的IBD患者样本的研究。此外，该研究还纳入了接受维多珠单抗治疗患者的固定活检样本的空间转录组学数据——这是目前为数不多的可用空间数据集29之一。
在最近的研究46 95中，另外两个研究小组首次对开始抗 TNF 或托法替尼治疗前后患者的活检样本进行了 scRNA-seq。两项研究的共同点是，无反应者的病情进展与细胞特异性特征的可测量变化以及细胞和分子水平上疾病的整体恶化有关，包括单核细胞/巨噬细胞和成纤维细胞中炎症基因表达的增加。具体到 UC 患者，Thomas等人的研究表明，在接受抗 TNF 治疗的患者中，治疗后 CD4+ T 细胞、基质、髓系和结肠上皮细胞中的 IFN（JAK 依赖性）特征增强46。有趣的是，与无反应患者相比，对 JAK 抑制95有反应的患者在基线时肠成纤维细胞、内皮细胞、肥大细胞和淋巴细胞中表现出增加的 JAK 依赖性通路活性。总而言之，这些纵向scRNA-seq分析支持在抗TNF治疗失败后使用JAK抑制剂。其他项目，例如PREDICT研究（Clinicaltrials.gov %23NCT03369353），正在创建一个儿科CD初治单细胞图谱，以将观察到的基线细胞簇与疾病轨迹和治疗结果联系起来94。
总体而言，这些初步研究证明了高分辨率转录组学能够识别疾病轨迹（即药物失效后）中细胞特异性预测特征和细胞状态变化，并具有潜在的重要临床意义。我们设想，未来 IBD 的预后模型将涉及系统生物学方法，整合大型多组学数据集和高质量临床元数据，以揭示遗传因素、环境因素和患者分子病理生理之间的相互作用。在此背景下，整合来自不同组学和下游分析的数据（例如 GWAS 关联96–98药物靶标预测99 100、空间代谢组学101和微生物组分析102）的单细胞和空间方法将有助于全面了解 IBD。
将单细胞组学转化为临床实践：未来展望
除了应用单细胞组学来表征疾病生物学和药物反应或耐药机制之外，这些技术还可能在临床环境中得到应用，帮助医生进行日常治疗决策（图 3 ）。肿瘤学、血液学和免疫学领域的几项注册临床试验包括患者样本（最常见的是血细胞103）的 scRNA 测序。然而，这些研究大多将 scRNA 测序分析用于研究目的，而不是临床决策或患者分层。虽然在临床环境中收集样本用于后期单细胞分析已成为现实，但这些技术在随机对照试验中的应用才刚刚起步。有几个因素限制了 scRNA 测序或空间转录组学在临床中的应用，包括数据采集和分析的高成本、标准化、样本保存和组织解离伪影。然而，非常需要进行临床试验来测试单细胞组学在推动治疗决策方面的潜力，以支持单细胞组学向药物开发的转变。从这个意义上讲，英国的 Open-IBD 研究（https://www.open-ibd.org/）等举措将发挥重要作用，该研究将提供 1000 名 IBD 患者在诊断时以及长达 4 年的多个时间点的深入基因组和临床数据。
将单细胞组学技术应用于临床实践：单细胞组学可应用于炎症性肠病 (IBD) 患者的横向队列研究。这种表征可能揭示细胞特异性的疾病机制，并识别具有共同病理学特征的患者，从而可能将具有共同分子特征的个体进行分层。在纵向队列研究中，单细胞组学有助于了解不同 IBD 患者对治疗反应的异质性。单细胞组学可用于靶点发现和临床前研究，通常仅涉及小规模的患者队列。在此背景下，主要研究结果是识别疾病特异性的细胞类型/状态，以细胞特异性方式评估炎症通路的激活，测量细胞频率的变化，并研究细胞相互作用，理想情况下结合空间转录组学/蛋白质组学。如果能够识别区分疾病组或预测药物反应的生物标志物，则可以在更大规模的临床研究中利用全组织技术进行测量。同样，可以通过单分子空间技术（例如原位杂交或免疫组织化学）分析组织中的目标基因。此外，可以通过反卷积方法将单细胞分析数据与批量数据集整合，从而推断整个组织中的细胞丰度。因此，虽然单细胞方法对于进一步阐明IBD复杂的生物学机制至关重要，但批量方法有助于将分子研究成果转化为临床应用。图片由BioRender创建。NR：无应答者；R：应答者。
从长远来看，我们设想单细胞技术的实施将成为建立患者分层和预后标准的关键进步，并成为识别和优先排序转录本、细胞表型和蛋白质的工具，以便在日常实践中通过更经济实惠且更易于操作的检测方法进行评估。这一点可能很重要，因为即使这些技术的成本随着时间的推移而降低，数据管理仍将是日常实践中的一个制约因素。
总而言之，我们认为将单细胞技术从实验研究转移到临床试验/研究是完全合理的，并且应该成为科学家、临床医生和药物开发者的首要任务。试验证据表明，单细胞组学在诊断和治疗方面具有优势，这将在未来十年改变我们目前的精准医疗方法。
道德声明
患者同意发表
伦理审批
不适用。
参考
Footnotes
Contributors All authors conceptualised, drafted and reviewed the manuscript.
Funding VG and AS are supported by grant #2008-04050 from the Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, Grant PID2021-123918OB-100 from the Ministerio de Ciencia e Innovación, Gobierno de España, co-funded by “FEDER A way to make Europe”, by CIBER-EHD, Spain and by the European Union’s Horizon Europe Research & Innovation programme (FIBROTARGET, 101080523). RB is supported by Grant 315307, Forskerprosjekt 2020, Researcher Project/International Mobility Grant from the Research Council of Norway and Grant 294670, Researcher projects 2024, from the Norwegian Cancer Society.
Competing interests None declared.
Provenance and peer review Not commissioned; externally peer reviewed.
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