LinfiJ 等人 J 免疫癌 2022;10：e004892.doi：10.1136/JITC-2022-004892IF：10.3问 1B1IF：10.3问 1B1

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肝内胆管癌免疫亚群的多模块表征揭示了不同的治疗脆弱性

林健 ，戴玉婷 ，陈桑 ，宋国和，向斌 张毛 ， 董良庆 夏晓丽 马佳强， 沈霞 季淑仪 ， 张淑杰， 王明杰， 方海， 张晓明， 王向东， 张兵， 周健， 贾凡， 胡 周 ，高大明 高强

引用：Lin J， Dai Y， Sang C， et al.肝内胆管癌免疫亚群的多模块表征揭示了不同的治疗脆弱性。癌症免疫治疗杂志 2022;10：e004892.doi：10.1136/ JITC-2022-004892

► 其他补充

材料仅在线发布。要查看，请访问在线期刊 （http:// dx. doi. org/ 10.

1136/ JITC- 2022- 004892）。

JL、YD、CS、GS 和 BX 的贡献相同。

接受日期 2022 年 7 月 1 日

有关编号的隶属关系，请参阅文章末尾。

通信

Qiang Gao 博士;gaoqiang@ 复旦.教育。快递 之 家

Daming Gao 博士;

dgao@ sibcb.AC. CN

胡 周博士;zhouhu@ simm.AC. CN

原创研究

© 作者（或其雇主） 2022 年。CC BY-NC 允许重复使用。不得商业再利用。请参阅权限和权限。由 BMJ 出版。

抽象

背景 免疫微环境是公认的癌症类型的关键调节因子，尽管它在不同的疾病状况中发挥着复杂的作用。肝内胆管癌 （iCCA） 的特征是肿瘤反应性环境，强调对其免疫基因组学特征的深入了解，以提供预后和治疗意义。

方法 我们对 255 个配对 iCCA 和邻近肝组织进行了基因组、转录组和蛋白质组学表征。我们通过 H&E 染色 （n=177）、多重免疫染色 （n=188）、单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） （n=10）、体外功能研究和基于体内转座子的小鼠模型验证了我们的发现。

结果 整合的多模块数据确定了三个具有不同临床、遗传和分子特征的免疫亚组，分别命名为 IG1 （免疫抑制，25.1%） 、IG2 （免疫排斥，42.7%） 和 IG3 （免疫激活，32.2%）。IG1 的特征是中性粒细胞和未成熟树突状细胞 （DC） 的过度浸润。IG2 的标志是相对较高的肿瘤增殖活性和肿瘤纯度。IG3 表现出适应性免疫细胞、自然杀伤细胞和活化 DC 的富集。这些免疫亚组与预后显著相关，并在两个独立的队列中得到验证。具有 KRAS 突变的肿瘤在 IG1 中富集，并与髓系炎症主导的免疫抑制相关。尽管 IG2 的肿瘤突变负荷相对较高，但人类白细胞抗原杂合性的缺失和抗原呈递的缺陷破坏了对新抗原的识别，从而导致免疫排斥行为。病理分析证实，肿瘤浸润淋巴细胞和三级淋巴结构在 IG3 中均占主导地位。乙型肝炎病毒 （HBV） 相关样本在 IG1 中的代表性往往不足，scRNA-seq 分析表明 HBV 感染确实缓解了骨髓炎症并恢复了抗肿瘤免疫力。

结论 我们的研究阐明了 iCCA 的免疫基因组学特征在患者之间具有内在的异质性，构成了巨大的挑战

以及个性化免疫疗法的应用机会。

介绍

肝内胆管癌 （iCCA） 占所有原发性肝癌的 10%-15%，在过去几十年中逐渐增加。尽管术后复发率高，但对于早期诊断的患者，手术是先进行的。不幸

关于这个主题的已知信息

⇒ 肝内胆管癌 （iCCA） 是第二种最常见的原发性肝癌类型，通常以高度促纤维增生性肿瘤微环境 （TME） 为特征。测序工作提高了对 iCCA 分子发病机制的理解;然而，iCCA 微环境表型的综合景观在很大程度上仍未得到探索。

本研究增加的内容

⇒ 我们的多模块研究揭示了三个不同的免疫亚组（IG1、IG2 和 IG3），它们具有与不同患者结果相关的特定免疫和非免疫特征。髓系炎症/KRAS 突变、抗原呈递/增殖和免疫检查点可分别作为治疗 IG1 、 IG2 和 IG3 相关 iCCA 的潜在治疗靶点。

乙型肝炎病毒 （HBV） 感染可能减轻 iCCA 中的骨髓炎症，从而激活抗肿瘤免疫并提高免疫疗法的疗效。

本研究可能如何影响研究、实践或政策

⇒ 这些发现扩展了我们对 iCCA 免疫学特征的理解。明确的免疫亚组为异质性 TME 和潜在的治疗策略提供了新的见解。

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大多数患者在晚期被诊断出来，此时只有姑息性化疗可用，中位生存期短于 12 个月。针对 FGFR2 融合和 IDH1/2 突变的新兴分子靶向疗法在有限的 iCCA 患者亚组中显示出适度的生存益处，因此，确定新颖有效的疗法仍然是一个迫切的需求。

一般来说，iCCA 的特点是高度促组织增生性肿瘤微环境 （TME） 和过度浸润免疫细胞和基质细胞。现有证据表明，炎症微环境与 iCCA 进展和不良预后相关，突出了 TME 是治疗 iCCA 的潜在靶点。事实上，最近的 II/III 期临床试验证实，免疫检查点抑制剂 （ICI） 联合化疗对 iCCA 患者很有希望。然而，反应和生存获益仅限于一小部分患者，这可能是由于异质性和复杂的 TME。因此，迫切需要更好地了解免疫基因组学特征，以设计新的免疫疗法以改善反应和患者预后。

基于免疫特征的患者分层有助于描绘免疫异质性肿瘤并确定适合免疫治疗的患者。我们和其他人已经应用了大肿瘤转录组学或蛋白质组学谱来定义临床相关的 iCCA 亚型，共同收敛于肿瘤间免疫异质性。然而，决定免疫景观多样性的潜在癌细胞内在特性仍然不太明显。需要并期望对临床前模型和患者样本进行综合多维和多模块分析，以深入表征免疫学画像并确定 iCCA 每种分子亚型中的新型个性化免疫治疗机会。

在这项研究中，我们使用最大的单中心 iCCA 队列分析了 TME 的转录组学谱，并将 255 名患者分为三个免疫亚组 （IG1 、 IG2 、 IG3 ）。通过整合多种互补方法，包括全外显子组测序 （WES）、蛋白质组学、单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq）、免疫染色和小鼠模型，我们描绘了这些亚组之间不同的遗传和分子特征。IG1 是免疫抑制的亚组，预后最差，骨髓浸润和 KRAS 突变最高;IG2 的特征是肿瘤增殖和抗原呈递缺陷;IG3 具有激活抗肿瘤免疫和富集三级淋巴结构 （TLS） 的特点，预后良好。免疫学特征的显着差异表明每个免疫亚组都需要特定的治疗策略。

方法

本研究用于 255 例患者的 iCCA 样本来自复旦中山医院

大学。2014 年 12 月至 2018 年 10 月期间接受治疗的患者从我们前瞻性收集的组织库中随机选择。详细的临床病理特征总结于在线补充表 S1。

在线补充材料和方法提供了多组学分析、组织微阵列 （TMA） 的多重免疫染色、病理检查、小鼠模型构建、scRNA-seq 分析、功能实验和统计分析的完整详细信息。

结果 iCCA 的免疫中心分类

为了表征具有预后意义的 iCCA 免疫特征，获得了来自复旦大学 （FU-iCCA） 队列 （n=255） 的多组学数据 （在线补充图 S1A 和在线补充表 S1）。与 iCCA 的炎症和结纤维增生性特征一致，我们的队列在癌症基因组图谱 （TCGA） 泛癌数据集中具有相对较高的免疫浸润（在线补充图 S1B）。基于 TME 特征中 170 个预后基因的 mRNA 水平的无监督分层聚类揭示了三个免疫亚组，即 IG1、IG2 和 IG3（图 1A;在线补充图 S1C-E 和在线补充表 S1）。将来自该特征的转录组学和蛋白质组学数据配对产生了 103 个 mRNA-蛋白质对，显示出总体正相关（中位数 r=0.6，多次测试校正 p<0.01;在线补充图 S1F）。值得注意的是，相应 103 种蛋白的丰度也将这些患者聚集到具有相似重叠的相似免疫亚组中（在线补充图 S1G）。

正如预期的那样，免疫亚组在总生存期 （p=1e-09，log-rank 检验） 和无复发生存期 （p=4e-07，log-rank 检验） 方面存在显著差异，其中 IG1 最差，IG3 显示最佳预后（图 1B）。多变量 Cox 分析进一步验证了免疫亚组作为显著独立的预后指标 （HR，2.4;95% CI，1.33 至 4.5;p=4e-03;图 1C）。IG1 中碳水化合物抗原 19-9 （CA19- 9，p=6.8e-11） 和癌胚抗原 （CEA，p=1.2e06） 显著升高，而白蛋白 （ALB，p=9.9e-03） 水平从 IG1 到 IG3 逐渐升高（在线补充图 S1H）。IG1 有更多的肿瘤坏死 （p=0.012） 和晚期肿瘤淋巴结转移 （TNM） 分期 （p=2.7e-04） （图 1D 和在线补充图 S1H）。值得注意的是，IG1 中淋巴结转移 （p=0.019） 和血管浸润 （p=0.038） 占主导地位，而内皮细胞在 IG3 中富集。淋巴管生成增加和血管生成减少可能使 iCCA 更具侵入性并损害治疗效果。因此，免疫染色证实，与观察到广泛 CD31+ 血管的 IG3 相比，IG1 显示出明显的

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podoplanin 阳性 （PDPN+） 淋巴管增加（在线补充图 S1I）。

在这个预后 TME 特征中，IG1 富含中性粒细胞脱颗粒和上皮-间质转化 （EMT） 途径，表明存在炎症和侵袭性表型。相比之下，

白细胞介导的细胞毒性和淋巴细胞介导的免疫途径在 IG3 中占主导地位，表明免疫活性环境（图 1A）。正如预期的那样，RNA-seq 数据的 xCell 反卷积显示，IG1 在中性粒细胞和未成熟 DC （iDC） 等骨髓细胞中占主导地位，而 IG3 在适应性细胞中丰富

图 1 肝内胆管癌 （iCCA） 的免疫中心分类。（A） 基于 170 个基因的复旦大学 （FU）-iCCA （n=255） 队列的无监督分层聚类。IG1 和 IG3 中富集的通路如右图所示（χ 检验和调整后的方差分析 （ANOVA））。（B） 三个免疫亚组（对数秩检验）总生存期（上图）和无复发生存期（下图）的 Kaplan-Meier 曲线。（C） 免疫亚群和协变量在总生存期多变量分析中的 HR 和 p 值。（D） 从 xCell 中鉴定的肿瘤微环境 （TME） 亚群的相对丰度（Fisher 精确检验或方差分析）。（E） 每个细胞亚群总生存期的单变量分析。（F） 针对每个肿瘤样本绘制的病理性肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 估计值 （n=177） 与指示的特征。（G） 显示指示免疫亚群的代表性免疫染色图像。（H） 指定免疫标志物的染色强度定量 （n=188，方差分析）。

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RNA-seq 数据的 xCell 反卷积显示，IG1 在中性粒细胞和未成熟 DC （iDC） 免疫细胞、自然杀伤 （NK） 细胞和活化 DC （aDC） 等骨髓细胞中占主导地位。IG2 中的免疫浸润相对较低且异质性，伴随着基质细胞的稀缺，这可能是肿瘤纯度最高的原因（p=2.2e-04;图 1D）。一般来说，中性粒细胞 （p=0.011） 和 iDC （p=0.045） 的丰度预测生存率差，而淋巴细胞的积累，如 CD4+ T 细胞、CD8+ T 效应/记忆 （Tem） 细胞和 B 细胞，与良好的预后相关（logrank 检验;图 1E）。

进一步的病理学检查证实，IG3 中的肿瘤含有更多的肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 估计值（图 1D;在线补充图 S1J，K 和在线补充表 S1）。事实上，TIL 估计与肿瘤纯度呈负相关 （p=5.3e-03），与免疫反卷积呈正相关 （CD8+ T，p=1.6e-06;CD4+ T，p=5.6e-05;B 细胞，p=3.8e- 04;图 1F）。同样，TMA 的多重免疫染色证实，CD15、CD66b 和 CD1a 的强度在 IG1 中最强，而 CD3、CD8 和 CD20 主要在 IG3 中表达（图 1G 和 H;在线补充图 1L 和在线补充表 S1），与 xCell 估计非常一致。

然后，我们根据总体 mRNA 进行无监督聚类，其中位绝对偏差最高 25%，并确定了三个与免疫亚组在某种程度上一致的亚组（图 1A）。具体来说，配对免疫亚组和总体 mRNA 亚组 （RGs） 显示 IG1 和 IG3 分别与 RG1 和 RG2 高度重叠。利用我们的 TME 基因特征，我们还对 Jusakul 等人和 Job 等人的 iCCA 队列进行了分类，并观察到类似的患者亚组和生存分层（在线补充图 2A-D）。同样，将我们的 RNA-seq 数据与先前四项研究的转录组特征聚集在一起，导致了显着一致的患者分配（在线补充图 2E-H）。

三个免疫亚群中不同的分子特征

为了进一步说明患者亚组中的关键生物过程，我们使用 50 个标志性基因集进行了单样本基因集富集分析 （GSEA）（在线补充图 S3A 和在线补充表 S2）。主成分特征分析表明，PC1 可以用免疫和基质基因集载体的肿瘤纯度来解释，而 PC2 区分免疫和基质基因集（在线补充图 S3A-C）。无监督分层聚类进一步验证了信号通路和免疫亚群之间的关联，以及免疫和其他基因集的分离聚类（在线补充图 S3D）。

结合转录组学和蛋白质组学数据的通路富集分析表明免疫亚组之间存在不同的分子特征

（图 2A）。IG1 在炎症反应、白细胞介素 6 （IL-6）/janus 激酶 （JAK）/信号转导和转录激活因子 3 （STAT3） 信号传导以及肿瘤坏死因子-α （TNF-α）/核因子 kappa-B （NF-κB） 信号传导中含量较高，表明这些肿瘤可能由阴燃炎症驱动。与骨髓细胞介导的肿瘤免疫逃避有关的缺氧和糖酵解途径在 IG1 中也占主导地位。IG2 的特征是细胞周期转录程序 （G2M 检查点、E2F 靶点、Myc 靶点） 和 DNA 修复途径的富集，显示出高增殖活性。考虑到 IG2 中最高的肿瘤负荷，我们调整了肿瘤纯度，仍然在 IG2 中发现了丰富的增殖相关通路（在线补充图 S3E 和在线补充表 S2）。IG3 与糖酵解和缺氧途径的下调以及氧化磷酸化 （OXPHOS） 途径的上调有关，这已被强调为免疫激活的关键方面（图 2A）。

我们进一步关注促癌和抑癌炎症。IG1 富含促肿瘤炎性细胞因子和趋化因子，包括 IL-1A、IL-1B、IL-6、CXCL3、CXCL5 和 CCL18（图 2B）。大多数 S100A 家族成员（包括 S100A8/A9）的 mRNA 和蛋白水平在 IG1 中上调，这可能与促癌炎症有关（图 2C）。同时，CD8A 、 GZMA 和 PRF1 的 mRNA 和蛋白水平增加证实了 IG3 中癌症抑制性炎症的上调（图 2B）。此外，一组免疫特征共同表明，相对于其他亚组，IG3 表现出更高的 T 细胞存活率和 T 效应特征，而 IG1 表现出较高的髓源性抑制细胞 （MDSC）、M2/M1 巨噬细胞、髓系炎症和促炎特征（图 2D 和在线补充表 S2）。总体而言，我们的分层确定了两个具有拮抗性炎症表型的免疫亚组。

最近，据报道，在一项 PanCancer 研究中，环氧合酶 2 （COX-2）/前列腺素 E2 （PGE2） 轴参与调节拮抗性炎症表型。事实上，编码 COX-2 的 PTGS2 转录水平在 IG1 中显着上调（图 2B，E），与 PGE2 相关中性粒细胞的过度浸润一致，iDCs.As 预期中，COX-2 mRNA 水平较高的患者预后更差（p=1e-04，对数秩检验;图 2F）。检测到 COX-2 mRNA 水平与癌症促进因子（包括 IL-1A 、 IL-1B 和 IL-6）之间具有很强的正相关关系 （图 2G 和在线补充表 S2）。中性粒细胞和 iDC 的浸润与 COX-2 mRNA 水平呈正相关，而浆细胞、CD4+ T 细胞和 CD8+ Tem 细胞呈负相关（图 2H 和在线补充表 S2）。COX-2 相关炎症特征 （COX-IS） 是多种癌症对 ICIs 反应的预测因子，COX-IS 从 IG1 到 IG3 依次降低（在线

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补充图 S3F）。此外，IG3 具有最高的溶细胞评分和免疫表型评分 （在线补充图 S3G，H），进一步支持 IG3 可能更可能对 ICIs 有反应的假设。

KRAS 突变相关的骨髓炎症在 IG1 中占主导地位我们进一步研究了可能与免疫学特征相关的基因组改变

IG2 具有更频繁的体细胞拷贝数变异 （SCNA）（在线补充图 S4A），与之前关于 SCNA 负荷与免疫细胞浸润呈负相关的报道一致（在线补充图 S4B）。在选择亚型特异性突变基因时，我们发现 IG1 中近一半的肿瘤是 KRAS 突变体（图 3A、B 和在线补充表 S3）。KRAS 突变与

图 2 三个免疫亚群中不同的分子特征。（A） 三个免疫亚群中转录组和蛋白质组水平的通路改变。（B） 描绘参与促癌或抑癌炎症的各种标志物的 mRNA 和蛋白质水平的热图（调整后的方差分析 （ANOVA））。（C） 描述 S100A 家族成员的 mRNA 和蛋白质水平的热图（调整后的方差分析）。（D） 三个免疫亚组之间的特征评分（调整后的方差分析）。（E） 三个免疫亚组之间 COX-2 mRNA 水平的比较（Wilcoxon 秩和检验）。（F） 基于 COX-2 的 mRNA 丰度的总生存期 KaplanMeier 曲线（对数秩检验）。（G 和 H）COX-2 mRNA 水平与 COX-2 相关炎症特征 （COX-IS） 基因 （G） 的 Pearson 相关系数和指定细胞亚型 （H） 的 xCell 富集评分。

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大多数 xCell 衍生的适应性免疫和 NK 细胞特征，但与 iDC 和中性粒细胞特征呈正相关（图 3C 和在线补充表 S3）

mRNA 和蛋白质水平的 GSEA 均发现中性粒细胞脱颗粒是与 KRAS 突变最密切相关的途径（图 3D 和在线补充表 S3）。与以前的报道一致，KRAS 突变与 COX-2 、 IL-1A 、 IL-1B 、 IL-6 和 S100A8/A9 等几种炎症分子显著呈正相关，类似于

图 3 KRAS 突变与骨髓炎症之间的关联。（A） 三个免疫亚组之间突变频率存在显着差异的基因（Fisher 精确检验）。（B） 复旦大学肝内胆管癌 （FU-iCCA） 队列中 KRAS 蛋白的体细胞变异。（C） 突变谱与 xCell 的免疫/基质特征之间的关联。仅显示显著的关联 （Wilcoxon 秩和检验）。（D） 基于与 KRAS 突变相关的差异表达基因（左图）和蛋白质（右图）的通路富集分析。（东、女）有和没有 KRAS 突变的肿瘤样本中的 COX-2 mRNA 水平 （E） 和髓系炎症评分 （F） （Wilcoxon 秩和检验）。（G，H）COX-2 、 Ly6G 、 S100A8 和 S100A9 的免疫组织化学 （G） 及其染色强度的定量 （H）。一式三份实验的代表性数据 （mean±SEM）。比例尺，100 μm。（I） 箱线图显示 AY （n=6） 和 AYK （n=6） 肿瘤中指示的肿瘤微环境 （TME） 组成的分数（方差分析 （ANOVA））。（J） 小提琴图显示了 AY 和 AYK 样品中 T/自然杀伤 （NK） 细胞（左图）和髓系炎症以及中性粒细胞（右图）中 s100a8/s100a9 的表达（方差分析）。

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IG1 的免疫学特征（图 3E 和在线补充图 S4C）。具有 KRAS 突变的肿瘤还显示髓系炎症、 COXIS 和 MDSC 特征升高，以及溶细胞特征降低（图 3F、在线补充图 4D-F 和在线补充表 S3）。在 Jusakul 队列中，KRAS 突变还导致中性粒细胞浸润、COX-2/S100A8 表达和中性粒细胞脱颗粒途径升高（在线补充图 S4G-J）。

考虑到 PTGS2 是 IG1 和 KRAS 突变肿瘤中与骨髓炎症相关的最显着上调的基因，我们假设 KRAS 突变可能上调 COX-2 产生 PGE2，从而促进骨髓炎症。事实上，iCCA 细胞中 KRAS 的异位表达显着上调了 COX-2 和 COX-1 的 mRNA 和蛋白水平，并增加了培养上清液中的 PGE2 水平（在线补充图 4K-O）。Transwell 测定显示，与 KRAS 相比，来自 KRAS 的培养上清液显着增强了中性粒细胞迁移（在线补充图 S4P），这可能受到 COX-2 抑制剂塞来昔布的阻碍（在线补充图 S4Q）。通过预活化的 Jurkat T 细胞的 IL-2 产生和凋亡评估，KRAS 培养上清液处理的中性粒细胞显示出更强的免疫抑制活性（在线补充图 S4R，S）。

接下来，我们使用致癌驱动器 myr-AKT 和 YAP 与 KRAS （AY） 或 KRAS （AYK） 相结合，通过睡美人和流体动力学尾静脉注射生成 iCCA 小鼠模型（在线补充图 S5A）。免疫组化证实，AYK 而非 AY 肿瘤明显浸润中性粒细胞 （Ly6G 、 S100A8 和 S100A9 阳性），而缺乏 CD8+ T 细胞和 B 细胞 （图 3G，H 和在线补充图 S5B，C）。scRNA-seq 分析显示，中性粒细胞和巨噬细胞的比例在 AYK 肿瘤中显着升高，而 T/NK 细胞、B 细胞和基质细胞在 AY 肿瘤中含量更高，与多组学结果一致（图 3I 和在线补充图 5D-F）。AYK 肿瘤中的中性粒细胞表现出更高的髓系炎症和 S100a8、S100a9、Ptgs2 和 Il1b 等炎症标志物的表达升高，并伴有更强的 T/NK 细胞耗竭表型（图 3J 和在线补充图 S5G）。值得注意的是，KRAS 突变上调了肿瘤细胞和微环境中 COX-2 的表达（图 3G，H 和在线补充图 S5G）。因此，中性粒细胞的过度浸润可能是 KRAS 突变相关髓系炎症的原因。总体而言，KRAS 突变在破坏抗肿瘤免疫对髓系炎症相关免疫抑制方面起关键作用 （在线补充图 S5H）。

抗原呈递缺陷与 IG2 中的免疫排斥有关

抗原呈递缺陷可能会中断新抗原识别并导致肿瘤免疫逃逸，无论肿瘤突变负荷 （TMB） 如何。因此，我们探讨了这些免疫逃避途径在三个免疫亚群中的潜在作用（图 4A）。尽管 IG2 中的 TMB 和肿瘤新抗原负荷 （TNB） 相对较高，但在 IG2 中经常观察到由于人类白细胞抗原杂合性缺失 （HLA LOH，p=2e-03） 或抗原呈递机制其他成分的改变而导致抗原呈递缺陷 （APM，p=0.065） （图 4A、B;在线补充图 S6A 和在线补充表 S4）。这种缺陷可能会阻碍初始 T 细胞的交叉引发和随后被引发的 T 细胞识别肿瘤，这可能解释了 T 细胞受体/B 细胞受体 （TCR/BCR） 多样性和 RNA-seq 读数映射到 IG2 中 VDJ 基因座的减少（在线补充图 6B-D）。

我们通过量化预测的 HLA I 类结合新抗原的观察数量与预期数量的比率，进一步计算了每个肿瘤的免疫编辑评分，评分为 <1 表示存在免疫编辑。免疫编辑评分从 IG1 到 IG3 持续下降（图 4C 和在线补充表 S4）。在每个免疫亚组中，只有具有 HLA LOH 的 IG2 肿瘤具有显着更高的免疫编辑评分，表明 IG2 中的肿瘤亚克隆可能容易发生 HLA LOH 相关的免疫逃逸（图 4D）。总体而言，15% （n=38） 的患者表现出 HLA LOH，与 HLA 完整患者相比，总生存期 （p=0.069，log-rank 检验） 和无复发生存期 （p=0.024，log-rank 检验） 呈下降趋势 （图 4E，F）。

免疫检查点的表达可能反映了对活性免疫系统的癌症适应性免疫反应。我们发现了这些分子的亚组特异性模式，其中 IG2 具有相对较少的专门上调的免疫检查点（在线补充图 S6E）。HLA LOH 与一些免疫检查点分子相关，例如程序性死亡配体 1，以及作为 ICI 生物标志物的精制 TMB。 比较有和没有 HLA LOH 的肿瘤之间的多组学谱揭示了差异表达的 mRNA 和调节代谢重编程、细胞周期转录程序和免疫过程的蛋白质。HLA LOH 富含较高的 TMB/TNB 、 较高的肿瘤纯度、降低的干扰素 γ 通路和降低的主要组织相容性复合体 I 类特征。同样，在 HLA LOH 肿瘤中，T 细胞存活率和 T 效应子特征显著降低 （在线补充图 S6F）。因此，尽管 IG2 中的 TMB 相对较高，但 APM 缺陷，尤其是 HLA LOH，可能涉及免疫无能和随后的免疫排斥（图 4G）。

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三级淋巴结构与 IG3 中的抗肿瘤免疫有关

TLS 为产生抗肿瘤免疫反应提供了关键的微环境。我们使用以前的 TLS 签名来估计 TLS 分布，发现这些基因的 mRNA 水平以及估计的 TLS 评分在 IG3 中相对上调（图 5A、B 和在线补充表 S5）。病理检查还证实，瘤内 TLS 在 IG3 中显着积累（图 5C，D）

与仅具有聚集体 （Agg） 和无 TLS （TLS） 的患者相比，原代卵泡 （FL-I） 和次级滤泡 （FL-II） 的患者具有更高的估计 TLS 评分，证实了 TLS 评分的准确性（图 5E 和在线补充图 S7A）。与我们的最新报告一致，瘤内 TLSs 预测预后较好（图 5F-H），TLSs+ （Agg、FL-I 和 FL-II） 患者的特征为早期 TNM 期 （p=0.018）、无微血管浸润 （p=0.033）、无肝内转移 （p=0.011） 和肿瘤大小小 （p=8.1e-04;在线补充图 S7A 和在线补充表 S5）。

图 4 IG2 中经常出现抗原呈递缺陷。（A） 每个免疫亚组中的抗原呈递机制 （APM） 缺陷（Pearson χ 检验或 Fisher 精确检验）。（B，C）三个免疫亚组之间肿瘤突变负荷 （TMB） （B） 和免疫编辑评分 （C） 的比较 （Wilcoxon 秩和检验）。（D） 按 HLA LOH 状态和免疫分类 （Wilcoxon 秩和检验） 绘制免疫编辑评分。（东、女）基于人类白细胞抗原 （HLA LOH） 状态杂合性缺失的总生存期 （E） 和无复发生存期 （F） 的 Kaplan-Meier 曲线（对数秩检验）。（G） 说明 HLA LOH 如何导致 IG2 免疫逃逸的模型。

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多组学数据表明，TLSs + 肿瘤显示 G2M 检查点、炎症反应和 EMT 通路的特异性下调，而代谢和过氧化物酶体的通路上调（在线补充图 S7A）。正如预期的那样，T 细胞和 B 细胞以及共抑制因子在 TLSs+ 肿瘤中富集

提示免疫激活表型 （在线补充图 S7B，C）。此外，溶细胞评分和 COX-IS 均预测 TLSs+ iCCA 患者对免疫治疗的反应更好 （在线补充图 S7D，E）。因此，IG3 中的免疫监测可能部分归因于瘤内 TLS（图 5I），这预测了该亚组对免疫治疗的反应更好。

图 5 三级淋巴结构 （TLS） 在 IG3 中富集。（A） 每个免疫亚组中的 TLS 相关特征（调整后的方差分析 （ANOVA））。（B） 三个免疫亚组之间 TLS 评分的比较（Wilcoxon ranksum 检验）。（C） 瘤内 TLS 的组织学表现。（D） 三个免疫亚组之间基于 H&E 的瘤内 TLS 成熟度的比较（Fisher 精确检验）。（E） 基于 H&E 的瘤内 TLS 成熟度之间 TLS 评分的比较（Wilcoxon 秩和检验）。（F-H）基于 TLS 评分 （F）、基于 H&E 的瘤内 TLS （G） 和基于 H&E 的瘤内 TLS 成熟度 （H）（对数秩检验）的总生存期 Kaplan-Meier 曲线。（I） 显示 TLS 形成和功能调节因子的多组学概况的图表。

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HBV 感染与 iCCA 中的髓系炎症呈负相关

乙型肝炎病毒 （HBV） 感染是众所周知的 iCCA 危险因素;然而，人们对 HBV 相关 iCCA 的免疫基因组学特征知之甚少。我们发现 HBV 感染患者 （n=68） 在 IG1 中代表性不足 （p=0.022），与 KRAS 突变互斥 （p=3.3e-03） 并与 TP53 突变共存 （p=0.036） （图 6A;在线补充图 S8A 和在线补充表 S6）。HBV 阳性肿瘤显示溶细胞评分升高、髓系炎症特征降低和 COX-2 mRNA 水平降低（图 6B）。最近的研究表明，ICIs 对 HBV 阳性肝细胞癌 （HCC） 患者有效，而不是非病毒 HCC。考虑到髓系炎症对免疫治疗的负面影响，COX-IS 评分预测 HBV 阴性亚组对 ICIs 的反应更差 （图 6B）。HBV 阳性 iCCA 患者的转录组类似于其他对 ICI 有反应的实体瘤的表达谱（图 6C）。因此，在 HBV 阳性 iCCA 中观察到的骨髓炎症减少可能定义了可以从 ICIs 中受益的人群。

我们还从 5 个 HBV 阳性和 5 个 HBV 阴性 iCCA 中收集了肿瘤和邻近的非肿瘤组织，用于 scRNA-seq 分析（在线补充图 S1A 和 S8B）。在 HBV 阳性肿瘤中观察到 T/B/NK 细胞比例增加和髓系细胞比例降低（图 6D），但 HBV 感染不会影响相邻非肿瘤组织中每个簇的比例（数据未显示）。然后，我们根据富集的基因集将 10 名患者分为最接近的免疫亚组（在线补充图 S8C）。CI 为 0.7 时，排除了 4 例患者，其中 1 例 （P06T） 、 3 例 （P03T/P09T/ P10T） 和 2 例 （P13T/P15T） 样本分别分为 IG1 、 IG2 和 IG3。P06T 是 IG1 中唯一残留的患者，也是所有 10 个 iCCA 中唯一出现 KRAS 突变的患者。在 P06T 中，炎症分子的 mRNA 水平，包括 COX-2 、 IL1A 、 S100A8 和 S100A9 在肿瘤或髓系亚群中较高 （在线补充图 S8D）。患者 P06T 的 T 细胞中 CD8A 、 GZMA 和 PRF1 等溶细胞分子的 mRNA 水平下调，证实了 IG1 中的免疫抑制性 TME （在线补充图 S8D）。

接下来，我们对 T/NK 细胞和髓样细胞进行了无监督聚类。T/NK 细胞中共出现 13 个簇（图 6E 和在线补充图 S8E）。IG1 中炎性 CD4 T_ CD154 的比例显著升高，而从 IG1 到 IG3 的溶细胞 NK_GNLY 簇的比例略有增加（在线补充图 S8G）。两者CD4_SOCS3and NK_CD160were富含 HBV 阳性肿瘤，表明 HBV 感染减轻了炎症反应并增强了溶细胞活性（图 6F）。髓系的重新聚集揭示了

14 个种群（图 6G 和在线补充图 S8F）。值得注意的是，Macro_IL1B 是 HBV 感染后比例下降最显着的髓系簇，其特征是 IL1A 、 IL1B 、 IL6 和 TNF 的独家高表达 （图 6H 和在线补充图 S8F）。COX-2 mRNA 水平和促炎特征在 Macro_IL1B 中显著高于其他髓系簇，表明 Macro_IL1B 是髓系炎症的主要来源（图 6I）。事实上，来自 HBV 相关 iCCA 的髓系细胞显示炎症途径下调，例如补体和凝血级联反应以及干扰素 α 反应（图 6J）。在 HBV 阳性样本中观察到的循环细胞比例低于 HBV 阴性样本，这反映了增殖能力相对降低（图 6H）。总之，HBV 阳性患者具有独特的 TME，CD4_SOCS3 和 NK_CD160 簇比例增加，Macro_IL1B簇和髓系细胞增殖减少，有助于抗肿瘤免疫。

差异表达基因 （DEG） 分析显示，HBV 阳性肿瘤巨噬细胞中排名前低调的基因包括 CCL13 、 CTSC 、 FCGR2A 、 C1QA 和 C1QB （在线补充图 S8H，I）。HBV 阳性肿瘤中的 NK 细胞上调了几个溶细胞相关基因，例如 KLRC2、GZMK 和 CXCR6 （在线补充图 S8J）。在 HBV 阳性肿瘤中，巨噬细胞的特征是炎症反应下调，而 NK 细胞上调细胞毒性和同种异体移植物排斥反应（图 6K 和在线补充图 8H-J）。总的来说，iCCA 中的 HBV 感染可以缓解骨髓炎症并促进抗肿瘤免疫。因此，HBV 感染与我们队列中较长的总生存期略相关 （p=0.091，log-rank 检验;图 6L），与之前的研究一致。

讨论

大量的测序研究提高了我们对 iCCA 分子发病机制的理解，然而，人们对 iCCA 的免疫基因组学特征以及如何利用这些信息来最大限度地提高对免疫疗法的反应知之甚少。在此，我们提供了 iCCA 的免疫基因组学特征，涉及 WES、RNA-seq、蛋白质组学、scRNA-seq 和小鼠模型分析，这可以发现新的生物学见解并识别有前途的靶点以进行精确的肿瘤学实践。

我们确定了三个不同的免疫亚组，具有不同的临床、免疫、遗传和分子特征。IG1 由中性粒细胞和 iDC 的富集以及 KRAS 突变定义。KRAS 突变与髓系细胞和 MDSC 募集到 TME 中有关，然后驱动免疫抑制。一致地，KRAS 突变可能是骨髓炎症和免疫抑制的主要原因

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在 IG1 中。IG2 是一个免疫排斥亚组，肿瘤纯度高，增殖活性强，APM 存在缺陷。IG2 中的一些肿瘤可能具有祖先免疫活性微环境

然后在 HLA LOH 富集期间逐渐成为“排除性”（图 4G）。IG3 以适应性免疫细胞、 aDC 和 NK 细胞为主，表现出免疫激活的表型，富集

图 6 乙型肝炎病毒 （HBV） 感染对肝内胆管癌 （iCCA） 免疫微环境的影响。（A） HBV 感染与指示特征（方差分析 （ANOVA）、Pearson χ 检验或 Fisher 精确检验）的关联。（B） HBV 感染和未感染患者的代表性特征比较（Wilcoxon 秩和检验）。（C） 与用抗 PD-1 mAb（抗程序性细胞死亡蛋白 1 单克隆抗体）处理的其他实体瘤的亚类定位。（D） 肿瘤样本中指示免疫细胞的比例。（E） 显示 T/自然杀伤 （NK） 细胞亚型的均匀流形近似和投影 （UMAP） 图。（F） 显示 T/NK 细胞分数的箱线图 （ANOVA）。（G） 显示髓源性细胞亚型的 UMAP 图。（H） 显示髓源细胞分数 （ANOVA） 的箱线图。（I） 小提琴图显示髓系亚组中 COX-2 的 mRNA 水平（上图）和促炎评分（下图）。（J，K）基于髓系细胞 （J）、CD4+ T 细胞、NK 细胞和巨噬细胞 （K） 中与 HBV 感染相关的差异表达基因的通路富集分析。（L） 基于 HBV 感染状态的总生存期 Kaplan-Meier 曲线（对数秩检验）。

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TLS 的3 个免疫亚组的免疫基因组学特征在多个独立队列中具有可重复性，支持我们的分类是合适和可靠的。

HBV 感染诱导的慢性炎症会增加 HCC 和 iCCA 的风险。Lim 等人使用高维 CyTOF 分析揭示了 HBV 相关的 HCC 微环境比非病毒相关的 HCC 微环境更具免疫抑制性和耗竭性 HCC.In 造影剂，我们发现 HBV 感染减轻了骨髓炎症并增强了 iCCA 中 NK 细胞的溶细胞活性

表明这种共同的病因可能导致 HCC 和 iCCA 之间出现不同的微环境。最近，对 1600 多名晚期 HCC 患者进行的三项随机 III 期临床试验显示，免疫疗法对病毒相关 HCC 患者具有优势。然而，目前尚不清楚潜在的病毒性肝炎是否会影响 ICI 在 iCCA 中的反应。我们在这里提出 iCCA 中的 HBV 感染可以抵消过度的髓系炎症并可能重振抗肿瘤免疫力，这可能有利于 ICIs 的疗效。病毒相关 iCCA 患者髓系炎症的减少可能是由于在持续 HBV 感染期间选择了 KRAS 野生型肿瘤。另一个合理的解释是慢性

图 7 肝内胆管癌免疫基因组学特征总结。雷达图表示描述免疫抑制、免疫排斥和免疫激活亚组的分子特征和临床特征的平均 Z 评分。提出了每个亚组的治疗靶点。

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HBV 感染和先天免疫反应，尤其是中性粒细胞的功能。

在治疗方面，本研究旨在表征适合特定个体化治疗的 iCCA 免疫亚群（图 7 和在线补充表 S7）。IG1 可能对骨髓靶向治疗有反应，例如 C-X-C 基序趋化因子受体 2 （CXCR2） 和集落刺激因子受体 （CSFR） 抑制剂，以分别消耗或重编程肿瘤相关的中性粒细胞和 M2 巨噬细胞。最近在 KRAS G12C 选择性抑制剂方面的成功可能激发了对该免疫抑制亚组中靶向 KRAS 突变的新热情。IG2 可能从特异性 CDK 抑制剂以及调节 HLA 和 APM 转录的策略中获得更好的结果。IG3 中 TLS 的富集及其在 ICIs 治疗反应中的潜在作用可能有助于指导 ICIs 的临床应用。值得注意的是，三个免疫亚组显示出不同的免疫检查点表达模式，强调了个性化 ICI 的需求。

我们的研究有一些局限性。使用具有不同临床病理特征和治疗的回顾性队列可能需要进一步的前瞻性验证。此外，用于估计免疫细胞浸润的 TMA 免疫染色可能过度代表或低估每个免疫亚群的密度或分布。总之，我们的综合多模块分析提供了对 iCCA 免疫景观的全面了解。具有特异性免疫和非免疫特征的三个免疫亚组可能对在 iCCA 中使用新型治疗策略的临床试验设计产生影响。

作者单位

1中国上海 复旦大学金山医院肿瘤诊断与治疗中心 2上海血液研究所，医学基因组学国家重点实验室，上海转化医学国家研究中心，上海交通大学医学院瑞金医院 3 中山医院肝癌研究所肝脏手术与移植科，部致癌与癌症侵袭重点实验室教育背景，复旦大学，中国上海 4中国科学院大学上海营养与健康研究所计算生物学重点实验室 5上海交通大学医学院瑞金医院胃肠病学和肝病学系，中国上海 6中国科学院大学上海巴斯德研究所微生物、发展与健康中心、分子病毒学和免疫学重点实验室， 中国上海 7美国德克萨斯州休斯顿贝勒广场一号贝勒医学院分子与人类遗传学系 Lester 和 Sue Smith 乳腺中心 8复旦大学生物医学研究院医学表观遗传学与代谢重点实验室 9上海药物研究所分析化学系、中国科学院受体研究重点实验室 中国科学院， 中国 上海 10中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所， 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心， 细胞生物学国家重点实验室， 中国 上海

致谢 我们感谢 Peng Cui、Bing Li 和 周 Zhang（燃石医学）在生物信息学分析方面的帮助。

贡献者概念化：QG、DG 和 HZ;方法：JL、YD、BX 和 QG;形式分析：JL、YD、BX、LD、XS、SJ、MW 和 HF;调查：JL、GS、CS、MZ、XX、JM 和 SZ;资源：QG、DG、HZ、JF、JZ、BZ、XW 和 XZ;数据管理：QG、YD 和 JL;写作：JL 和 QG;可视化：YD 和 JL;监督，QG;资金获取：QG 和 JL。QG 作为担保人对整体内容负责。

资助这项工作得到了中国国家自然科学基金（82130077、81961128025 和 82103314 资助）、上海市科学技术委员会的研究项目（资助 20JC1418900 和 19XD1420700）、金山医院灵活移动人才研究启动基金 （RXRC-2020-1）、上海市科学技术委员会 （20JC1418900） 和中国博士后科学基金（资助 2020M681181）。

利益争夺 无 宣布。

患者同意发表 不需要。

伦理批准 本研究涉及人类参与者，并经中山医院研究伦理委员会批准，并获得了每位患者的书面知情同意书。参与者在参加前同意参加研究。

出处和同行评审 未委托;外部同行评审。

数据可用性声明 数据在公共、开放访问的存储库中可用。

数据可应合理要求提供。

补充材料 此内容由作者提供。它未经 BMJ Publishing Group Limited （BMJ） 审查，可能未经同行评审。所讨论的任何意见或建议仅代表作者的观点或建议，未经 BMJ 认可。BMJ 不承担因依赖内容而产生的所有责任和义务。如果内容包含任何翻译材料，BMJ 不保证翻译的准确性和可靠性（包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药物名称和药物剂量），也不对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。

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ORCID iD

林健 http://orcid.org/0000-0001-6457-7026 胡 周 http://orcid.org/0000-0001-7006-4737

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