标题 ： 齿状回核中的 Musashi2 神经元调节雌性小鼠的生殖功能

郝东刘 ^ab； 邢王 ^ab； 彭辉李 ^ab； 杜长光 ^abc*

^a 内蒙古自治区重点实验室 ，呼和浩特，中华人民共和国

^b 内蒙古农业大学兽医学院 ，呼和浩特，中华人民共和国

^c 职业与技术学院，内蒙古农业大学，包头市，中华人民共和国

通讯作者： 杜春光

地址： 昭乌达路 306 号 ，内蒙古自治区呼和浩特市 010018，中华人民共和国

邮箱：duc@imau.edu.cn，13514810049

摘要

Musashi2（MSI2）是一种重要的调控因子管理基因转录在生殖过程中的作用. 然而，它在其中的作用神经回路ry 的中枢神经系统的作用尚不明确。本研究旨在探讨 MSI2 表达的功能-表达中心齿状回（DG）核中的神经元。 使用病毒成像技术。确定。MSI2 是否。表达神经元直接支配卵巢组织。转基因小鼠具有特定的MSI2 敲除被使用用来评估MSI2 缺失对卵巢功能的影响。另外, RNA 测序紧接着一个 病毒追踪实验w在那里执行差异基因表达分析用于深入了解生物机制的途径MSI2 调控西班牙语繁殖. 最后，a 化学o遗传策略是采用了来操纵这个神经网络回路，以及视觉投射来自 蓝斑核(LC)到 MSI2表达神经元的DG 是分析建立解剖学基础的LC-表达 MSI2 的多巴胺能神经元(DG^MSI2)参与的神经网络回路调节卵巢功能在雌性小鼠条件性M是2敲除导致卵巢卵泡和后代数量增加，对体重没有可察觉的影响 。T转录组分析揭示了 d差异表达基因富集在与类固醇合成、卵母细胞成熟、催乳素信号传导相关的通路中过氧化物酶体增殖激活受体信号传导Star和Hsd3b1在之后上调Msi2中的敲除卵巢和卵巢，而P450表达下调。 成像分析表明 MSI2- 表达DG 项目中的神经元ed to the LC. 化学遗传学LC–DG 的激活^MSI2电路中断编辑发情周期及减少d雌性小鼠的黄体计数。 总结如下， tLC–DG^MSI2神经回路调节多胎妊娠，提供对神经系统模块化是生殖过程。

关键词： 齿状回核；蓝斑；后代；卵巢；发情周期

引言

生殖调控机制控制个体生殖能力的及时启动，为物种的适应性和生存提供关键优势。在这个过程中，神经系统发出精确的生殖调控信号，以确保生殖活动的有效进行。理解生殖调控的神经生物学机制对于理解生物进化和物种生存至关重要。

下丘脑 - 垂体 - 性腺 （HPG） 轴，调节 ed 通过各个脑区 ， 发挥对生殖的长期影响。HPG 轴参与维持正常的生殖系统功能。该系统的失调会导致严重的生殖健康问题，包括不孕症、多囊卵巢综合征和性发育障碍。

HPG 轴在发育过程中经历 tight 调节的变化，以确保青春期的开始和 建立标准生殖能力 [1]。代谢信号，主要来源于下丘脑的 ，可以刺激 kisspeptin 或促性腺激素释放激素（GnRH）的释放 [2]，突出了下丘脑在调节生殖过程中的关键作用 [3]。然而，其他大脑区域参与调节生殖功能仍不清楚。

Musashi2（MSI2），一种主要调节 mRNA 稳定性和翻译的 RNA 结合蛋白，在类固醇生成组织的发育中起着至关重要的作用。由 MSI2 调节的分泌性类固醇激素，对女性生殖系统的功能有显著贡献[4]。研究已确定 MSI2 在雌鼠卵巢的颗粒细胞和卵母细胞中的表达，观察到在减数分裂 II 阶段卵母细胞中表达增加[5]。在雌性生殖细胞中过表达 MSI2 的雌鼠表现出卵巢较小、卵泡发生受损、DNA 损伤和细胞凋亡显著增加、总卵泡和减数分裂 II 卵母细胞计数减少以及初级卵泡百分比降低[6]。此外，这些小鼠表现出精子-输卵管结合减少、幼崽数量减少和生育能力受损[7]。Msi2 在小鼠中的完全敲除导致严重的发育异常和后代高死亡率[8,9]。高通量测序揭示了 MSI2 表达与类固醇生物合成相关基因表达之间的正相关，从而影响类固醇表达。 因此，Msi2 被认为是一个影响毛囊发育的必需基因。

除下丘脑外，海马体还表达多种生殖激素，包括 GnRH、促卵泡激素 （FSH） 和黄体生成素 （LH） [10]。海马抑制促性腺激素释放 [11,12] 并通过海马 al–HPG 轴 [13,14,15]。这个功能表明海马体可以作为下丘脑的上位调节中心，并可能通过神经内分泌功能调节生殖。

利用 角蛋白 14（KRT14）在小鼠性腺和生殖器官中的特异性表达 [16]，建立转基因小鼠模型 =1>。< 在 this 研究中，t 该模型被用来生成条件 Msi2 敲除（Krt14^Cre/+： <跨度 id=21>Msi2^Flox/Flox） 小鼠使用 <span id=29>Krt14 启动子驱动的 Cre。目的是研究 MSI2 功能在调节生殖功能中的必要性。 Msi2^CreERT2/+ 小鼠和病毒追踪工具被用于探索 DG^MSI2 神经元是否具有其他下游投射靶点，从而确定参与生殖调节的脑神经系统。

本研究采用解剖成像技术和 chemo 遗传学策略研究了神经回路参与生殖调控，具有更高的精度和分辨率。 靶向药物开发或其他治疗方法可以有效地通过识别参与生殖调节的特定神经元来解开参与生殖功能的复杂神经网络 。本研究首次提供了小鼠 <span id=12>DG 神经元中 KRT14 表达的免疫学证据 ，表明小鼠 DG 和卵巢中 MSI2 表达的变化与窝产仔数的增加之间存在关联。DG^MSI2 神经元可能在调节小鼠窝产仔数中起关键作用。 这些发现加深了我们对 中枢神经系统 （CNS） 与卵巢之间关系的理解，支持中枢参与生殖调节的神经生物学机制。

材料和实验方法

伦理声明

所有动物实验均按照《中华人民共和国实验动物管理条例》进行。实验方案已获得内蒙古农业大学动物福利与伦理委员会批准（批准编号：NND2021013；批准日期：2021 年 5 月 20 日）。小鼠通过腹腔注射 3%戊巴比妥钠进行麻醉。在安乐死之前，小鼠被注射了 30 mg/kg 的戊巴比妥钠（P3761；Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）。

动物

实验小鼠被选为单基因或双基因小鼠（ 体重，17-18 克 ，6-8 周大）KRT14-IRES-Cre（Krt14^Cre/+）和 Ai14（tdTomato^Tom/+）小鼠从杰克逊实验室（（ 美国缅因州巴港 ））购买。 相反，Msi2-2A-CreERT2（^{Msi2CreERT2/+}）和 Msi2-Flox（Msi2^{Flox/Flox）小鼠从上海模式生物样本中心（ 上海，中国 ）购买。 Krt14-Cre 小鼠与 tdTomato[sup id=37]Tom[/sup][sup id=39]/+和 Msi2[sup id=43]Flox[/sup][sup id=45]Flox[/sup]小鼠杂交，分别产生 Krt14[sup id=49]Cre/+[/sup]tdTomato[sup id=52]Tom[/sup][sup id=54]/+和 Krt14[sup id=58]Cre/+[/sup]Msi2[sup id=61]Flox[/sup][sup id=63]Flox[/sup]小鼠。Msi2[sup id=67]CreERT2/+[/sup]小鼠在病毒注射前一周每天注射 50 μg/g 的 tamoxifen 以激活 Cre 重组酶[sup id=71][17[/sup]]。C57BL/6J 小鼠（野生型，WT）由北京维特河实验室动物科技有限公司提供。 实验中使用的所有小鼠均为雌性 . 每个笼子设计为容纳 5 只小鼠，确保所有个体都有适当的空间和条件 . 它们被安置在具有 12 小时光/暗周期的笼子中（早上 6 点开灯 , 晚上 10 点关灯 ）并且可以自由取食和饮水。表 1 展示了基因分型信息。小鼠根据可用性分配到实验条件，由于它们遗传结构的必要性，并未随机分配。}

立体定位注射

在实验之前，小鼠被诱导使用5%异氟醚麻醉，并维持在1–3%。剃毛的小鼠被放置在立体定位装置中（NeuroStarGmbH，图宾根，德国）。他们的眼睛用红霉素眼膏保持湿润。使用仪器软件显示的坐标，确定了位置，并钻了一个孔。用 5-μL 的汉密尔顿微量注射器连接到微型输液泵的缓慢地吸取并注入足够的病毒量。病毒注射后，针头固定5-8分钟在……之前AAV2-DIO-ChR2-增强型绿色荧光蛋白(EGFP) (300 nL) 单方面注入到 DG 中（AP：-1.5 毫米；ML：+1.5 毫米；DV：-1.8 毫米）[18] 的Msi2^CreERT2/+用于顺行追踪的小鼠。在逆行单突触神经元追踪实验中，AAV9-EF1α-DIO-mCherry-TVA: AAV9-EF1α-DIO-RVG [1:1; 总体积，200nL] 单方面注入到 DG 中Msi2^CreERT2/+小鼠。洞被骨头封住蜡，皮肤缝合。三到四周后，350nL将 RV-ENVA-EGFP 注射到相同的坐标。在 RV 注射后 7 天处死小鼠。AAV/R-DIO-Flpo注入到 DG 中Msi2^CreERT2/+小鼠中，以及 AAV-hSyn-fDIO-h3MDq-mCherry（300nL) 或 AAV-hSyn-fDIO-红荧火 (300 nL) 双侧注入了蓝斑核(LC)。在病毒表达3周后，c氯氮平-N-氧化物(CNO)(0.5 mg/kg) 通过腹腔注射给药以激活 LC-DG^MSI2神经回路.随后，眼球血液样本被收集到非抗凝管中。血清通过 12000 rpm 离心 25 分钟，并储存在-80°C。武汉服务生物技术有限公司（武汉，中国）被委托检测和分析FSH和LH 通过双抗体夹心法。表2展示了病毒信息。

猪瘟病毒 （PRV） 逆向多突触追踪从卵巢

在逆向突触追踪实验中，表达 EGFP 的 PRV（PRV-CAG-EGFP [5×100 nL]）经双侧卵巢注射到 Krt14Cre/+tdTomatoTom/+小鼠体内。简要来说，通过小鼠背部皮肤外的小切口暴露卵巢。然后，将 1.5 μL 的 PRV531-EGFP（2.00×109 pfu/ml，武汉脑科科技有限公司，中国）迅速注入双侧卵巢。固定针头 10 分钟后，缓慢拔出，并用酒精棉球消毒注射部位。缝合伤口，注射青霉素预防感染，然后将小鼠放回笼中恢复。在处死小鼠之前进行组织灌注以收集组织。.

免疫荧光

麻醉后，A 冰 underwent 胸腔切开术；将针插入左心室，在用盐水灌注 2 分钟后，再灌注 200 mL 的 4%多聚甲醛（PFA，pH = 7.4；Sigma-Aldrich）。固定后，将大脑和卵巢转移到 30%蔗糖中并脱水，直到组织沉至试管底部。然后在冷冻切片机上（Slee Medical，美因茨，德国）切制连续冷冻切片（30 µm）。所有切片用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗三次，每次 5 分钟。随后，在 4°C 下用 1% Triton X-100（pH 8.68，T8787；Sigma-Aldrich）渗透切片 60 分钟[1 9]。切片与 3%正常驴血清（017-000-121；Jackson Laboratory）孵育 30 分钟。 随后，非特异性结合的抗体被阻断，并将切片在 4°C 下与以下一抗孵育 24 小时：抗 MSI2（1:1000，兔；ab76148；Abcam，剑桥，英国），抗 nNOS（1:1000，山羊；ab1376；Abcam），抗 GFP（1:1500，鸡；ab13970；Abcam）。然后，用 PBS 洗涤切片，并在 25°C 下与以下二抗孵育 120 分钟：驴抗兔 AlexaFluor 647（1:1000；ab150075；Abcam），山羊抗鸡 AlexaFluor 488（1:1000；ab150173；Abcam）。设置激光共聚焦扫描参数，使用未加一抗的标本作为阴性对照。使用共聚焦显微镜（尼康 C2；尼康，东京，日本）观察注射部位的病毒表达和投影。表 3 展示了抗体信息。

定量逆转录聚合酶链反应（PCR）

使用 RNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）根据制造商的说明从 DG 和卵巢样本中提取 RNA。使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒（Applied Biosystems，Waltham，MA）根据制造商的方案从总 RNA 生成互补 DNA（cDNA），并在 CFX96 仪器（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）上执行定量 PCR。引物序列如下：Msi2（正向：5′-CGCAGACCCAGCAAGTGTAGA-3′；反向：5′CTCTGTGCCTGTTGGTGGTTT-3′）；Stard1（正向：5′-AGGGAGAGGTGGCTATGCAGA-3′；反向：5′-CTTAGCACTTCGTCCCCGTTC-3′）；Hsd3b1（正向：5′-GTCACAGGTGTCATTCCCAG-3′；反向：5′-CCCTGCAACATCAACTGAGC-3′）；P450（正向：5′-CACGGTGGGAGACATCTTTG-3′；反向：5′-GGTGTTCGACTGAAGCCTAC-3′），以及 Gapdh（NM_008084，正向：5′- GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′；反向：5′- CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′）。PCR 方案包括一个变性步骤（95°C 30 秒），随后是重复 40 次的扩增和定量程序（95°C 15 秒，60°C 15 秒，72°C 15 秒）[20]。使用 2-△Ct 方法进行分析，并按 GAPDH 表达进行归一化。.

蛋白质提取和 Western 印迹

Western blotting 用于验证 Msi2 敲除效率在 Msi2Flox/和 Krt14Cre/+小鼠大脑中。将大脑置于预冷的脑脊液中，并使用振动切片机（Leica VT1000；Leica Microsystems，Wetzlar，德国）切成 200 微米厚的切片。使用大脑取样工具（Brain Punch）（打孔大小：DG 1.50 mm）（上海宇联仪器，上海，中国，货号 57393）以确保 DG 取样的准确性。简而言之，将脑切片放在玻璃板上，将仪器尖端放在第三脑室周围的 DG 处。做一个环形切口，套筒将组织从尖端内腔中弹出。 DG 细胞核和卵巢在含有蛋白酶抑制剂的强力裂解缓冲液（CoWin Biosciences，剑桥，MA；货号 2333S）中均质化后 ，（CoWin Biosciences，剑桥，MA；货号 2333S）， 进行了瞬时超声处理（每次 15 秒，90 伏，三次）， 参考文献[21]。 蛋白质浓度使用双缩脲比色法 （Pierce 蛋白质测定试剂盒，Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，MA；货号 23227） 测定 ，并根据需要稀释蛋白质，以确保总蛋白含量接近 12.8 微克 。MSI2 水平以β-微管蛋白为标准进行归一化。

发情周期监测

在行为实验开始之前 ，雌性小鼠被驯化了处理和阴道涂片收集 。每天早上 9 点，小鼠被轻轻用棉签擦拭以评估其发情周期的 [22]， 随后在上午 10 点进行血液采集。使用一次性移液管，将 20μL 的生理盐水涂抹在阴道开口附近，重复三次以清洗。 将阴道涂片转移到载玻片上，晾干后，在×20 显微镜下检查。 发情期确定基于观察到的细胞类型及其在阴道分泌物中的密度 [19]。在化学遗传学激活后，对雌性小鼠的发情周期持续评估十天。 化学遗传学激活。

生育能力

雌性小鼠与 8 周龄的野生型雄性小鼠配对一周。移除笼子中的雄性小鼠后，雌性小鼠被单独饲养，并监测怀孕迹象。 出生后，雌性小鼠再次与新的野生型雄性小鼠配对一周，以确保任何潜在的生育能力问题仅由雌性引起。

卵泡计数

确定发情周期阶段后，从 Krt14^Cre/+Msi2^Flox/F span id=9>小鼠和 Msi2^Flox/Flox 小鼠处于发情期 Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox 和 Msi 2^Flox/Floxp<^{4>再发情期小鼠腹膜内注射 pregnant mare 血清促性腺激素 （PMSG） 以每个 200 IU 的剂量 Ovarian 检索然后进行在异氟醚麻醉下注射后 48 小时。}

卵巢在 4%多聚甲醛中于 4°C 固定 24 小时，随后用流动水冲洗 8 小时。随后，组织在一系列乙醇梯度中脱水，每个乙醇脱水级别持续 45 分钟，然后在环保型透明剂中澄清 1 小时，再浸泡在石蜡中 1 小时，随后在硬石蜡中包埋并自然凝固。切片使用切片机以 5 μm 的厚度进行切割，每 25 μm 切一次，以避免重复计数同一结构。切片在空气中干燥后，在 37°C 下过夜孵育，以在室温下储存为最佳。 每个乙醇脱水级别持续 45 分钟，然后在环保型透明剂中澄清 1 小时，再浸泡在石蜡中 1 小时，随后在硬石蜡中包埋并自然凝固。μm 每 25 μm 切一次，以避免重复计数同一结构。 切片在空气中干燥后，在 37°C 下过夜孵育，以在室温下储存为最佳。

卵巢石蜡切片经过脱蜡、复水、核染色、脱水、细胞质染色、脱水、澄清步骤后，在中性封片剂中封片，用于显微镜成像和卵泡计数。

RNA 测序

动物卵巢处理与解剖

携带 Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox 基因型（n = 3 只小鼠）或 Msi2^Flox/Flox(n = 3 只小鼠) 基因型的小鼠接受了为期 7 周的饮食方案。随后，小鼠在深度戊巴比妥钠麻醉下被安乐死，其卵巢被迅速取出并储存在-80°C 以保存组织。

基因组库和测序

以下步骤按照 cDNA 扩增和文库构建的标准方案进行。文库由 BIOMARKER TECHNOLOGIES. Ltd.（青岛，中国）在 NovaSeq 6000 测序系统（Illumina，圣地亚哥，CA）上测序。

生物信息学分析

使用 Illumina 高通量测序平台对 cDNA 文库进行测序，生成了大量高质量数据。部分序列质量得分超过或达到 Q30。实施了严格的质量管理措施以确保后续数据分析的准确性 。 这些措施包括以下过滤： 去除包含适配器的读段，消除低质量读段（包括 N 比例大于 10%的读段），以及去除占所有读段超过 50%的 Q≤10 的碱基质量值读段。 经过这些质量控制后，获得了最高质量的清洁数据，格式为 FASTQ。

定量基因表达

映射读数数量和基因总长度进行了标准化。对于具有生物重复的样本，使用了 DESeq2 来分析样本组合之间基因表达差异 （ 通过比较样本组合 [23]，从而获得两种生物条件之间的差异表达基因集。对于没有生物重复的数据，使用了 edgeR 技术进行差异鉴定 [24]。在差异基因检测过程中，应用了倍数变化≥2 和假发现率（FDR）阈值 0.05 的阈值。

统计分析

使用 GraphPad Prism 7（GraphPad Software，圣地亚哥，CA）进行了统计分析。数据使用单因素方差分析进行独立样本分析，并以平均数±标准误（±SEM） 的形式呈现。所有定量分析均以非盲法进行。在追踪实验中，具有不准确病毒注射位置的鼠被排除在外。每个组中动物的数量已在图例中说明。样本量未使用统计方法预先确定，但与先前发表的作品相当 [1,4,9]。统计显著性设定为 p < 0.05。

结果

小鼠大脑中 KRT14 和 MSI2 神经元的分布

我们 employed 通过穿越 STOP 5>tdTomato> 报告小鼠 <span id=7>Krt< 来span id=7Kspan id=8rt 14^Cre/+ 小鼠（span id=13>Krt14^Cre/+：tdTomato^Tom/+），driven 通过 Krt14promoter。该方法使用强大的荧光标记物永久标记表达 KRT14 的细胞其中<主要定位于 >细胞体 [25]。免疫荧光分析显示 KRT14 在小鼠海马体的 DG 中独占表达（图 1）。 这项新发现表明，KRT14 可能通过 DG 传递中枢调节神经信号。

排除未与 Krt14Cre/+小鼠杂交的 tdTomato^Tom/+ 小鼠 ，使用各种波长的激发光扫描含有表达该 KRT14 标记的神经元的区域，以验证 KRT14 的神经元特异性表达。结果一致显示这些区域 KRT14 阴性（图 . S1）），表明 DG 含有 KRT14-表达神经元，如报告基因标记所示。

免疫荧光 MSI2 阳性细胞在各种区域中被观察到，包括但不限于外侧隔核（LHb）、内侧隔核（MHb）、海马体、网状结构（RT）、苍白球（GP）、脾旁颗粒皮层（RSD）、室旁核（PVN）、蓝斑（LC）和弓状核（ARC）（图 S2A）。这些区域中 MSI2 的表达表明其在多种生理调节过程中发挥作用。

此外，鉴于 MSI2 的广泛表达<><，对小鼠脑中神经元一氧化氮合酶 （nNOS） 的神经元一氧化氮合酶 （span id=>3nNOSspan id=4） 的共表达进行了分析。 nNOS 神经元在调节生殖周期和排卵过程中起着关键作用。 使用双标记免疫荧光染色技术在小鼠><脑的 laterodorsal 被盖核 （LDT） 和 LC 中观察到 C MSI2 和 nNOS 的表达 。 S3）。这个 co-expression 表示 nNOS 神经元可以通过释放一氧化氮来调节卵泡发育和排卵，从而调节生殖周期。 这一发现表明 MSI2 和 nNOS 之间可能存在潜在的协同调节作用，突出了它们对生殖生理的联合影响。

DG 神经元通过多个突触支配卵巢

将 PRV–CAG-EGFP 双侧注射到 Krt14^Cre/+：tdTomato^Tom/+ 小鼠研究 KRT14 和 MSI2 神经元参与卵巢调节 。在这种方法中，tdTomato 间接表示 es 神经元 KRT14 expression，促进了上游神经元的逆行和跨突触标记（图 2A）。

研究结果揭示了在 PVN、DMH、LHA、Pir、ZI、LC 和 BLA 区域存在病毒标记信号（图 2B）， 这表明可能与卵巢生殖功能或激素分泌过程存在潜在关联 。 此外，在 DG 区域（图 2A）观察到局部 KRT14/PRV/MSI2 三重阳性信号，表明表达 KRT14 和 MSI2 的 DG 核可能作为 CNS-卵巢输出回路中的关键枢纽。

Msi2 在 KRT14 神经元中的缺失导致雌性小鼠多胎

Krt14^Cre/+:Msi2^Flox/Flox 小鼠通过繁殖生成，以验证 MSI2 在生殖调节中的作用 。使用免疫荧光、蛋白质印迹和 RT-PCR 确认了 Msi2 的敲除效率。免疫荧光结果显示，与同窝对照（Msi2^Flox/Flox）相比，Krt14^Cre/+:Msi2^Flox/Flox 小鼠的卵巢中 MSI2 表达显著降低（图 3A）。 蛋白质印迹证实 <><span id=44>Krt< id=47> ^{CREsan id=50}< md=49><span id=50>Msi2^Flox/Flox 小鼠（图 3B、C）。与 western blotting 结果一致，>Msi2 在 <span id=64>Krt14^Cre/+ 的卵巢中 mRNA 水平 Msi>^Flox/Flox 小鼠显著减少 （Fig. 3D）。

确认成功 knockout<span id=5>Msi2 后，我们观察到 WT 和未敲除小鼠的平均窝产仔数约为 8 只幼崽。然而，Krt14^Cre/+>Msi2^Flox/Flox 小鼠显著增加，平均增加 13 只幼崽，与野生型小鼠相比增加了 62.5 ± 8.3%（图 3E）。多胎妊娠伴随着这种增加。值得注意的是，Msi2- 敲除小鼠的发情周期和阴道开放期不受影响 。 此外， 没有观察到脂肪和瘦体重组成的变化 （图 3F，G），表明局部 Msi2 敲除仅影响生殖功能，而没有影响整体体重调节。

我们对 Krt14Cre/+:Msi2FloxFlox 小鼠进行了卵泡计数，以探讨 MSI2 对小鼠排卵的潜在影响。结果表明，在 Msi2 特异性敲除后，卵泡数量显著增加（图 S4A-D），与窝仔数量增加的趋势一致。

PMSG，一种蛋白质质激素，通过与 FSH 和 LH 受体形成功能性复合物来刺激卵巢卵泡的生长和成熟。因此，采用腹部注射 PMSG 的方法来验证在 MSI2 缺失的情况下，PMSG 促进卵泡生长的效果是否仍然存在。 研究结果表明 d 卵巢卵泡数量 <span id=6>在 Krt14^Cre/+：Msi2^Flox/Flox 小鼠在 PMSG 给药后（图 s.S4C-D）。 这个观察建议 s 条件 Msi2 敲除不影响 FSH 和 LH 受体的正常功能，因此意味着条件性 Msi33>耗竭在促进中的作用小鼠<跨度 id=35>排卵 <跨度 id=36><跨度 id=37>。

我们对 Krt14^Cre/+:Msi2^Flox/Flox 雌性小鼠的卵巢组织进行了转录组测序分析，以进一步研究 MSI2 的细胞和组织功能，以及这些生物学过程的调控机制。然后，我们比较了 Msi2^Flox/Flox 小鼠和 Krt14^Cre/+:Msi2^Flox/Flox 小鼠卵巢中生殖相关基因的表达差异。测序质量指标显示在表 S1 中。

差异分析鉴定 1975 个基因两者共有条件 <span id=5>Msi2 敲除对照组，有 911 个基因上调和 787 个基因下调（图 。 S5）。 对这些差异基因进行京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 通路富集分析，以更深入地了解 ir 功能以及它们参与的生物学过程 参与的生物学过程 （图 。 S6）。 我们确定了与繁殖、发育和代谢相关的多个途径，包括“孕酮介导的卵母细胞成熟”、“卵母细胞减数分裂”和“PPAR 信号通路”。在这些途径中，下调的基因富集在“孕酮介导的卵母细胞成熟”和“卵母细胞减数分裂”等过程中。“progesterone-mediated oocyte maturation,”“meiosis of oocytes,” 和 “PPAR signaling pathway.” 在这些途径中，下调的基因富集在“孕酮介导的卵母细胞成熟”和“卵母细胞减数分裂”等过程中。 推测 Msi2 敲除会影响这些途径中的关键因素，从而促进卵母细胞发育。Msi2 敲除会影响这些途径中的关键因素，从而促进卵母细胞发育。

基因本体（GO）富集分析显示，这些差异表达基因参与细胞增殖、分化、凋亡、蛋白质结合和转录调控（图 S7）。

F 雄性小鼠受条件性 Msi2 敲除类固醇激素水平表现出显著的改变类固醇激素水平 ，特别是显著增加 <span id=12>与类固醇激素的合成和分泌相关的基因的上调，例如 Cyp11a1、Cyp19a1、Hsd17b7 和 Stard1（编码 StAR）（表 S2）。

测序 data 证实了 MSI2 参与激素分泌 pathways， 特别是那些参与 性腺激素和类固醇激素的产生和释放的那些。因此，研究了小鼠卵巢内 MSI2 和类固醇生成酶表达的协同变异，以验证条件性 敲除 of Msi2 并探讨其对卵泡发育的影响。

免疫荧光和免疫组织化学技术最初被用于确定卵巢中类固醇生成酶 P450、StAR 和 HSD3B1 的表达水平。结果表明，P450 在颗粒细胞和卵母细胞中的表达占主导地位，StAR 在颗粒细胞和黄体细胞中表达丰富，HSD3B1 在颗粒细胞和卵母细胞中的表达量较大。同时，MSI2 在卵巢中的表达主要定位于颗粒细胞和卵泡膜细胞（图 S8A-D）。免疫组织化学发现进一步证实了小鼠卵巢颗粒细胞和卵母细胞中 P450、HSD3B1 和 MSI2 的强阳性信号，与免疫荧光结果一致（图 S8A’-D’）。

采用 Western blot 分析验证卵巢中类固醇生成酶的蛋白水平。结果显示，HSD3B1 的表达显著上调，StAR，同时 P450 在卵巢中表达下调 Msi2- 敲除小鼠，与测序结果一致 data（图 s S9A， B）。进行 RT-PCR 以验证卵巢中类固醇生成因子的基因表达水平，这与蛋白质表达水平相关 （图 。 S9C）。 鉴于 Msi2 在 DG 中的表达也被敲除，DG 中类固醇生成因子的基因表达被量化因此 。 结果表明，HSD3B1 和 StAR 的表达显著增加，伴随着 expression of>P450 （图 。 S9D）， 表明类固醇生成因子反应触发 在 DG 核和卵巢中敲除 41>Msi2。 这个响应可能可能解释观察到的增加在卵泡中，可能导致增加的窝产猪数量。

DG 神经元广泛支配大脑区域

We 注射了 Cre 依赖性 AAV2/9-DIO-ChR2-EGFP 到小鼠的 DG 区域，以进行 DG 神经元的顺行追踪，以说明 DG 神经元的下游投射（图 4A）。三周后，在 DG 区域观察到了 EGFP 标记的神经元（图 4A）。随后，我们检查了 EGFP 纤维的分布，发现 DG 神经元广泛投射到与认知、摄食和生殖调节相关的各种大脑区域，包括颗粒岛叶皮层（GI）、外侧下丘脑（LH）、Edinger-Westphal 核（EW）、动眼神经核（3N）、LC 和舌下神经核（12N）（图 4B）(Fig. 4B).

映射到 DG 神经元 ^MSI2 的单突触输入

我们向 Cre 依赖性辅助病毒（AAV2/9-EF1a-DIO-mCherry-F2a-TVA 和 AAV2/9-EF1a-DIO-RVG）注入到小鼠 DG 区域，以识别投射到 DG 神经元的脑区。三周后，通过向同一部位注射 RV-ENVA-EGFP 进行逆行追踪（图 5A）。

与之前的重组系统类似，辅助病毒 <span id=1>s id=2><span id=3>Cre 重组酶 ，用于转导神经元用红色荧光蛋白 <表达MSI2），<>12>从而规避缺失 TVA 受体糖蛋白（G 蛋白）<span id=21>RV 条目所必需的 。完整的 RV 将逆行标记的辅助病毒 （mCherry + EGFP） 转移到 MSI2 神经元中，随后用 EGFP 转导上游神经元细胞体 [26]。 在注射部位观察到 EGFP 和双标记神经元（图 5B）。 小鼠的冠状图像显示，DG^MSI2 神经元的主要输入神经元位于各种上游大脑区域，包括 A29、A30、PVN、ZI、PPTg、MVN、PAG、PnO、SNR、DMH、IPN 和 LC（图 5C）。统计分析表明，LC 中 EGFP 表达的神经元数量显著丰富（图 5D）。这些发现表明，LC 为 DG 的 MSI2 提供了最密集的神经支配。

LC–DG^MSI2is 关键的 for 正常的卵巢发育和发情周期

LC–DG 神经通路的存在通过逆行病毒追踪得到证实。一种仅由设计药物（DREADD）特异性激活的药理选择兴奋性设计受体被用来特异性地激活 LC 投射到 DG 中的 MSI2 神经元，以验证该通路在雌鼠发情周期和卵巢功能中的作用。在 MSI2CreERT2/+小鼠中，表达 Cre 依赖性 Flpo 重组酶的逆转录腺相关病毒（AAV/R-DIO-Flpo）被注射到 DG 中。 同时，表达 Flpo 依赖性 hM3Dq-mCherry 或 mCherry（AAV2/9-fDIO-hM3Dq-mCherry 或 AAV2/9-fDIO-mCherry）的 AAVs 被注入 LC 神经元，以实现 hM3Dq 或 mCherry 的特异性表达[27]。mCherry 的表达促进了 LC 投射到 DG 神经元（图 6A）的可视化。

此外，CNO 介导的 LC-DG^MSI2 神经元激活导致 1 小时内 增加 in LH 水平。相比之下，FSH 水平不受影响（图 6B）。这表明 a LC-DG^MSI2 神经元的单一化学激活会影响激素水平，重复激活可能会影响卵巢发育。 我们通过 <span id=16>administeringCNO 测试了 ><><<span id=19>每 2 day span id=21>，持续刺激 hM3Dq 组， 其中 projected 到 LC-DG^MSI2 神经元 ， 对于 a <span id=32>10 d<span id=33>ays。

如预期，慢性 CNO 处理降低了 hM3Dq 小鼠的排卵黄体，扰乱了发情周期（图 6C-D）。这些发现支持了以下观点： 激活 LC–DG 神经元会破坏雌性小鼠的生殖功能稳态，并导致表达 MSI2 的神经元发生改变 。

讨论

先前研究强调了 MSI2 在调节生育中的关键作用[28]。然而，其在中枢神经系统中的精确作用机制和定位尚不清楚。本研究在中央 DG 核中鉴定出表达 MSI2 的神经元，建立了与卵巢的神经联系。这一发现表明，中枢神经系统可能通过 DG 核将神经信号传递到卵巢，影响生育、发情周期和青春期。值得注意的是，MSI2 过表达的生殖细胞小鼠表现出生育能力降低[29]，而 MSI2 全身敲除小鼠的后代表现出严重的发育异常和高死亡率[30]。这些发现与先前研究一致，强调了 MSI2 在生育调节中的潜在作用。我们采用了 Cre-loxP 重组酶系统来检测 DG 和卵巢中 Msi2 敲除对幼崽数量的特定影响，以避免全身敲除导致的致命或严重的发育缺陷。我们的结果表明，条件性 Msi2 敲除使小鼠的幼崽数量增加了约 62.5%，没有观察到体重变化。 这些发现表明，MSI2 可能潜在地标记生殖特异性神经元.

先前研究使用 PRV 注射识别了 PVN、LHA、RPa 和 AP 中的 EGFP 标记的卵巢逆行神经元 RPa，以及 AP[26]。这些发现与早期研究一致，并加强了直接神经对卵巢功能的控制。PVN 是下丘脑的主要区域，将交感神经信息传递到卵巢。研究表明，生殖调节信号最初从 PVN 传递到节前交感神经元，然后它们将这些信号传递到支配卵巢神经支配的节后神经元 [31]。这条交感神经通路对直接调节卵巢功能做出了重大贡献，为卵巢功能与中枢神经系统之间的紧密联系提供了强有力的证据。

由于 KRT14 和 MSI2 主要 <span id=3>在 等外周组织中表达 ，如性腺，它们在大脑中的表达 <span id=6>以前报道过。然而， 采用命运映射策略到 我们仅在 DG 区域中检测到 KRT14 表达。因此，我们使用基因重组系统靶向 MSI2，主要在 Krt14^Cre/+ 小鼠的 DG 中。未来的研究应考虑使用 CNS AAV 递送方法 [32] 以促进 DG 中 MSI2 表达 神经元的敲除效应。 这种方法将进一步阐明 MSI2 在 HPG 轴中的作用是否由 DG 和 KRT14 神经元介导，从而有助于更深入地理解 MSI2 在神经内分泌调节中的潜在机制。

在 suppression of MSI2-expressing 神经元之后，小鼠卵泡数量减少， 表明 MSI2 影响卵巢卵泡的发育和排卵过程。在卵巢中，MSI2 可能通过调节关键信号通路来调节卵泡发育的速度和质量，thereby 影响排卵周期和卵母细胞质量这种调节可能涉及 ><span id=14 通路的相互作用，如 Notch、Wnt 等，以调节卵泡的发育和成熟 [14]。 在未来，可以使用诸如光遗传学、单细胞成像和光学记录等多种方法来研究 MSI2 表达神经元与下丘脑、垂体、卵巢等内分泌器官之间的相互作用以及生殖调节中的调控机制。

本研究存在一些局限性。首先，它没有确认大脑中表达 MSI2 的神经元亚型。未来的研究应采用单细胞转录组学方法，以阐明 MSI2 在 DG 核中的精确分布、突触连接和功能特性。采用先进的电生理技术，如脑区特异性光遗传学-电生理结合技术，将有助于研究 MSI2 在特定神经网络和信号通路中调节生殖功能的电生理特性和作用。

其次，Krt14^Cre/+ 小鼠在 DG 中 9>Msi2id=6>小鼠的正常发情没有改变雌性小鼠的正常发<情时间。相反，chemogenetic 激活 LC-DG^MSI2 神经回路导致 LH 水平显着增加， 再加上 不规则的发情周期 。这些发现表明小鼠排卵能力受损，a 黄体计数减少 ， 突出了 LH 在生殖调节中的关键作用 。 发情周期与排卵前过程密切相关，由低频 GnRH/LH 脉冲调节，导致雌二醇水平升高和更多卵泡成熟 [33]. 成熟卵泡合成更多雌二醇，刺激 kisspeptin 神经元，并诱导 LH 水平激增 。LH 水平 [34]。这些生殖障碍突出了来自 DG 的 MSI2 在 GnRH 脉冲和激增样释放中的关键作用。虽然 MSI2 在 HPG 轴中的神经调节作用可能比类固醇激素反馈更为微妙，但它仍然至关重要。未来的研究应通过利用光遗传学或电生理学等先进技术，探索 DG 和 MSI2 表达神经元在生殖和激素释放中的具体功能。 这些研究将进一步加深对生殖系统中 DG 核与其他投射核之间复杂相互作用的理解，从而推进我们对 HPG 机制的认识。 我们的理解 。

这些发现揭示了生殖神经内分泌调节的复杂机制，并为开发针对与代谢紊乱相关的生殖疾病（如厌食症、多囊卵巢综合征和肥胖）的创新疗法提供了新的见解。

致谢

我们感谢 Editage（www.editage.com）对这篇手稿的英语编辑和审阅。.

资金支持：

本研究得到国家自然科学基金委员会（项目编号 32060204，由 HL、XW、PL、DC 获得）；内蒙古自治区重点科学技术计划（项目编号 2021GG0199、2022YFHH0015，由 HL、XW、PL、DC 获得）；以及内蒙古农业大学职业技术学院优秀种质资源畜禽科技创新团队项目（项目编号 TDY202302，由 HL、XW、PL、DC 获得）的支持。.

作者贡献：

 刘浩东 ： 构思

郝东 刘： 方法论

邢王： 调查

杜春光 ： 监督

郝东 刘，PenghuiLi 写作——原始草案

郝东 刘, 王兴 ，Penghui 李 ，， 杜长光撰写—审稿与编辑

利益冲突： 作者无利益冲突需要声明。

数据和材料可用性： 所有数据均可在正文或补充材料中找到。

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图表标题

图 1. 海马区 KRT14 表达-表达神经元。（A）齿状回（DG）分为前部、中部和后部。随着 DG 范围的增大，KRT14 表达-表达神经元的数量也增加（n=4）。比例尺：100 μm。CA3，Ammonis Cornu 3；DG，齿状回；KRT14，角蛋白 14。

图 2. 从卵巢到中央 KRT14-和 MSI2-表达神经元（n=5）的逆行追踪。（A）顶部：用 PRV 标记的卵巢逆行神经通路示意图。底部：卵巢中 PRV 和 KRT14 的表达。右侧：描绘卵巢中 KRT14-和 MSI2-表达神经元的解剖图像。（B-G）冠切面显示 PVN、DMH、LHA、Pir、ZI、LC 和 BLA 中的 PRV 表达。刻度尺：100 μm。白箭头指示 KRT14、PRV 和 MSI2 的共定位。PVN，侧脑室旁核；DMH，背侧中脑；LHA，外侧下丘脑区；Pir，梨状皮层；ZI，不确定区；LC，蓝斑；BLA，基底外侧杏仁核；PRV，伪狂犬病病毒；KRT14，角蛋白 14；MSI2，Musashi-2。

图 3. Msi2 耗竭对 KRT14 神经元繁殖的影响。（A）免疫荧光结果显示 MSI2 在卵巢和 DG 区域的表达。（Msi2Flox/Flox n = 3；Krt14Cre/+Msi2Flox/Flox n = 3）。比例尺：100 μm。（B、C）Western blot 结果显示 MSI2 蛋白在卵巢和 DG 区域的表达。（Msi2Flox/Flox n = 7；Krt14Cre/+Msi2Flox/Flox n = 6），**p = 0.0010，**p = 0.0002，非配对 t 检验。 (D) RT-qPCR 结果显示卵巢和 DG 区域 Msi2 基因表达（Msi2Flox/Flox n = 5；Krt14Cre/+Msi2Flox/Flox n = 8），**p = 0.0066，**p = 0.0063，双因素方差分析。 （E）左侧：WT 小鼠的仔鼠大小，Msi2^Flox/Flox，和 Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox 小鼠（WT n = 8；Msi2^Flox/Flox n = 7；Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox n = 9），p = 0.0107，普通单因素方差分析。右侧：来自 Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox 小鼠的一窝仔鼠的代表性图像。 （F） Msi2^Flox/Flox 和 Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox 小鼠（Msi2^Flox/Flox n = 8; Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox n = 10），NS = 0.3648，NS = 0.6264，未配对的 t 检验。 （G） Msi2^Flox/Flox 和 Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox 小鼠（^{MSI2Flox/Flox} n = 7; Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox n = 7），p> 0.05，双向方差分析。方差分析，方差分析;AF，窦卵泡;DG，齿状回;CA1，<跨度 id=164>cornu 氨<跨度 id=166> 1;WT，野生型。

图 4. DG 神经元的顺行追踪。（A）左：表示顺行病毒注射的示意图；右：显示 DG 中病毒表达的荧光图像。（B）冠状切片显示 Gi、DMH、LH、EW、3N、LC 和 12N 中的 EGFP 阳性细胞（n=4）。刻度尺：100 μm。CA2，海马角 2；DG，齿状回；3V，第三脑室；Gi，巨细胞网状核；LH，外侧下丘脑；EW，Edinger-Westphal 核；3N，动眼神经核；LC，蓝斑；12N，舌下神经核；AP，后极区；SoI，伏隔核壳.

图 5. DG 神经元单突触输入。(A) 病毒注射时间表。(B) 展示 DG 中病毒表达的荧光图像。(C) 展示 A29、A30、PVN、ZI、PPTg、MVN、PAG、PnO、SNR、DMH、IPN 和 LC 冠状切片中 EGFP 阳性细胞的荧光图像。(D) 从 DG 投射的 RV 标记神经元总数（n=6）。比例尺：100 μm。 DG，齿状回；A29，扣带回，区域 29；A30，扣带回，区域 30；PVN，室旁核；ZI，不确定区；PPTg，前视丘核；PnO，前视丘核；MVN，内侧前庭核；PAG，导水管周围灰质；PnO，前视丘核；SNR，黑质致密部；LPAG，外侧导水管周围灰质；DMH，背内侧下丘脑；IPN，中间被盖核；LC，蓝斑。

图 6. 激活 MSI2^LC-DG 神经元影响 LH 水平和发情周期。（A） 左：S 化学表示描述 chemogeneticMSI2^LC-DG 神经元的激活;右图：R 表示性图像显示 MSI2^LC-DG 标记有 mCherry 的神经元。比例尺：100 μm。（B） Msi2^CreERT/+ 雌性小鼠（LC-DG：hM3Dq n = 8; LC-DG：mCherry n = 7，*p = 0.0315，NS = 0.8387，未配对的 t 检验）。 (C) 左：HE 染色卵巢切片 Msi2^CreERT/+ 小鼠；右：T 卵巢中黄体的数量。（LC-DG:hM3Dq n = 9；LC-DG:mCherry n = 8, *p = 0.0363，非配对 t 检验）。(D) Msi2CreERT/+ 小鼠 10 天发情周期的变化（LC-DG:hM3Dq n = 6；LC-DG:mCherry n = 6），****p < 0.0001，双因素方差分析）。HE，苏木精和伊红；LH，促黄体生成素；FSH，促卵泡激素；CL，黄体；P，发情前期；E，发情期；M/D，发情后期/静止期

补充图 1。 KRT14 阴性对照的免疫荧光

(A) Krt14^Cre/+tdTomato^Tom/+ 和 tdTomato^Tom/+ 小鼠脑切片在相应的 Alexa 405（蓝色）和 Alexa 561（红色）激发波长下进行了免疫荧光扫描。

补充图 2。MSI2 在小鼠脑中的表达

(A) 第三脑室 ； 外侧隔核 ； 下丘脑内侧隔核 ；LV，外侧脑室；ARC，弓状核；Rt，网状核；scp，上丘脑脚；GP，苍白球；RSD， 后颞叶皮质 ；PVN，室旁核；4V，第四脑室；Lat，外侧小脑；LC， 蓝斑 ；DCDp，背侧耳蜗核。

补充图 3。MSI2 和 nNOS 共标

4V， 第四脑室；LDT， 外侧背侧被盖核；LC，蓝斑；nNOS， 神经元型一氧化氮合酶

kr14^Cre/+Msi2^Flox/Flox

补充图 4。小鼠毛囊计数

A-A’，《，Msi2^Flox/Flox 小鼠卵巢连续切片；Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox 小鼠卵巢连续切片；C，《，卵巢代表性切片来自 Msi2^Flox/FloxMsi2^Flox/Flox（PMSG 处理），Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox 和 Krt14^Cre/+Msi2^Flox/ id=52>Flox (PMSG 治疗)小鼠; D, Msi2^Flox/Flox, Msi2^Flox/Flox (PMSG 治疗),Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox 和 Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox (PMSG 治疗)小鼠卵泡计数 n = 8 每组， 盐水:**p = 0.0011，PMSG:**p = 0.0033，two-way ANOVA。

补充图 5. 差异基因表达火山图

每个点代表一个基因， 绿色和红色点表示 p 值 ＜ 0.05， 黑色点表示的 p 值＞ 0.05。

补充图 6. KEGG 富集通路

补充图 7。GO 功能分类

补充图 8。小鼠卵巢类固醇合成酶表达

(A) 卵巢组织中 P450 的免疫荧光阳性，A'表示卵巢上 P450 的免疫阳性。(B) 卵巢上 StAR 的免疫荧光阳性，B'表示卵巢上 StAR 的免疫阳性。(C) 卵巢中 HSD3B1 的免疫荧光阳性，C'表示卵巢上 HSD3B1 的免疫阳性。(D) 卵巢上 MSI2 的免疫荧光阳性，D'表示卵巢上 MSI2 的免疫阳性。标尺：100 μm。DAPI：4',6-二氨基-2-苯基吲哚（一种荧光染料）；P450：细胞色素 P450；StAR：类固醇生成急性调节蛋白；3β-HSD：3β-羟基类固醇脱氢酶-1；MSI2：Musashi-2 蛋白。

补充图 9. 小鼠卵巢和 DG 中类固醇合成酶蛋白的表达（A）Western 印迹结果显示，在 Cre–LoxP 重组后卵巢中 Hsd3b1 和 Star 蛋白表达增加。每组 n = 7；**p = 0.0062，**p = 0.0020，非配对 t 检验。（B）Western 印迹结果显示，在 Cre–LoxP 重组后卵巢中 P450 蛋白表达降低。每组 n = 5；**p = 0.0012，非配对 t 检验。 （C） < < span id=21>StAR 和 P450 mRNA 水平 span id=25>Msi2^Flox/Floxvs.的卵巢中 mRNA 水平 Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Flox 小鼠。n = 4 per 群;*p = 0.0163， ***p = 0.0008， ***p = 0.0007， ****p < 0.0001，双向方差分析。（D） << span id=50>>>^Flox/Flox5Flox Krt14^Cre/+Msi2^Flox/Floxmice。 每组 n = 5；**p = 0.0025，****p < 0.0001，**p = 0.0022，***p = 0.0003，双因素方差分析。 P450：细胞色素 P450；StAR：类固醇生成急性调节蛋白；Hsd3b1：3β- 羟类固醇脱氢酶-1；MSI2：Musashi 蛋白。

表 1. 通过从尾部活检提取的 DNA 进行 PCR 确认的小鼠基因型

表2. 病毒和化学信息

表3. 抗体信息

补充表 1. 测序数据统计表

补充表 2. 差异基因表达