自然风光 |第 610 卷 |13 年 10月 2022 日 |327
品
产前免疫应激使小胶质细胞反应迟钝，损害神经回路
Lindsay N. Hayes， Kyongman An， Elisa Carloni， Fangze Li， Elizabeth Vincent， Chloë Trippaers， Manish Paranjpe， Gül Dölen， Loyal A. Goff， Adriana Ramos， Shin-ichi Kano& Akira Sawa✉
最近的研究表明，小胶质细胞是主要的脑免疫细胞，可以影响回路连接和神经元功能。小胶质细胞在胚胎发育的早期浸润神经上皮细胞，并在整个成年期维持在大脑中。一些母体环境因素（如微生物组异常、免疫激活和营养不良）会影响产前大脑发育。然而，尚不清楚产前环境的变化如何指导浸润小胶质细胞的发育轨迹，进而影响大脑发育和功能。在这里，我们表明，在小鼠体内母体免疫激活 （MIA） 后，来自后代的小胶质细胞在整个发育轨迹中的免疫反应性（迟钝）长期降低。免疫反应减弱伴随着染色质可及性的变化和开放染色质的转录因子占有率降低。单细胞 RNA 测序分析显示，MIA 不会诱导不同的亚群，而是会降低对炎性小胶质细胞状态的贡献。用幼稚小胶质细胞的生理浸润对 MIA 后代的小胶质细胞进行产前置换，改善了免疫减弱，并恢复了突触前囊泡释放到多巴胺受体 2 型中棘神经元上的概率降低，表明由于不利的产前环境而异常形成的小胶质细胞影响了小胶质细胞的长期反应性和适当的纹状体回路发育。
小胶质细胞是原代的脑免疫细胞，在整个生命周期中具有许多功能。它们的主要功能是快速免疫激活以保护大脑，但小胶质细胞免疫激活功能障碍会导致周围神经元和神经胶质细胞的不良结果。由于小胶质细胞是早期进入大脑的长寿细胞，因此在早期发育到达的异常小胶质细胞可能在调节这些细胞间相互作用方面发挥关键作用，贯穿健康和疾病的轨迹。几项研究表明，产前压力对以后的大脑发育和功能有影响。然而，小胶质细胞在产前应激引起的长期变化中的作用和机制尚不清楚。
成年 MIA 后代的小胶质细胞反应性变钝
为了解决这一知识差距，我们测试了产前免疫应激源 （MIA） 是否影响小胶质细胞功能，包括免疫激活。为了产生 MIA 后代，我们在胚胎第 9.5 天 （E9.5） 向怀孕的母体递送免疫激活剂（聚肌苷酸：聚胞苷酸 （PIC）），以靶向浸润神经上皮的第一波小胶质细胞。研究 MIA 如何影响后代免疫反应
我们在体内向成年后代注射促炎刺激物 （脂多糖 （LPS） ） 或盐水 （SAL），分离小胶质细胞并分析基因表达谱（扩展数据图 1）。首先，我们比较了 MIA 后代 （MIA 小胶质细胞） 和对照后代 （CON 小胶质细胞） 的小胶质细胞之间的基因表达。SAL 处理后，我们仅观察到 MIA 和 CON 小胶质细胞之间的 7 个差异表达基因 （DEG）（图 1a 和扩展数据图 2）。相比之下，我们在 LPS 处理后在 MIA 和 CON 小胶质细胞之间鉴定了 401 个 DEGs（图 1a 和扩展数据图 2）。有趣的是，与 CON 小胶质细胞相比，大多数 DEGs （76%） 在 MIA 中下调（图 1a）。此外，DEGs 对许多免疫反应通路显示出显著的负富集（图 1b）。总之，MIA 小胶质细胞的成体免疫反应性显著降低，尽管 MIA 和 CON 小胶质细胞之间的基线 （SAL） 基因表达相似。
为了直接解决 MIA 小胶质细胞免疫反应性降低的问题，我们比较了 LPS 和 SAL 治疗之间的小胶质细胞基因表达 （LPS 反应基因）。在 CON 小胶质细胞中，LPS 和 SAL 治疗之间有 5,624 个基因差异表达，而在 MIA 小胶质细胞中，LPS 和 SAL 治疗之间差异表达的基因较少 （4,284） （图 1c 和扩展数据图 2）。
https://doi.org/10.1038/s41586-022-05274-z
收稿日期： 2019-05-08
录用日期： 2022-08-24
在线发布：2022 年 9 月 28 日
检查更新
1Solomon H. Snyder 美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系。约翰霍普金斯大学医学院精神病学和行为科学系，美国马里兰州巴尔的摩。美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院 McKusick-Nathans 遗传医学研究所。哈塞尔特大学生物医学研究所，哈塞尔特，比利时。美国阿拉巴马大学伯明翰分校 Heersink 医学院精神病学和行为神经生物学系。美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院生物医学工程。美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院药理学和分子科学。约翰霍普金斯大学医学院彭博公共卫生学院心理健康，美国马里兰州巴尔的摩。✉电子邮件： asawa1@jh.edu
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品
1
2
3
6
4
7
8
9
5
10
11
a
d
病毒反应
蛋白
地方化
RNA
加工
染色体
增殖
译本
蛋白
MIS/折叠
免疫的
线粒体
细胞凋亡
金属
捆绑
RNA 加工
其他
泛素
转录
新陈代谢：
脂肪酸
氧化还原/
OxPhos 公司
呼吸
TCA
Blunted
Enhanced
CON 和 MIA 中的通路分析 （SAL/LPS）
q-value ratio
e
f
g
i
h
c
CON
MIA
2,267
927
3,357
b
免疫的
对病毒的防御反应 对 I 型干扰素的反应 模式识别受体信号通路的正调节 IFNγ 介导的信号通路 先天免疫反应的负调节
细胞质翻译 核转录 mRNA 分解代谢过程 翻译起始 病毒基因表达
核转录的 mRNA 分解代谢过程 无义介导的衰变 建立蛋白质定位到膜 蛋白质靶向到膜 共翻译蛋白靶向到膜 蛋白质定位到内质网 蛋白质定位到内质网的建立
ER核糖体的结构成分
基因调控
Memb
*
0
5
10
15
SAL LPS
血清 IL-6 （log
2
， AU）
j
康米亚
1
10
100
Ccl3
表达
集群 2
0
5
10
15
20
到 soma 的距离
交叉路口数
背肌
到 soma 的距离
腹侧 Str
0
10 20 30 40 50 0
10 20 30 40 50
CON:SAL
CON:LPS
MIA:SAL
MIA:LPS
k
1
10
100
1,000
Ccl12
表达
集群 5
CON
MIA
1
10
100
Cxcl10
表达
集群 11
CON
MIA
20
25
30
35
40
0
5
10
15
20
0
1
2
3
4
5
簇
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
P = 0.04
P = 0.1
P = 0.08
每个样品的细胞数 （%）
每个样品的细胞数 （%）
每个样品的细胞数 （%）
−10
−5
0
5
10
−10
−5
10
0
5
FC （log） CON
FC （对数
2
） MIA
斜率 = 0.71
CCC = 0.81
−10
−5
0
5
10
−10
−5
10
CON
MIA
Both
0 5
FC （log） CON
FC （对数
2
） MIA
2,260
916
1,050
1,946
CON
MIA
SAL LPS
SAL LPS
0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
背肌
小胶质细胞中的 CD68 （%）
腹侧 Str
*
*
*
群
CON
MIA
Trt
SAL
LPS
NS
*
地区
群
CON
MIA
D Str
V Str
× 组 Trt
Trt
SAL LPS NS
NS
NS
401
SAL
LPS
5
96
305
2
*
地区
群
CON
MIA
D Str
V Str
× 组 Trt
Trt
SAL
LPS
NS
*
*
核酸外切酶活性 对核糖核酸或脱氧核糖核酸具有活性 脱氧核糖核苷酸代谢过程 催化活性作用于 RNA 核酸外切酶活性
图 1 |MIA 后小胶质细胞免疫反应减弱。a， DEGs （q < 0.05）
急性 SAL 或 LPS 治疗后 MIA 和 CON 小胶质细胞之间。b， 急性 LPS 治疗后 MIA 和 CON 小胶质细胞之间 a 中 DEGs 富集量排名前 20 的基因集。显示了 MIA 小胶质细胞的减少（蓝色）和 MIA 小胶质细胞（橙色）的增强。ER，内质网;memb，膜。c， 与 MIA 小胶质细胞相比，CON 小胶质细胞中 SAL 和 LPS 之间的 DEGs （q < 0.05）。d，e，倍数变化的图 （d） 和线性回归 （e） （FC;LPS/SAL） 用于 CON 和 MIA（粉红色）、仅 CON （黑色）或仅 MIA（红色）小胶质细胞中 LPS 诱导的 DEGs。这些数字显示每个部分中 LPS 响应的 DEG。蓝线显示线性拟合（斜率 = 0.71，CCC = 0.81）。f， CON 和 MIA 小胶质细胞之间 LPS 反应基因的预排序基因集富集分析的比较。圆圈是基因本体论 （GO） 术语，颜色表示 q 值比率 （q < 0.05） 的大小。选择对数转换 q 值比值为 ≥1 的项。显示了 MIA 小胶质细胞中钝化的 LPS 反应（蓝色）和增强的 LPS 反应（橙色）。OxPhos，氧化磷酸化。g， SAL 或 LPS 处理后 CON 和 MIA 后代的血清 IL-6。n 值表示单个小鼠。使用线性混合效应模型进行分析，该模型显示 LPS 效应，但没有 MIA 效应。h， CD68 的百分比
在背侧 （D） 和腹侧 （V） 纹状体 （Str） 的小胶质细胞内。n 值表示单个单元格。使用三向方差分析 （ANOVA） （MIA、LPS、区域） 和 emmeans 事后检验进行统计分析。我们发现 MIA 具有显着的主效应，在 LPS 治疗后，两个大脑区域 MIA 与 CON 小胶质细胞的事后检验具有显着的意义。i，使用 Sholl 分析的小胶质细胞形态。n 值表示单个单元格。数据均为 ± s.e.m. 的平均值。使用线性混合效应模型进行分析。MIA 组与 LPS 治疗 （× Trt 组） 的治疗 （Trt） 、脑区 （region） 和交互作用有显著影响。j，对大约 120,000 个小胶质细胞进行均匀流形近似和投影 （UMAP） 分析，分为 11 个簇。显示了差异丰度分析，量化了从每只小鼠到每个簇的细胞百分比。n 值表示单个小鼠。使用双侧 t 检验进行统计分析。k， CON 和 MIA 小胶质细胞簇 2、5 和 11 的不同标记基因的基因表达 （log）。n 值表示单个单元格。*P < 0.05。AU，任意单位。g、h 和 j 中的箱形图显示中位数（中心线）、四分位距（IQR;箱线限制）和 1.5 × IQR（须线）。统计分析的详情见补充表 1。
自然风光 |第 610 卷 |13 年 10月 2022 日 |329
具体来说，与 CON 小胶质细胞相比，71% 的 LPS 诱导基因 （2,260） 在 MIA 小胶质细胞中的诱导减少（基因表达降低）（图 1d 和扩展数据图 2）。同样，与 CON 小胶质细胞相比，65% 的 LPS 抑制基因 （1,946） 在 MIA 中显示出抑制减弱（基因表达增加）（图 1d 和扩展数据图 2）。总之，这些结果表明，与 CON 小胶质细胞相比，MIA 小胶质细胞的免疫反应减弱，其中变钝基因定义为与 CON 小胶质细胞相比，MIA 小胶质细胞中 LPS 反应绝对倍数变化较小的任何基因。我们还通过对倍数变化值拟合回归线来证明免疫减弱，比较 CON 和 MIA 小胶质细胞之间的 LPS 反应，斜率约为 0.7，一致系数约为 0.8，均小于 1（图 1e 和扩展数据图 2）。这些数据与 MIA 中过度活跃的免疫反应的预期形成鲜明对比。
为了从功能上表征这一结果，我们比较了两个独立的基因集富集分析，以确定 MIA 和 CON 小胶质细胞在成年期对体内 LPS 治疗的反应中差异富集的特定分子途径。我们发现 MIA 小胶质细胞中的先天免疫反应通路（包括干扰素信号传导）强烈减少（图 1f）。此外，我们发现 MIA 小胶质细胞中三羧酸循环和脂肪酸代谢的增强，同时氧化磷酸化、氧化还原途径、电子传递链和呼吸途径的减少（图 1f）。在 MIA 小胶质细胞中观察到的线粒体途径失衡表明免疫代谢反应受损。总之，这些结果强调了在小胶质细胞中实施的广泛功能适应，以响应母体微环境的变化。
接下来，我们讨论了成人 MIA 小胶质细胞中 LPS 反应迟钝是否存在区域特异性。我们发现，与 CON 小胶质细胞相比，来自额叶皮层和纹状体的 MIA 小胶质细胞都显示出较弱的免疫反应，但纹状体显示出比额叶皮层更强大的效果（扩展数据图 3a、b）。为了确定免疫减弱对 MIA 小胶质细胞的特异性，而不是数据中的偏倚，我们比较了来自额叶皮层的小胶质细胞和来自纹状体的小胶质细胞之间的 LPS 反应（将 CON 和 MIA 混合在一起），发现免疫反应更加一致（斜率 = 0.9，一致性系数 （CCC） = 0.9），表明减弱的免疫反应是 MIA 小胶质细胞特异性的（扩展数据图 3c-e）。此外，通过血清白细胞介素 6 （IL-6） 测量，MIA 和 CON 后代对 LPS 治疗的外周免疫反应没有差异，表明外周免疫反应正常（图 1g）。总之，免疫反应性降低是与大脑中 MIA 小胶质细胞相关的特定特征。
接下来，我们使用组织学对成年后代的体内观察进行了功能验证（图 1h，i 和扩展数据图 4）。我们测量了背侧和腹侧纹状体中成年小胶质细胞的密度、形态和溶酶体含量（图 1h、i 和扩展数据图 4），因为纹状体小胶质细胞显示出更强的免疫表型（扩展数据图 3a、b）。与免疫反应性减弱一致，我们发现在体内 LPS 处理后，与 CON 小胶质细胞相比，MIA 小胶质细胞的 CD68 溶酶体较少（图 1h 和扩展数据图 4b-d）。此外，LPS 处理后 MIA 小胶质细胞显著小于 CON 小胶质细胞，尽管 SAL 处理后形态学差异可以忽略不计，表明 MIA 小胶质细胞的反应性受损（图 1i 和扩展数据图 4a）。SAL 和 LPS 处理后小胶质细胞密度保持不变（扩展数据图 4e）。总之，这些数据通过组织学支持 MIA 小胶质细胞中的免疫反应表型减弱。
几项单细胞 RNA 测序 （RNA-seq） 研究确定了独特的小胶质细胞亚群，尤其是在神经退行性疾病中。因此，我们评估了迟钝的免疫反应表型是否发生在小胶质细胞的不同亚群中。
在所有 LPS 处理的细胞中，我们鉴定了 11 个不同的小胶质细胞簇，但与 CON 小胶质细胞相比，MIA 小胶质细胞没有明显的簇（图 1j，k 和扩展数据图 5a-c）。接下来，我们进行了丰度测定，以量化每个样品中细胞与每个簇的比例。我们发现 MIA 在促炎簇 2 （Ccl3） 中的丰度降低，在簇 5 （Ccl12） 和簇 11 （干扰素簇，Ifit2 Cxcl10） 中呈下降趋势 （图 1j，k 和扩展数据图 5）。这些数据表明 MIA 影响一些促炎簇，这与在大量 RNA-seq 分析中观察到的 MIA 小胶质细胞免疫表型减弱的想法一致。
发育中的钝化 MIA 小胶质细胞反应性
接下来，我们通过从 MIA 和 CON 后代的纹状体和皮层中提取小胶质细胞并在体外培养原代小胶质细胞，解决了 MIA 后发育过程中小胶质细胞的免疫反应性。这使我们能够表征胚胎小胶质细胞的免疫反应性，并获得与体内数据的互补结果。我们在体外用 LPS 刺激提取的小胶质细胞，并定量细胞因子 IL-6 和 TNFα 从小胶质细胞分泌到培养基中。与体内数据一致，我们发现与 CON 小胶质细胞相比，来自 MIA 后代纹状体的成体小胶质细胞显示分泌的促炎细胞因子减少（图 2a）。重要的是，与纹状体的 CON 小胶质细胞相比，在 MIA 的 E18 处观察到类似的免疫反应减弱，表明存在长寿命的免疫迟钝表型（图 2a）。在皮质小胶质细胞中，MIA 在成年期显示免疫反应轻度降低，在 E18 时没有显着变化，表明皮层具有延迟和较温和的免疫钝化表型，这可能是由于皮质发育成熟较晚与纹状体相比（图 2b）。这些体外数据表明，产前免疫应激源诱导了 MIA 小胶质细胞对后续免疫刺激的激活长期迟钝，这与小胶质细胞在成年期对体内刺激的反应迟钝一致。
新生儿大脑包含内源性应激源，可诱导小胶质细胞变得反应性。因此，通过直接检查新鲜提取的新生儿大脑的体内小胶质细胞，我们可以评估 MIA 小胶质细胞对内在激活剂的响应性。我们在新生儿 MIA 和 CON 小胶质细胞之间发现了 2,034 个 DEGs（图 2c-e）。与成年期 LPS 激活的小胶质细胞类似（图 1b、f），新生儿 MIA 和 CON 小胶质细胞之间的这些 DEG 显示与免疫反应、吞噬作用、RNA 加工和蛋白质定位相关的通路减少（图 2d、e）。此外，在新生儿（内在激活）小胶质细胞和成人 LPS 处理的小胶质细胞中，这些 DEGs 中的 123 个通常发生变化 （假发现率 （FDR） < 0.1）（图 2f）。大多数基因在新生小胶质细胞 （88 个基因） 和成人 LPS 处理的小胶质细胞 （75 个基因） 中下调 （图 2f）。这些基因在功能上与先天免疫反应相关，并富集于干扰素途径的靶基因 （IRF1、IRF2、IRF7 和 IRF8） （图 2f）。总之，MIA 导致小胶质细胞对新生儿阶段的内源性激活和成年期 LPS 的外源性激活的反应性降低，并导致重叠功能通路受损。
我们还通过检查全基因组关联研究 （GWAS） 的数据集，确定了数据集中 MIA 和 CON 之间的 DEGs 是否富集了疾病相关风险基因。我们发现，MIA 和 CON 之间的 DEGs 对精神分裂症风险基因的富集程度高于自闭症谱系障碍、注意力缺陷多动障碍、双相情感障碍和重度抑郁症的风险基因（图 2g）。精神分裂症是一种神经发育起源的综合征，症状在青春期后出现，与儿童发病的发育状况相反，如自闭症谱系障碍和注意力缺陷多动障碍，或成人发病的情况，如
330 元 |自然风光 |第 610 卷 |13 十月 2022
品
作为双相情感障碍和重度抑郁症。因此，免疫机制对自闭症的贡献可能在整个发展轨迹中先于精神分裂症。因此，小胶质细胞在整个发育轨迹中的病理参与可能对精神分裂症很重要。总之，这些数据为环境压力源（即 MIA）和遗传风险因素对疾病中小胶质细胞生物学的共同潜在病理生理学提供了证据。
MIA 小胶质细胞钝化的表观遗传机制
接下来，我们研究了 MIA 如何在成年期诱导减弱免疫表型。我们假设长期损害可能与干扰免疫激活转录调节的表观遗传变化有关。为了测试这个想法，我们对 LPS 处理后成人 MIA 和 CON 小胶质细胞的转座酶可及染色质进行了测序 （ATAC-seq） 分析。特别是
我们发现，与 CON 小胶质细胞相比，MIA 小胶质细胞中 97% 的差异可及区域 （DAR） 更加开放（图 3a）。在对多重比较进行校正后，我们确定了 113 个开放的 DAR，其中大约四分之一靠近转录起始位点（图 3b）。我们使用基因组区域注释富集工具来识别开放染色质区域的富集通路，包括上述免疫调节、溶酶体和蛋白质修饰通路（图 3c）。然而，剩下的问题是更开放的染色质结构如何导致转录程序迟钝。
为了解决这个问题，我们使用转录因子足迹分析，通过在更广泛的开放染色质区域（200-500 个碱基对）内识别被占据染色质的较小区域（10-20 个碱基对）并鉴定匹配的转录因子基序，定量评估转录因子对开放染色质区域的占用情况。我们遵循了已建立研究的策略，这些研究通过基于染色质可及性的数据分析来检查转录基因表达如何受转录因子调节。我们确定了 83 个转录因子在 MIA 和 CON 小胶质细胞之间具有差异的占有率，其中 76% 显示与 CON 小胶质细胞相比，MIA 小胶质细胞的占有率较低，包括 GATA4、SMAD3 和 STAT1 （Fig. 3d），它们是调节免疫反应的重要转录因子，尤其是干扰素反应。以前的研究有一个先例，表明开放染色质和其他生物系统中的转录因子占有率之间存在非线性关系。为了确认表明干扰素信号受损的 ATAC 转录因子占有结果，我们发现 Stat1 基因和几个 STAT1 靶基因（B2m、Il1b、Irf1 和 Myd88）在 LPS 处理后始终显示 MIA 小胶质细胞中的基因表达降低（图 3e）。接下来，我们一起对配对的 ATAC-seq 和 RNA-seq 数据进行了网络分析，以确定 LPS 处理后在 CON 或 MIA 小胶质细胞中富集的转录因子和目标网络（扩展数据图 6）。我们在 MIA 小胶质细胞中发现了更多的抑制网络，在 CON 小胶质细胞中发现了更多的激活网络（扩展数据图 6a）。具体来说，有增强的转录
a
c
Immune
DNA
processing
RNA processing
Protein
localization
Synapse
Hydrolase
Lytic vacuole
Extracellular
matrix
Cell junction adhesion
Proliferation
Growth factor
Migration
Other
Mesenchymal
Angiogenesis
–2.5
2.5
Pathway analysis (MIA/CON)
NES
−1.0
−0.5
0
0.5
1.0
FC （对数
2
)
E18
IL-6 TNFα
*
*
*
*
成人
IL-6 TNFα
e
f
−1.0
−0.5
0
0.5
1.0
FC （对数
2
)
IL-6 TNFα
IL-6 TNFα
P = 0.06
E18
成人
CON
MIA
−2
−1
0
1
2
缩放计数
d
g
b
1,066
968
Itgb2
Ramp2
LsrEsam
Apoe
Gstm7
Sema6a
Slc1a4 Flt4
Ly75
Man2b2
Fmnl1
0
10
20
30
−2
FC （log） （英语）
0
2
4
P
（−对数
10
)
P< 0.05 NS
P4
LPS
LPS
响应
Up 35
Down
88
Up
27
Down
8
Up
13
Down
75
通路/TF
MF： 中性氨基酸跨膜转运蛋白活性 BP： 中性氨基酸转运 BP： 氨基酸进口 MF： L氨基酸跨膜转运蛋白活性 BP： Lα氨基酸跨膜转运
MF：细胞粘附分子结合 MF：钙粘蛋白结合 BP：对生长因子的反应
TF: TEF
TF: KDM7A
TF: HMGB
BP：跨膜受体酪氨酸激酶信号传导 BP：轴突发育
BP：转移酶活性的正调节 BP：阴离子转运的调节 BP：蛋白质定位的调节 BP：转运的正调节 BP：蛋白激酶活性的激活
BP：抗原加工和呈递 BP：先天免疫反应 BP：对生物刺激反应的调节 BP：先天免疫反应的调节 BP：Fc 受体信号通路 TF：IRF7 TF：IRF2 TF：IRF8 TF：IRF1 TF：ETS2 TF：HOXC6
TF: CIITA
Other: 2
Other: 17
Blunted
repression
11
Other: 4
Other: 1
Blunted
induction
7
Blunted repression
23
Blunted induction
58
0
1
2
3
4
5
ADHD
ASD
BP
MDD SZ
DEG
Non-DEG
Genes in GWAS (%)
*
DEG
(3,431)
13
95
54
42
155
Non-DEG
(17,606)
49
367
184
133
541
Dis.
图 2 |MIA 后发育中的小胶质细胞反应性降低。
a，b，在 E18 和整个纹状体 （a） 和皮层 （Ctx） （b） 的成年期中 LPS 刺激的小胶质细胞分泌的 IL-6 和肿瘤坏死因子 α （TNFα） 的定量。数据均为 s.e.m. ±平均值，每个实验均归一化为 CON。使用单样本 t 检验进行统计分析。n 值表示独立的培养实验。E18：n = 4 （Str， IL-6）， n = 4 （Str， TNFα）， n = 5 （Ctx， IL-6） 和 n = 5 （Ctx， TNFα） 窝仔猪;成年：n = 4 个（所有组）培养物，每个培养物从 3 窝中合并 2 只小鼠进行 CON 和 MIA。t= −8.1，P = 0.004 （E18， Str， IL-6）;t= −3.8，P = 0.032 （E18， Str， TNFα）;t= −3.3，P = 0.046 （成人，Str，IL-6）;t= −3.2，P = 0.048 （成人，Str，TNFα）;t= 0.939，P = 0.40 （E18，Ctx，IL-6）;t= 0.32，P = 0.77 （E18，Ctx，TNFα）;t= −2.9，P = 0.06 （成人，Ctx，IL-6）;t= −1.1，P = 0.35 （成人，Ctx，TNFα）。c， 整个新生儿大脑 MIA 和 CON 小胶质细胞在出生后第 4 天 （P4） 的 DEGs 火山图（黑点表示使用 DESeq2 的多重比较校正 P < 0.05 （P）。d， P4 处 MIA 和 CON 小胶质细胞之间新生儿 DEGs 的热图 e， 蓝色 c 中 DEGs 的基因集富集分析
在 MIA 小胶质细胞中通路减少，在 MIA 小胶质细胞中橙色通路增强。NES，标准化富集评分。f，来自新生儿小胶质细胞和 LPS 处理的成人小胶质细胞的 MIA 和 CON 之间的 123 个重叠的 DEGs （q < 0.1） 以及丰富的途径 （分子功能 （MF） 和生物过程 （BP）） 和转录因子 （TF） 调节因子。g， MIA 和 CON 小胶质细胞之间 DEGs 中神经精神疾病 （dis.） 的 GWAS 风险基因的富集。P < 0.05，使用带有 Bonferroni 校正的 χ 检验确定。数据是 DEG 或非 DEG 中 GWAS 风险基因的计数和百分比。注意力缺陷多动障碍 （ADHD）、自闭症
谱系障碍 （ASD）、双相情感障碍 （BP）、重度抑郁症 （MDD） 和精神分裂症 （SZ）。*P < 0.05。统计分析的详情见补充表 1。
自然风光 |第 610 卷 |13 年 10月 2022 日 |331
与 MIA 小胶质细胞相比，LPS 处理后 CON 小胶质细胞干扰素通路中的因子-靶标相互作用，包括 IRF1、IRF2、STAT1 和 STAT2（扩展数据图 6b、c）。最后，我们使用 CUT&RUN 定量 PCR （qPCR） 和针对 IRF1 和 STAT2 的转录因子捕获抗体进行了实验验证。我们发现在急性 LPS 治疗后，MIA 小胶质细胞中被 STAT2 和 IRF1 拉低的总 DNA 有减少的趋势（扩展数据图 6d，e）。此外，转录因子-靶标 IRF1-Fas、IRF1-Il6 和 STAT2-Il23 的特异性靶 DNA 捕获较少（扩展数据图 6f，g）。总之，这些数据表明，与 LPS 处理后的 CON 小胶质细胞相比，成人 MIA 小胶质细胞中的染色质更加开放，并且占据这些开放区域的转录因子较少，这导致分子水平上的免疫反应基因激活减弱。
通过产前替代术挽救 MIA 小胶质细胞
接下来，我们测试了是否可以通过消融 MIA 受损的小胶质细胞来改善长期小胶质细胞损伤，以使幼稚的小胶质细胞在 MIA 应激源后重新浸润发育中的大脑。为了完成产前小胶质细胞置换，我们用 E9.5 和 E12.5 之间的 CSF1R 拮抗剂 （PLX5622） 处理妊娠母细胞，以有效消除胚胎髓系细胞（扩展数据图 7）。CSF1R 拮抗剂的短期治疗不会影响通过血清 IL-6 蛋白表达测量的 MIA 母体免疫反应（扩展数据图 7f）。在成年期，我们比较了 CON 小胶质细胞、MIA 小胶质细胞、MIA 中重新填充的小胶质细胞（重新填充的 MIA 小胶质细胞）和 CON 中重新填充的小胶质细胞（重新填充的 CON 小胶质细胞）中响应 LPS （LPS 反应基因）的基因表达变化。我们发现，重新填充的 MIA 小胶质细胞中的 LPS 反应显示基因表达改善了减弱的免疫反应（图 4a-g 和扩展数据图 8）。MIA 小胶质细胞、重新填充的 MIA 小胶质细胞和重新填充的 CON 小胶质细胞分别显示出 0.74、0.86 和 0.90 的倍数变化线性回归斜率，表明重新填充的 MIA 小胶质细胞的 LPS 响应更类似于 CON 小胶质细胞的 LPS 响应 （0.9） 而不是 MIA 小胶质细胞的 LPS 响应 （0.7）（图 4a-g）。
在单细胞水平上，再填充的 MIA 小胶质细胞中减弱的免疫反应的改善也得到了解决（图 4h-j 和扩展数据图 5）。我们发现重新填充的 MIA 小胶质细胞与健康的 CON 小胶质细胞没有明显聚集（扩展数据图 5c）。此外，量化每个样品中细胞与每个簇的比例的丰度测定发现，重新填充的 MIA 小胶质细胞显示出对簇 2 （Ccl3） 和簇 5 （Ccl12） 的挽救贡献（图 4h-j）。然而，簇 11 （干扰素簇，Ifit2 Cxcl10 ） 仍然显示重新填充的 MIA 小胶质细胞略有减少（图 4i-j）。这些数据表明，重新填充的细胞与 CON （内源性） 小胶质细胞无法区分，并且重新填充的 MIA 小胶质细胞改善了对促炎簇的减少贡献。
使用 IL-1β、TNFα 和 IL-6 在蛋白质水平上证实了再填充的 MIA 小胶质细胞中减弱免疫反应的改善（图 4k-m）。LPS 处理后，成年 MIA 小胶质细胞显示 TNFα 蛋白表达降低，有降低 lL-1β 的趋势，但 IL-6 没有变化，而重新填充的 MIA 小胶质细胞没有表现出这种缺陷（图 4k-m）。这些蛋白质数据与转录数据一致，其中钝化的 MIA 小胶质细胞通过产前小胶质细胞替代而得到挽救。
MIA 小胶质细胞对星形胶质细胞和神经元的影响
为了评估 MIA 小胶质细胞对周围神经胶质细胞和神经元的非自主影响，我们评估了 LPS 处理后星形胶质细胞和非小胶质细胞/非星形胶质细胞 （阴性） 细胞的细胞因子蛋白表达。与 MIA 中降低的蛋白质表达相反
0
2
4 −1.0 −0.5
0
0.5 1.0
P < 0.05
FC （log） （英语）
P
（–对数
10
)
More open
More closed
11%
11%
38%
34%
基因间
内含 子
TTS 2%
3% 外显子
<5 kb TSS
5–10 kb TSS
1% ncRNA
e
a
b
0
50
100
150
SAL LPS
TPM
统计 1
0
10
20
30
40
50
SAL LPS
米德88
0
50
100
150
200
250
SAL LPS
Irf1
−−
0
100
200
300
400
500
SAL LPS
Il1b
0
2,000
4,000
6,000
SAL LPS
B2m
CON
MIA
d
类别
富集 FDR Cov （%）
Lysosome localization
12.9
0.037
4
Regulation of tyrosine phosphorylation of STAT protein
8.0
0.047
4
Negative regulation of homeostatic process
5.0
0.030
7
Immune
Regulation of immune system process
2.3
0.028
20
Hindbrain morphogenesis
8.7
0.006
6
Morphogenesis
Cerebellar cortex morphogenesis
8.3
0.040
4
Cerebellum morphogenesis
8.1
0.023
5
Regulation of steroid metabolic process
6.5
0.022
6
Other
Regulation of transferase activity
2.4
0.014
20
Regulation of protein kinase activity
2.6
0.019
18
Regulation of kinase activity
2.6
0.011
19
Protein phosphorylation
2.4
0.036
18
Phosphorylation
2.2
0.030
20
Phosphorylation
Phosphate-containing compound metabolic process
2.1
0.004
31
Positive regulation of phosphate metabolic process
2.1
0.042
21
Phosphorus metabolic process
2.1
0.006
31
Regulation of phosphate metabolic process
2.0
0.006
32
Regulation of phosphorus metabolic process
2.0
0.006
32
Negative regulation of telomere maintenance/lengthening
15.6
0.027
4
Negative regulation of telomere maintenance
12.1
0.041
4
Proliferation
Somatic stem cell population maintenance
6.9
0.036
5
Stem cell population maintenance
6.3
0.003
11
Maintenance of cell number
5.9
0.002
11
GO 术语
c
更少的站点
76%
More
网站
24%
NS
占用站点
TF CON MIA
盖塔4 2,789 10
斯马德3 3,113 20
统计1 477 242
编号4a1 230 1,757
统计5b 91 299 Grhl2 957
2,188
图 3 |MIA 的表观遗传重编程和转录调控
小胶质细胞。a， LPS 处理后整个纹状体 MIA 和 CON 小胶质细胞之间 ATAC-seq 的 DAR 火山图。蓝点显示使用 DiffBind < 0.05 的未调整 P 值。阳性倍数变化表明 MIA 小胶质细胞中更多的开放染色质，负倍数变化表明 MIA 小胶质细胞中的染色质更封闭。b，排列测试后 113 个 DAR 的空间位置 （多重比较调整 P < 0.05），其位置对应于转录起始位点 （TSS）、外显子、非编码 RNA （ncRNA）、内含子、基因间和转录终止位点 （TTS）。c， 使用 GREAT 对 LPS 处理后 MIA 和 CON 小胶质细胞之间的 113 个 DAR 进行通路分析。23 个富集的 GO 通路，FDR < 0.05。扩充分数 （enrich） 和覆盖率 （cov）。d， LPS 处理后 MIA 和 CON 小胶质细胞开放染色质区域的差异转录因子占有位点。转录因子包括超过 250 个位点和 ≥0.5 对数转换的倍数变化。右表显示了前 3 个占用较多和较少的转录因子，其中
LPS 后 CON 和 MIA 小胶质细胞的占用点数。e，SAL 或 LPS 处理 Stat1 和 STAT1 靶基因 （B2m、Il1b、Irf1 和 Myd88） 后 CON 和 MIA 小胶质细胞的基因表达 （每百万转录本数，TPM）。数据是平均值。n 值表示单个小鼠。n = 5 窝中的 6 只小鼠（CON、SAL），n = 7 窝中的 8 只小鼠（CON、LPS），n = 3 窝中的 5 只小鼠（MIA、SAL）和 n = 5 窝中的 6 只小鼠（MIA、LPS）。统计分析的详细信息见补充表 1。
332 元 |自然风光 |第 610 卷 |13 十月 2022
品
小胶质细胞（图 4k-m）、星形胶质细胞和非小胶质细胞/非星形胶质细胞（阴性）细胞在 MIA 中显示 IL-6 表达增加，表明星形胶质细胞具有增强的免疫反应（图 5a、b）。LPS 处理后，星形胶质细胞和阴性细胞中 IL-1β 和 TNFα 检测不到。产前小胶质细胞替代使星形胶质细胞的病理变化正常化（图 5a、b），表明小胶质细胞反应性受损可能是 MIA 后代星形胶质细胞变化的基础。
为了评估 MIA 小胶质细胞对大脑发育和神经元功能的细胞非自主影响，我们通过电生理记录评估了成年 MIA 后代腹侧纹状体中棘神经元 （MSN） 的功能。多巴胺功能障碍先前在 MIA 中被发现，纹状体是多巴胺神经元回路的主要目标，但据我们所知，还没有研究在电生理水平上解决 MIA 后代的 MSN 功能障碍。我们发现 2 型多巴胺受体 （D2R） MSN 中自发性兴奋性突触后电流 （sEPSC） 的频率降低，但在 1 型多巴胺受体 （D1R） MSN 中则没有（图
5c 和扩展数据图 9a）。两种类型的 MSN 中的 sEPSC 振幅均保持不变（扩展数据图 9b）。我们发现腹侧纹状体 MSN 的脊柱密度没有变化（扩展数据图 9c）。然而，我们发现 D2R MSN 的配对脉冲比增加，但 D1R MSN 没有增加（图 5d），表明成年 MIA 后代囊泡释放到 D2R MSN 上的突触前概率降低。为了确保降低的突触前释放概率与突触前细胞兴奋性无关，我们测量了 D2R MSN 中的微型 EPSC （mEPSC），发现频率降低，振幅没有任何变化（图 5e 和扩展数据图 9d）。
最后，我们旨在确定 D2R MSN 连接性降低是否与发育轨迹中的 MIA 小胶质细胞有因果关系。为了解决这个问题，我们在产前小胶质细胞置换术后对 CON 和 MIA 后代进行了 mEPSC 记录。我们发现，在产前小胶质细胞置换后，MIA 后代降低的 mEPSC 频率被挽救到控制水平，幅度没有变化（图 5f）。此外，单独的小胶质细胞替换并没有改变 CON 后代中 D2R MSN 的生理特性（图 5f）。这些结果表明，MIA 小胶质细胞是腹侧纹状体回路连接功能障碍的因果基础，特别是 D2R MSN 上谷氨酸能突触前释放概率的降低。
讨论
在这里，我们解决了一个基本的生物学问题，即在早期大脑发育过程中浸润的小胶质细胞如何受到其可能影响神经元网络形成的产前环境的影响。我们证明，产前免疫应激会降低小胶质细胞反应性，从而导致后续应激源激活的功能损害。小胶质细胞功能障碍可能在基线时被掩盖，但当需要小胶质细胞对内源性 （新生儿） 或外源性 （LPS） 刺激做出反应时就会显现出来。我们提出了一种新的工作模型，其中产前免疫应激作为耐受刺激，导致染色质结构、转录因子占有率和基因表达的转录调控发生变化。此外，我们的数据
CON:CON
CON:PLX
MIA:CON
MIA:PLX
0
2.5
5.0
7.5
10.0
IL-1b （pg 毫升
–1 )
Ctx
Str
k
l
0
10
20
30
40
TNFa（pg 毫升
–1 )
Ctx Str
CON:CON
CON:PLX
MIA:CON
MIA:PLX
*
−10
0
10 −10
0
CON:CON
CON:PLX
Both
10
FC （对数） CON：CON
FC （对数
2
） CON：PLX
923
1,497
1,308
935
−10
0
10 −10 0 10
FC （对数） CON：CON
FC （对数
2
） CON：PLX
斜率 = 0.90
CCC = 0.89
−10
0
10
−10 0 10
FC （log ） CON：CON
FC （对数
2
） MIA：CON
斜率 = 0.74
CCC = 0.85
−10
0
10
−10 0 10
FC （log ） CON：CON
FC （对数
2
） MIA：PLX
斜率 = 0.86
CCC = 0.89
−10
0
10 −10
0
CON:CON
MIA:PLX
Both
10
FC （log ） CON：CON
FC （对数
2
） MIA：PLX
975
958
946
886
−10
0
10
−10
0
CON:CON
MIA:CON
Both
10
FC （log ） CON：CON
FC （对数
2
） MIA：CON
1,110
1,048
836
1,166
c
d
a
b
f
e
0
5
10
15
20
IL-6 （pg 毫升
–1 )
Ctx
Str
m
CON:CON
CON:PLX
MIA:CON
MIA:PLX
*
i
缺点：PLXMIA：PLX
1
10
100
Ccl3
Cluster 2
j
−4
−2
0
2
4
6
8
CON：CONCON：PLXMIA：CONMIA：PLX
FC （对数
2
)
g
1
10
100
1,000
Ccl12
Cluster 5
缺点：PLXMIA：PLX
1
10
100
Cxcl10
Cluster 11
缺点：PLXMIA：PLX
簇
1
2 3 4 5 6 7 8
9 10 11
P = 0.05
20
25
30
35
40
每个样品的细胞数 （%）
0
1
2
3
4
5
0
5
10
15
20
1
2
3
6
4
7
8
9
5
10
11
h
表达
图 4 |产前置换后小胶质细胞变钝的改善。a，b，在对照处理 （CON：CON） 的 CON 小鼠和对照处理的 MIA 小鼠 （MIA：CON）（灰色）、仅 CON：CON（黑色）或仅 MIA：CON 小胶质细胞（红色）中 LPS 诱导的 DEGs 倍数变化的图 （a） 和线性回归 （b）。这些数字表示 a，c 和 e 中 LPS 反应基因的总数。蓝线是线性拟合（斜率 = 0.74 和 CCC = 0.85）。c ，d，在 PLX 处理 （MIA：PLX）（灰色）、仅 CON：CON（黑色）或仅 MIA：PLX 小胶质细胞（紫色）的 CON：CON 和 MIA 小鼠中 LPS 诱导的 DEGs 倍数变化的图 （c） 和线性回归 （d）。蓝线是线性拟合
（斜率 = 0.86 和 CCC = 0.89）。e，f，在 PLX 处理 （CON：PLX）（灰色）、仅 CON：CON（黑色）或仅 CON：PLX 小胶质细胞（青色）的 CON：CON 和 CON 小鼠中 LPS 诱导的 DEGs 倍数变化的图 （e） 和线性回归 （f）。蓝线是线性拟合（斜率 = 0.90 和 CCC = 0.89）。g，CON：CON、CON：PLX、MIA：CON 和 MIA：PLX 中 LPS 响应基因的对数转换倍数变化的热图。h，对大约 120,000 个小胶质细胞进行 UMAP 分析，分为 11 个簇。i，差异丰度分析，量化每个簇中每个样品的细胞百分比。n 值表示单个小鼠。使用双侧 t 检验进行统计分析。n = 4 （CON：PLX），n = 3 （MIA：PLX）。j，产前替代后 CON 和 MIA 小胶质细胞中簇 2、5 和 11 的不同标记基因的基因表达 （log）。k–m， CON：CON （灰色）、CON：PLX （青色）、MIA：CON （红色） 和 MIA：PLX （紫色） 组小胶质细胞中细胞因子 IL-1β （k）、TNFα （l） 和 IL-6 （m） 的蛋白表达。n 值表示来自混合小鼠的单个样本。使用双向方差分析和 Tukey 事后检验进行统计分析。*P < 0.05。i 和 k-m 中的箱形图显示中位数（中心线）、IQR（箱限）和 1.5 × IQR（晶须）。统计分析的详情见补充表 1。
自然风光 |第 610 卷 |13 年 10月 2022 日 |333
此外，在临床研究中，精神分裂症患者显示脑脊液中的细胞因子水平增加，但脑成像数据表明细胞免疫激活没有显着增加，甚至没有减少
我们确定了小胶质细胞的低激活，同时显示成年 MIA 后代星形胶质细胞的炎症状态增加。因此，我们的数据强调了除了小胶质细胞作为疾病中免疫分子来源之外，评估细胞的重要性。
未来研究的一个突出问题是仔细解决性别对小胶质细胞功能缺陷的影响，因为雄性和雌性小胶质细胞表现出不同的免疫反应性，发育和精神疾病也表现出性别差异。尽管我们展示了一些粗略的证据表明钝化表型在雄性中更强大（扩展数据图 10a-d），但这需要在未来的研究中更详细地探讨。另一个有趣的扩展是关于腹侧纹状体 MIA 中 D2R MSN 生理变化的特异性。最近的一项研究表明，小胶质细胞在调节 D1R MSN 电路发育中起关键作用，我们预计 D2R MSN 电路中可能涉及类似的机制。最后，需要进一步研究来研究 LPS 诱导的小胶质细胞状态，包括这些激活状态的功能作用、时间调节和空间分配。
在线内容
任何方法、其他参考文献、Nature Research 报告摘要、源数据、扩展数据、补充信息、致谢、同行评审信息;作者贡献和利益争夺的详细信息;以及数据和代码可用性声明可在 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05274-z 上获得。
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c
e
d
TdTom 公司
TdTom 公司
*
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
100 200 300 400 刺激间隔 （ms）
成对脉搏比
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
100 200 300 400 刺激间隔 （ms）
CON
MIA
f
0
0.5
1.0
累积概率0 1 2 3 4
事件间间隔 （s）
频率 （Hz）
CON
MIA
TdTom 公司
–
+
TdTom 公司
*
*
0
2
4
6
频率 （Hz）
0
0.5
1.0
累积概率0
CON
MIA
TD汤姆 –
*
*
0
2
4
6
0
1
2
3
4
5
频率 （Hz）
0
5
10
15
20
振幅 （pA）
CON:CON
CON:PLX MIA:CON
MIA:PLX
CON:CON
CON:PLX
MIA:CON
MIA:PLX
*
0
0.5
1.0
0
0.5 1.0 1.5 2.0
CON:CON
CON:PLX
MIA:CON
MIA:PLX
累积概率
事件间间隔 （s）
TdTom 公司
*
a
0
2.5
5.0
7.5
10.0
IL-6 （pg 毫升
–1
)
Ctx Str
缺点：CON
缺点：PLX
MIA：康
MIA：PLX
*
b
0
10
20
30
40
IL-6 （pg 毫升
–1
)
Ctx Str
缺点：CON
缺点：PLX
MIA：康
MIA：PLX
*
图 5 |使用产前挽救 MIA 中的星形胶质细胞和神经元表型
小胶质细胞置换术。a，b，细胞因子 IL-6 在星形胶质细胞 （a） 和非星形胶质细胞/非小胶质细胞（阴性）（b） 中的蛋白表达，来自 CON：CON（灰色）、CON：