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透射电子显微镜病毒检测：诊断仍具价值且提升生物安全性

菲利普·鲁安杰 1 , 2 1 , 2 ^(1,2){ }^{1,2} （D）| 皮埃尔-伊万·雷纳尔 2 2 ^(2){ }^{2} | 塞巴斯蒂安·埃米厄 1 , 2 1 , 2 ^(1,2){ }^{1,2} | 艾曼纽·布朗夏尔 1 , 2 1 , 2 ^(1,2){ }^{1,2}

1 1 ^(1){ }^{1} 法国图尔大学及图尔大学医院 INSERM U1259 研究所，法国图尔
2 2 ^(2){ }^{2} 法国图尔大学及图尔大学医院 IBiSA 电子显微镜平台，法国图尔

  通信

菲利普·鲁安雅，法国国家健康与医学研究院（INSERM）U1259 单位，细胞生物学与电子显微镜实验室，医学院，通奈大道 10 号，37032 图尔，法国。
电子邮件：roingeard@med.univ-tours.fr

  摘要

摘要 透射电子显微镜（TEM）凭借其纳米级分辨率，成为唯一能直接观察病毒的成像技术。20 世纪 60 年代至 90 年代，TEM 助力发现了多种病毒类型，并作为诊断工具直接识别悬浮液中的病毒，或通过接触临床样本的体外培养哺乳动物细胞组织切片进行病毒鉴定。随着酶联免疫吸附试验（ELISA）和 PCR 等高灵敏度技术的出现，90 年代病毒感染的诊断水平显著提升，TEM 在此领域的应用逐渐被淘汰。然而过去 20 年证明，该技术因其"广谱捕获"特性，在特定场景中仍具价值——无需预判目标病原体即可通过病毒可视化实现诊断。因此在分子技术无法确定病原体的多次重大疫情中，TEM 提供了关键答案。常规诊断中，TEM 偶尔仍用于分子检测未能确诊的感染病例特征分析。 此外，它还用于检测生物制品的微生物安全性。许多生物制药产品在可能含有鲜为人知且难以检测的病毒的动物细胞中生产。在此背景下，透射电子显微镜（TEM）的“全面捕捉”特性使其能够记录这些产品中病毒或病毒样颗粒的存在。

  关键词

电子显微镜技术、病毒诊断、病毒安全性、病毒

  1 | 历史

第一台透射电子显微镜由恩斯特·鲁斯卡与其博士导师马克斯·克诺尔在20世纪30年代初研制成功。 1 , 2 1 , 2 ^(1,2){ }^{1,2} 该显微镜的分辨率远超当时任何光学显微镜，有望为众多领域带来革命性变革。
科学领域的多个方面，包括细胞生物学和病毒学。Ernst Ruska 是一位物理学家（1986 年诺贝尔物理学奖得主），但他的接受过医学训练的弟弟 Helmut Ruska 迅速认识到这种显微镜在研究病毒性质方面的潜力。 3 3 ^(3){ }^{3} 在 20 世纪 40 年代初，病毒是根据其宿主和引起的临床症状进行分类的。尽管当时缺乏为透射电子显微镜（TEM）准备的生物样本的既定方法，Helmut Ruska 仍能够描述几种病毒的形态，并根据病毒颗粒的大小和形状开发了一种粗略的病毒分类。 4 4 ^(4){ }^{4} TEM 很快在临床病毒学中得到了首次重要应用：用于由天花病毒引起的天花的鉴别诊断
根据对患者皮肤水疱中液体样本的研究，痘病毒家族引起的天花，以及疱疹家族水痘-带状疱疹病毒引起的水痘。 5 5 ^(5){ }^{5} 水痘病毒呈球形，直径140至150纳米，具有中央体结构，明显不同于更大、砖块形状的天花病毒。

1.1 | 透射电子显微镜在病毒发现及1990年代前常规诊断中的作用

负染技术的引入，基于生物颗粒的水悬液沉积在碳膜载网上并用重金属盐（如醋酸铀或磷钨酸）染色，改善了病毒颗粒的观察，为后续研究铺平了道路。
透射电子显微镜（TEM）在基础病毒学及病毒感染快速诊断中的广泛应用 6 6 ^(6){ }^{6} （图 1A-D）。负染色技术能清晰区分病毒颗粒与背景，并提供精确的形态学信息（例如对称性、有无包膜等），从而促进病毒的特异性鉴定，或至少将其归类至形态相似的病毒组。20 世纪 70 至 80 年代是 TEM 病毒研究应用的鼎盛时期，该技术助力发现了许多临床重要病毒，如腺病毒、肠道病毒、副粘病毒和呼肠孤病毒——这些病毒均通过体外细胞培养增殖后被分离观察到。病毒尺寸与精细结构的差异被用作更精确分类的标准 7 7 ^(7){ }^{7} 。然而，TEM 最初未能检测出肝炎和胃肠炎等疾病的病原体，因为这些致病病毒无法在体外细胞培养中增殖。尽管如此，TEM 的应用仍...
图 1 通过透射电子显微镜（TEM）进行病毒感染的诊断。A 至 C 面板展示了用于常规诊断的人类生物样本中病毒的负染色 TEM 图像。面板 A A AA 和 B B BB 展示了从皮肤水疱液中提取的疱疹病毒 ( A ) ( A ) (A)(A) 与副痘病毒 ( B ) ( B ) (B)(B) 的快速形态学鉴别诊断。面板 C C CC 和 D D DD 则呈现了粪便中轮状病毒（ C C CC ）与腺病毒（ D D DD ）的快速形态学鉴别诊断。面板 E E EE 和 F F FF 显示了人体组织或细胞的超薄切片（插图为高倍放大）：E 为人类皮肤活检样本中的副痘病毒（Orf 病毒）感染；F 为移植受者尿液样本细胞中的多瘤病毒（BK 病毒）感染。比例尺对应 100 纳米（A、C、D）、200 纳米（B、E）或 500 nm ( F ) 500 nm ( F ) 500nm(F)500 \mathrm{~nm}(F) 。
20 世纪 70 年代，对血浆、尿液和粪便等“脏”临床样本的研究为这些病毒的研究带来了重大突破。 8 8 ^(8){ }^{8} 肝炎的病原体 B 9 B 9 B^(9)B^{9} 和 A 10 A 10 A^(10)A^{10} 分别在血浆和粪便样本中被检测到。BK 病毒（一种多瘤病毒）首次在肾移植患者的尿液中鉴定出来。 11 11 ^(11){ }^{11} 轮状病毒也通过透射电镜（TEM）被确认为人类和动物流行性胃肠炎的主要原因。 12 , 13 12 , 13 ^(12,13){ }^{12,13} 然而，还发现许多其他病毒也会引发胃肠炎。其中首个被发现的病毒是诺瓦克病毒，它在美国俄亥俄州诺瓦克市的一次胃肠炎暴发中被鉴定。 14 , 15 14 , 15 ^(14,15){ }^{14,15} 随后在其他地方也发现了形态相似的病毒，并被称为“类诺瓦克病毒”，以反映它们在透射电镜下外观的相似性， 16 16 ^(16){ }^{16} 之后这些病毒被正式更名为“诺如病毒”。 17 17 ^(17){ }^{17} 在患有胃肠炎的儿童粪便样本中，还鉴定出了来自腺病毒科 18 18 ^(18){ }^{18} 、星状病毒科 19 , 20 19 , 20 ^(19,20){ }^{19,20} 和杯状病毒科 21 21 ^(21){ }^{21} 的其他病毒。 因此，透射电子显微镜（TEM）被广泛用于负染样本的常规诊断，作为一种快速、“全面”的方法，用于区分可能引发人类胃肠炎的多种病毒，能在样本送达实验室后 15 分钟内提供诊断结果。
图 2 通过透射电子显微镜（TEM）检测进行性多灶性白质脑病患者脑活检标本超薄切片中的多瘤病毒（JC 病毒）。A、箭头指示细胞核内两处含有大量病毒颗粒的区域。B、高倍镜下细胞核内的 JC 病毒颗粒。比例尺分别标注为 2 μ m ( A ) 2 μ m ( A ) 2mum(A)2 \mu \mathrm{~m}(\mathrm{~A}) 或 0.5 μ m 0.5 μ m 0.5 mum0.5 \mu \mathrm{~m} （B 部分）。
尽管由于需要将样本包埋于树脂中并用超薄切片机制作超薄切片而更为耗时，透射电镜在医学病毒学领域——尤其是组织内病毒搜寻方面——同样被证实具有重要价值。图 1 中的 E 组和 F 组图像分别展示了从严重手指 u ′ u ′ u^(')u^{\prime} 溃疡 22 22 ^(22)^{22} 患者的皮肤活检标本中观察到的副痘病毒（羊口疮病毒），以及从伴有肾病 23 23 ^(23){ }^{23} 的肾移植患者尿液中采集细胞时发现的另一多瘤病毒（BK 病毒）。

1.2 | 自 20 世纪 90 年代起，透射电子显微镜（TEM）不再常规用于病毒诊断

20 世纪 90 年代，随着酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链反应等更灵敏分子技术的出现，病毒感染的诊断发生了重大变革
图 3 通过透射电子显微镜（TEM）在超薄切片中检测到一株呼肠孤病毒，该细胞系培养物中添加了急性坏死性脑病患儿的咽拭子样本。A 图中的白色方框对应 B 图高倍放大区域。比例尺标注为 2 μ m ( A ) 2 μ m ( A ) 2mum(A)2 \mu \mathrm{~m}(A) 或 200 nm ( B ) 200 nm ( B ) 200nm(B)200 \mathrm{~nm}(B)
特别是聚合酶链式反应（PCR）。分子技术因其更高的灵敏度和易于处理大量样本的优势，在许多病毒学诊断领域取代了透射电子显微镜（TEM）。这在病毒性胃肠炎的诊断中尤为明显，针对人类胃肠炎涉及的多数病毒家族，现已建立起相应的分子检测技术。 24 − 27 24 − 27 ^(24-27){ }^{24-27} 类似的技术转变也发生在兽医学领域，ELISAs 和 PCR 逐步取代 TEM 成为病毒感染的常规诊断手段。 28 − 31 28 − 31 ^(28-31){ }^{28-31} 在人类医学中，自 1980 年全球疫苗接种计划成功根除天花病毒后，已不再需要使用 TEM 来区分天花病毒与其他存在于皮肤水疱液中的病毒。 32 32 ^(32){ }^{32} 有观点认为，在生物恐怖主义背景下，TEM 对此类应用仍具有潜在价值。 33 , 34 33 , 34 ^(33,34){ }^{33,34} 然而，天花重现的风险极小，即便在极不可能发生的情况下，分子诊断技术也必将超越 TEM 的表现。 因此，将透射电子显微镜（TEM）用于诊断目的的实验室数量已显著减少。

2 | TEM 在病毒感染诊断中的当前作用

TEM 在解决医学病毒学中的某些诊断难题方面仍然非常有用，这一点在多个显著案例中得到了清晰印证。
在过去 20 年中，大多数情况下透射电子显微镜（TEM）并非直接用于患者样本中的病毒表征，而是通过体外细胞培养从临床样本中分离病毒后再进行观察。1995 年澳大利亚爆发马匹致命性呼吸道疾病及人类流感样病症期间，TEM 对鉴定新型亨德拉病毒起到关键作用——根据其超微结构特征，该病毒被确认为副粘病毒科成员。 35 35 ^(35){ }^{35} 相关病毒尼帕病毒同样于 1999 年首次通过 TEM 在脑脊液样本中发现，当时马来西亚和新加坡爆发了与猪接触人群的脑炎疫情。 36 , 37 36 , 37 ^(36,37){ }^{36,37} 2003 年香港及华南地区严重急性呼吸综合征（SARS）大流行的病原学最初也由 TEM 确定。全球多个实验室通过呼吸道标本接种细胞培养，在这些细胞的超薄 TEM 切片中鉴定出了冠状病毒。 2003 年美国爆发了一起与草原犬鼠疾病相关的人类不明皮疹疫情。透射电子显微镜（TEM）在细胞培养分离物中检测到痘病毒存在，后经鉴定该病毒为猴痘病毒。2011 年中国六省出现的急性重症发热伴血小板减少综合征（SFTS）病原体，通过 TEM 技术对患者血样培养细胞进行研究得以确诊。TEM 观察显示存在具有布尼亚病毒典型形态特征的病毒颗粒。
图 4 用于生物制品生产的啮齿类细胞中内源性逆转录病毒的检测。透射电子显微镜（TEM）对超薄细胞切片的检查可显示胞质内（A,B）或内质网池（C,D）A 型逆转录病毒颗粒的存在。图中所有标尺均代表 200 纳米。
布尼亚病毒典型形态特征。RNA 序列分析证实该病毒实为布尼亚病毒科白蛉病毒属的新成员。
TEM 还成功用于阐明小型传播集群中无法解释的症状，甚至孤立病例。例如，2006 年在美国，它被用于移植受者出现移植物功能障碍、发热和精神状态改变的病例。在一位患者的脑脊液样本培养的 Vero 细胞超薄切片中，观察到沙粒病毒科的一种病毒。 42 42 ^(42){ }^{42} 随后使用 PCR 对该病毒进行了更详细的鉴定，确认为淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV），这是一种由啮齿动物传播的沙粒病毒。TEM 还用于 2006 年在美国一位患有不明原因出血热的患者皮肤标本中鉴定西尼罗河病毒 43 43 ^(43){ }^{43} 。通过在皮肤活检标本匀浆培养的 Vero 细胞超薄切片中观察，确认了该病毒。在美国，还有几例布尼亚病毒感染病例通过 TEM 诊断，患者被蚊子或蜱虫叮咬后出现脑炎 44 44 ^(44){ }^{44} 或发热和疲劳综合征。 2014 年，奥地利某医院新生儿群体出现败血症样病症，初始微生物检测结果呈阴性后，透射电子显微镜（TEM）在其尿液样本中鉴定出微小核糖核酸病毒。 46 46 ^(46){ }^{46} TEM 还实现了对多瘤病毒（JC 病毒）的直接检测，该病毒存在于
脑组织中，可引发致命性进行性多灶性白质脑病病例，而脑脊液中未检出病毒 DNA 47 47 ^(47){ }^{47} （图 2）。TEM 在人类胃肠炎病例中仍偶有应用，用于识别腺病毒、 48 48 ^(48){ }^{48} 微小核糖核酸病毒、 49 49 ^(49){ }^{49} 或杯状病毒等分子技术未能识别的病毒新亚型 50 50 ^(50){ }^{50} 。
因此，近年来，透射电子显微镜（TEM）在病毒感染诊断中的作用已从常规应用转变为特定疫情或病毒传播集群中未知传染源的初步筛查工具。在此类调查中，该技术“一网打尽”的底层原理成为识别未知病原体的主要优势，因为不同病毒家族的形态特征各异，这正是 TEM 进行病毒初步鉴定的基础。这种方法提供了“开放视野”，有时能揭示意料之外的病原体，而分子检测方法则需要预先了解待测病毒的信息。TEM 的另一优势在于其可能识别出由多种病毒引起的双重或多重感染，这些情况可能被分子或抗原检测所遗漏。此外，待分析样本的类型可以多种多样，包括直接检测的体液或活检组织，以及经细胞培养后的样本。
在某些情况下，TEM 也被用于验证先前通过分子技术确定的诊断结果。 51 − 54 51 − 54 ^(51-54){ }^{51-54} 如图 3 所示
图 5 在用于生物制品生产的啮齿类细胞表面检测到逆转录病毒出芽现象。这四张超薄细胞切片通过透射电子显微镜（TEM）观察，展示了 C 型逆转录病毒颗粒在质膜处出芽并释放到细胞外介质中的过程。箭头所指病毒在高倍放大插图中显示。比例尺代表 200 nm ( A , D ) 200 nm ( A , D ) 200nm(A,D)200 \mathrm{~nm}(A, D) 或 500 nm ( B , C ) 500 nm ( B , C ) 500nm(B,C)500 \mathrm{~nm}(B, C)
在 MRC5 细胞培养过程中，从两名患有不明原因脑炎神经系统症状儿童的尿液和喉拭子样本中检测到一株呼肠孤病毒。此案例中，透射电镜结果证实了分子技术检测结果，并协助鉴定出一种先前未知的呼肠孤病毒株作为脑炎的病原体。 55 55 ^(55){ }^{55}
在兽医学领域，透射电子显微镜（TEM）常被证实对识别导致特定疾病爆发的病毒具有重要作用。 56 − 65 56 − 65 ^(56-65){ }^{56-65} 利用康复期家畜或野生动物的血清进行免疫-TEM 检测，在因缺乏免疫试剂和引物而使得其他诊断方法失效的情况下，对未知病原体的发现尤为有效。 66 66 ^(66){ }^{66}

3 | TEM IN VIRAL SAFETY

透射电子显微镜（TEM）也被认为是评估生物制药产品病毒安全性的重要方法。美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMEA）的指南中推荐使用 TEM，并明确了需要检测的材料，包括细胞系、培养上清液和发酵罐批量收获物。 67 , 68 67 , 68 ^(67,68){ }^{67,68} 尽管 TEM 耗时且灵敏度有限，但因其“全面捕获”的特性，特别推荐作为体外检测和分子技术的补充方法。现行关于生物制药产品中使用动物源性成分的法规规定了一系列源头检测和生产措施，以最大限度地降低病毒污染的潜在风险。用于病毒检测的体外检测方法选用了一系列历史上成功检测多种潜在病毒污染物的细胞系。 69 69 ^(69){ }^{69} 这些方法可用于细胞库中培养基的检测，以及原材料（如细胞培养中使用的牛血清或其他动物源性生长因子）的检测。 然而，感染可能在培养细胞中发生而不伴随细胞病变效应，此类感染可能被遗漏。可采用多种其他分子检测方法，如针对逆转录病毒特异的荧光产物增强逆转录技术（FPERT） 70 70 ^(70){ }^{70} ，或在风险评估中发现特定风险时使用基于 PCR 的检测。通过综合运用这些方法，可以覆盖广泛的潜在污染物范围，尽管始终无法提供 100 % 100 % 100%100 \% 绝对无外源因子的保证。在此背景下，透射电子显微镜（TEM）作为生物制品病毒安全性检测的附加手段，能够记录主细胞库或发酵罐批量收获物中可能存在的病毒或病毒样颗粒。
啮齿动物细胞系被广泛用于生产人类药用重组蛋白，如单克隆抗体、疫苗以及基因治疗用的病毒载体。这些细胞系长期以来被认为含有逆转录病毒元件，因为啮齿动物基因组中包含许多内源性逆转录病毒样序列的拷贝。 71 71 ^(71){ }^{71} 这些细胞产生的大多数病毒颗粒（如胞质内或池内 A 型颗粒）是有缺陷且无感染性的（图 4）。然而，其他颗粒（如 C 型颗粒）会在细胞表面出芽，并可能感染非啮齿动物细胞 72 72 ^(72){ }^{72} （图 5）。一些鼠类逆转录病毒已被证明在灵长类动物中具有致瘤性， 73 73 ^(73){ }^{73} 并且有报道称患有白血病的儿童病例中出现了...
通过使用鼠逆转录病毒载体的基因疗法治疗严重联合免疫缺陷症。 74 74 ^(74){ }^{74} 所有这些因素都表明，追踪源自啮齿动物细胞的生物制品中逆转录病毒的存在具有相关性。由于细胞来源的 DNA 聚合酶导致的高背景水平，对批量收获物进行的逆转酶检测常常受到阻碍。 75 75 ^(75){ }^{75} 因此，透射电子显微镜（TEM）可能有助于记录这些批量收获物中逆转录病毒样颗粒的存在（图 6）。TEM 还可用于测量病毒颗粒的浓度，以验证逆转录病毒或任何其他疑似存在于主细胞库中的病毒的清除情况。幸运的是，中国仓鼠卵巢 ( CHO ) ( CHO ) (CHO)(\mathrm{CHO}) 细胞系（生物技术行业用于生产生物制品的主要啮齿动物细胞系）中存在的内源性逆转录病毒已被证明是非感染性的。 76 76 ^(76){ }^{76} 对于这种特性明确的细胞系，目前的检测要求低于那些经验更为有限的其他细胞系。尽管如此，
图 6 通过透射电子显微镜（TEM）负染色法检测用于生物制品生产的啮齿动物细胞批量收获物中逆转录病毒样颗粒的存在。两图中的比例尺均代表 200 纳米。
新型细胞基质，尤其是昆虫细胞系，正被引入生物技术产业。 77 77 ^(77){ }^{77} 它们的使用将带来对未知病毒的新担忧，这些病毒存在潜在的污染风险，而透射电子显微镜无疑将有助于记录这些细胞及其衍生制品中病毒或病毒样颗粒的存在。

  4 | 结束语

综上所述，尽管透射电子显微镜（TEM）有时被视为一种略显“过时”的技术，但它在病毒检测领域仍扮演着重要角色。该技术尤其适用于识别特定疫情或传播集群中涉及的未知病原体。在常规诊断中，TEM 可用于确认病毒感染，甚至在某些情况下指导诊断决策。此外，该技术还能用于生物制药产品的病毒安全性验证。然而，TEM 也存在若干缺点，包括电子显微镜及其维护成本高昂、需要训练有素的专业操作人员，以及耗时较长的分析过程——特别是当样本需要进行树脂包埋和超薄切片时。但值得注意的是，所有检测技术皆有利弊，而它们的互补特性意味着联合使用能带来额外优势。就此而言，TEM 的核心优势在于能提供病毒的直接成像，从而为检测结果提供更可靠的视觉依据。

  致谢

我们要感谢 Fabienne Arcanger、Sonia Georgeault、Christine Hayot 和 Juliette Rousseau 在透射电子显微镜技术方面给予的宝贵帮助。本手稿中的 TEM 照片均为我们实验室制作的原始图像。图尔大学的电子显微镜实验室和图尔大学医院是法国 IBiSA 网络的一部分。

  利益冲突

作者无竞争利益。

ORCID

菲利普·罗安杰（D）http://orcid.org/0000-0001-9131-3341

  参考文献

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引用格式说明：Roingeard P、Raynal P-I、Eymieux S、Blanchard E。透射电子显微镜病毒检测技术：诊断价值犹存与生物安全优势。《医学病毒学评论》。2019;29:e2019。https://doi.org/10.1002/rmv。2019
  1. 缩略词表：ELISA，酶联免疫吸附试验；EM，电子显微镜；EMEA，欧洲药品管理局；FDA，美国食品药品监督管理局；FPERT，荧光产物增强逆转录；LCMV，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒；PCR，聚合酶链式反应；SARS，严重急性呼吸综合征；SFTS，发热伴血小板减少综合征；TEM，透射电子显微镜