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收到：2023 年 4 月 8 日

接受：2024 年 3 月 19 日

在线出版：2024 年 3 月 29 日

Dheck 更新 Samuel Speaks （1） 1,4 ， Matthew I. McFadden ， 阿什利·扎尼1 ， 阿比盖尔·索尔斯塔德 ,
流感病毒激活细胞炎症小体通路，对感染结果既有益又有害。在这里，我们研究了炎症小体激活的成孔蛋白gasdermin的功能 （GSDMD）感染期间。基因敲除（KO）小鼠GSDMD的消融 尽管病毒载量相似，但与野生型 （WT） 小鼠相比，可显着减轻流感病毒诱导的体重减轻、肺功能障碍、肺组织病理学和死亡率。感染 小鼠表现出肺转录组学显示的炎症基因特征减少。其中，KO小鼠肺中中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶的检测减少证实了中性粒细胞基因激活特征的减少。事实上，在体内观察到直接感染的中性粒细胞，体外中性粒细胞的感染会诱导 DNA 和组织损伤酶的释放，这在很大程度上依赖于 GSDMD。感染WT小鼠的中性粒细胞耗竭概括了在Gsdmd中观察到的死亡率，肺部炎症和肺功能障碍的降低 动物，而消耗在

 成果


GSDMD 增加了 IAV 感染期间的肺部病理和功能障碍


B


Gsdmd 小鼠对 IAV 感染的炎症转录反应减弱

更好地了解导致 WT 和 Gsdmd 之间生存和肺损伤差异的潜在机制 动物，我们比较了WT和Gsdm的全局基因转录反应 IAV感染后的小鼠。感染后第 7 天肺 mRNA 总表达的定量测量显示 WT 和 Gs 中诱导的不同转录谱 通过主成分分析揭示的动物（图3A）。差异基因表达分析（倍数变化|3|， 的 Gsdmd 相比，感染的 WT 小鼠中增加了这些基因


GSDMD 缺失可减少 IAV 感染期间的炎症反应

一个
C
B
 GO 生物过程

图 3 GSDMD 在 IAV 感染中促进炎症基因表达程序。A-E WT 和 小鼠以 50 TCID50 的剂量感染 IAV 毒株 PR8。感染后第 7 天，从 和 小鼠肺部提取 RNA 并进行 RNA 测序。A 比较 WT 和 Gsdmd 肺部 RNA 测序结果的主成分分析。每个点代表一只小鼠。B 比较 WT 与 Gsdmd 小鼠的差异基因表达的火山图（Ifc |1.5|, adj -value 使用 DEseq2 确定）。红色，812 个基因在 WT vs KO 中上调；蓝色，447 个基因在 WT vs Gsdmd 中下调。C 不同表达基因的分层聚类。热图表示相对基因表达，红色表示表达上调的基因，蓝色表示表达下调的基因，每列代表一只小鼠。簇颜色表示与受感染的 Gsdmd 小鼠相比，受感染的 WT 小鼠中表达模式相似的基因。D 每个簇内基因的基因本体分析。条形图代表 中每个簇内前 10 个富集的 GO 术语，用颜色表示。条形图长度代表显著富集通路的 -log10 调整 -值（通过基因本体的 topGO 富集分析得出的 -Log10 adj -值 ）。
E Network of GO Biological Process terms enriched by gene set enrichment analysis. Node size represents number of genes within each pathway. Edges represent the number of shared genes across GO Biological Process terms. Color indicates the Enrichment Score where orange indicates a positive score and blue indicates a negative score for transcriptional signatures derived from WT infected lungs relative to
E 通过基因组富集分析富集的 GO 生物过程术语网络。节点大小代表每个通路中的基因数量。边代表 GO 生物过程术语中共享基因的数量。颜色表示富集得分，其中橙色表示 WT 感染肺相对于 肺的转录特征的正得分，蓝色表示负得分。

GSDMD KD 细胞（补充图 3D）。我们的数据总体表明，在没有 GSDMD 的情况下，IAV 诱导的炎症反应会受到抑制。


GSDMD 的缺失会减少 IAV 感染期间的中性粒细胞活化程序


我们对全局基因表达数据进行了进一步分析，发现在感染 IAV 的 Gsdmd 与 WT 小鼠中，与中性粒细胞胞外陷阱形成、NOD 样受体信号转导和中性粒细胞脱颗粒相关的基因组显著减少（图 5A、B），这表明中性粒细胞活性降低可能是 Gsdmd 小鼠发病机制减弱的原因之一。因此，我们使用流式细胞术检测了 GSDMD 是否参与了感染期间中性粒细胞向肺部的招募（补充图 4）。令人惊讶的是，我们发现 WT 小鼠和 Gsdmd 小鼠在感染后第 7 天均表现出肺部中性粒细胞的强力招募，在每肺中性粒细胞数量（图 5C）或中性粒细胞相对于 CD45 免疫细胞总数的百分比（补充图 5）方面没有观察到基因型之间的统计学差异。我们还观察到其他先天性免疫细胞群，如嗜酸性粒细胞、巨噬细胞或自然杀伤细胞也被招募到肺部，同样，Gsdmd 动物的适应性 CD4 和 CD8 T 细胞及 B 细胞的招募也没有受到影响（补充图 5，补充图 6A）。我们还测量了感染后第 3 天肺部的免疫细胞募集情况，发现细胞浸润极少，WT 小鼠和 Gsdmd 小鼠之间没有差异（图 5C、补充图 5、补充图 6A）。感染后第 7 天，对肺部切片的造血免疫细胞标记 CD45 染色证实，WT 和 KO 动物的肺部都有淋巴细胞聚集（补充图 6B）。因此我们假设，尽管 Gsdmd 小鼠肺部的中性粒细胞数量相似，但中性粒细胞的功能可能会降低。为了验证这一点，我们测量了中性粒细胞弹性蛋白酶的水平，这是一种由活化的中性粒细胞释放的蛋白水解酶，可降解细胞外基质并促进中性粒细胞胞外陷阱的形成 。与 WT 组织相比，感染 Gsdmd 小鼠肺部活化中性粒细胞的这一指标明显下降（图 5D）。我们同样测量了髓过氧化物酶，这是一种由嗜氮中性粒细胞释放的分子。
Fig. 4 | IAV-induced inflammation is diminished in Gsdmd mice. A, B RNAseq results as in Fig. 3 were further analyzed. A Heat map for top differentially regulated genes involved with Response to Virus as defined by GO Biological Process. B Heatmap for top differentially regulated genes involved with neutrophil chemotaxis as defined by GO Biological Process. C Relative transcript quantification from targeted genes in the lungs of WT and Gsdmd mice at day 7 post infection with 50 TCID50 IAV strain PR8 via qRT-PCR (each dot represents a single mouse, error bars indicate SEM, Mocks: , IAV-infected: from 1 experiment, samples are independent from those used for RNAseq,
图 4 | Gsdmd 小鼠的 IAV 诱导的炎症反应减弱。A、B 进一步分析了图 3 中的 RNAseq 结果。A 根据 GO 生物过程定义的与对病毒的反应相关的顶级差异调控基因热图。B 根据 GO 生物过程定义的与中性粒细胞趋化有关的顶级差异调控基因热图。C 在感染 50 TCID50 IAV 毒株 PR8 后第 7 天，通过 qRT-PCR 对 WT 小鼠和 Gsdmd 小鼠肺部目标基因的相对转录量进行量化（每个点代表一只小鼠，误差条表示 SEM，Mocks： IAV 感染： 来自 1 个实验，样本与用于 RNAseq 的样本是独立的， 值由单向分析确定。

方差分析，然后进行 Tukey's 多重比较检验，仅比较受感染的 WT 和 Gsdmd
所示）。D ELISA 定量模拟感染、感染后第 3 天（来自 1 个实验）、感染后第 5 天（来自 1 个实验）或感染后第 7 天（来自 2 个独立实验）肺匀浆中 TNF、IL-6、IFN , IL , IL-18 或 CCL1 的水平（每个点代表一只小鼠，Mocks： IAV 日 , IAV 日 , IAV 日 , 误差条表示 SEM， 值由双向方差分析确定，然后进行 Tukey's 多重比较检验，仅显示第 7 天感染的 WT 和 Gsdmd 之间的比较）。中性粒细胞颗粒催化活性氧中间产物的产生，而活性氧中间产物已知会导致组织损伤，我们发现 肺组织中的活性氧中间产物也减少了（图 5D）。因此，在没有 GSDMD 的情况下，IAV 感染期间存在于肺部的活化中性粒细胞产物会减少。
To further examine roles for GSDMD in neutrophils, we next infected primary neutrophils enriched from the bone marrow of WT or Gsdmd mice (enrichment shown in Supplementary Fig 7). Ethidium homodimer-1 fluorescence in WT neutrophil media increased over time following infection, indicating that DNA release characteristic of NETosis occurred in response to virus exposure (Fig. 5E, F). Interestingly, minimal DNA staining was observed over the same time course for Gsdmd neutrophils (Fig. 5E, F). Corroborating these results, we observed that release of neutrophil elastase and myeloperoxidase into the cell supernatants following infection was largely dependent on GSDMD (Fig. 5G). Given that neutrophils were previously reported to be directly infected by influenza virus and given that our in vitro results suggest a direct response of these cells to virus (Fig. 5E-G), we sought to confirm that neutrophils are infected by IAV in vivo. Using Cre recombinase-expressing PR8 in a Cre-inducible fluorescent reporter mouse , we observed infection of alveolar macrophages, a well characterized immune cell target of IAV, and also observed a population of neutrophils expressing the Cre-induced fluorescent reporter of infection (Supplementary Fig 8A). We further noted that the infected neutrophils showed higher MHCII surface levels than noninfected cells, highlighting neutrophil activation upon infection (Supplementary Fig 8B). These findings prompted us to re-evaluate neutrophil surface markers in our previously performed flow cytometry experiments from WT or Gsdmd lungs. We found that levels of Ly6G, CD11b, and Ly6C were unchanged in WT and Gsdmd
为了进一步研究 GSDMD 在中性粒细胞中的作用，我们接下来感染了从 WT 或 Gsdmd 小鼠骨髓中富集的原发性中性粒细胞（富集情况见补充图 7）。感染后，WT 中性粒细胞培养基中的乙二胺同二聚体-1 荧光随着时间的推移而增加，这表明在病毒暴露时发生了具有 NETosis 特征的 DNA 释放（图 5E、F）。有趣的是，在相同的时间过程中，Gsdmd 中性粒细胞的 DNA 染色极少（图 5E、F）。与这些结果相印证的是，我们观察到感染后细胞上清液中中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶的释放在很大程度上依赖于 GSDMD（图 5G）。鉴于之前有报道称中性粒细胞可直接感染流感病毒 ，也鉴于我们的体外实验结果表明这些细胞对病毒有直接反应（图 5E-G），我们试图证实中性粒细胞在体内可感染 IAV。通过在 Cre 诱导的荧光报告小鼠 中使用表达 PR8 的 Cre 重组酶，我们观察到肺泡巨噬细胞（IAV 的免疫细胞靶标）受到感染，同时还观察到表达 Cre 诱导的感染荧光报告的中性粒细胞群（补充图 8A）。我们进一步注意到，与未感染细胞相比，感染的中性粒细胞显示出更高的 MHCII 表面水平，这表明中性粒细胞在感染后被激活（补图 8B）。这些发现促使我们在之前进行的 WT 或 Gsdmd 肺流式细胞术实验中重新评估了中性粒细胞表面标记物。我们发现，无论是否感染，WT 和 Gsdmd 中性粒细胞中 Ly6G、CD11b 和 Ly6C 的水平都没有变化（补充图 9A、B）。相比之下，平均

WT 和 Gsdmd 感染 IAV 后，肺中性粒细胞上的 MHCII 平均荧光强度增加
补充图 9A、B）。这些结果共同揭示了中性粒细胞在感染 IAV 后通过 GSDMD 依赖性和非依赖性途径被激活。重要的是，我们的 RNA 测序结果、体内中性粒细胞产物的测量结果以及体外中性粒细胞对 IAV 反应活性的检测结果均表明，在 IAV 感染期间，中性粒细胞的功能（包括 DNA 和组织破坏酶的释放）依赖于 GSDMD。


中性粒细胞增加了 IAV 感染的炎症反应和死亡率


为了探究中性粒细胞活性减弱是否可以解释我们在Gsdmd 动物中观察到的流感病毒感染严重程度降低的原因，我们在WT小鼠感染的早期清除了中性粒细胞，并测量了感染结果。简而言之，我们用针对中性粒细胞的抗体（ -Ly6G）或同种型对照抗体处理小鼠，从感染后第3天开始，直到感染后第8天（图6A）。选择这一治疗时间表是为了让急性中性粒细胞反应在阻断过度病理反应之前不受抑制地进行，同时也因为它代表了对中性粒细胞耗竭作为一种治疗策略的测试。我们通过测量 -Ly6G 处理的小鼠在感染后第 5 天肺部中性粒细胞总数的减少以及与整个 CD45 免疫细胞群相比中性粒细胞的相对百分比，证实了中性粒细胞的消耗（图 6B，补充图 10A-C）。通过分析嗜酸性粒细胞和肺泡巨噬细胞的总计数和百分比，进一步证实了中性粒细胞消耗的特异性。(补充图 ）。在检测两组小鼠的发病率时，中性粒细胞耗竭的小鼠患流感的几率明显较低。

图 5 IAV 诱导的中性粒细胞功能在 GSDMD 缺失的情况下降低。A 对图 3 中的 RNAseq 结果进行了分析，以创建热图，显示 KEGG 通路分析所定义的参与中性粒细胞胞外陷阱形成和 NOD 样受体信号转导的差异调控基因。B 对 WT 与 小鼠差异表达基因的 REACTOME 分析确定了与中性粒细胞脱颗粒相关基因的差异。C 通过流式细胞术对模拟感染（来自 2 个独立实验）、感染后第 3 天（来自 1 个实验）或感染后第 7 天（来自 3 个独立实验）的小鼠肺部中性粒细胞浸润进行定量（每个点代表一只小鼠， mocks, day day 7 , 误差条表示 SEM, NS, 通过双向方差分析和 Tukey's 多重比较检验无显著性意义）。D ELISA 定量模拟感染（来自 1 个实验）、感染后第 3 天（来自 1 个实验）或感染后第 7 天（来自 2 个独立实验）肺匀浆中的中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶水平（每个点代表一只小鼠， mocks, day day 7 , 误差条表示 SEM, 值由双向方差分析确定，然后进行 Tukey's 多重比较检验）。E 通过 IAV 感染后的荧光强度读数对骨髓中性粒细胞的相对胞外 DNA 进行量化（PR8，MOI=10，每个数据点是 的平均值，细胞来自每种基因型的 3 只小鼠，一式三份，误差条表示 SEM， ， 由 WT IAV 与 IAV 的双向方差分析及 Bonferroni 多重比较检验确定，其他比较未显示）。F 每个感染孔的最大荧光强度与 E 中相同（ -值通过双尾非配对 t 检验确定）。G 如 所示，通过 ELISA 对细胞上清液中的中性粒细胞产物进行量化（ ，细胞来自 3 只小鼠，一式三份，误差条表示 SEM， 值由单向方差分析和 Tukey's 多重比较检验确定）。与同种型对照处理组相比，病毒引起的体重减轻（图 6C）。值得注意的是，中性粒细胞耗竭对致死性感染具有完全的保护作用，而我们在同种型对照处理的小鼠中观察到 致死率（图 6D），这一结果反映了在 Gsdmd 小鼠中看到的保护作用（图 1C）。

与 Gsdmd 和 WT 小鼠的比较结果类似，在感染后第 5 天或第 7 天，中性粒细胞耗竭小鼠肺部的病毒滴度与同种型对照小鼠肺部的病毒滴度没有统计学差异（图 6E）。我们进一步观察到，与对照组相比，去中性粒细胞小鼠肺部的炎性细胞因子水平显著下降，包括 IL- 、IL-6、IFN 和 TNF- （图 6F）。同样，经 -Ly6G 处理后，CCL1 水平也相应降低（图 6F）。这些结果表明，中性粒细胞总体上增强了 IAV 感染肺部的炎症反应。最后，我们对 Ly6G 处理小鼠和同型对照处理小鼠肺部的中性粒细胞弹性蛋白酶进行了量化，以进一步证实中性粒细胞弹性蛋白酶是中性粒细胞存在和活性的标志物。事实上，我们发现 Ly6G 处理小鼠肺部的中性粒细胞弹性蛋白酶降低了（图 6F），这加强了我们在 Gsdmd 与 WT 小鼠中发现类似变化的数据（图 5D）。这些结果表明，中性粒细胞在 IAV 感染的肺部提供了炎症的整体增效作用。

为了进一步了解 IAV 感染期间 GSDMD 缺失所提供的保护是否由中性粒细胞介导，我们在 IAV 感染期间耗尽了 WT 和 动物体内的中性粒细胞（补充图 11）。我们再次观察到，中性粒细胞耗竭或 GSDMD 的缺失可保护小鼠免于死亡和体重严重下降（图 6G、H）。中性粒细胞耗竭的 Gsdmd 小鼠同样在感染中存活，但在体重减轻方面没有显示出比单独使用 Gsdmd 更多的益处（图 6G、H）。我们还通过这些小鼠的全身胸透测量肺功能。在 WT 同型对照组小鼠中，表明气道阻力的 PenH 因感染而增加（图 6I）。中性粒细胞耗竭的 WT 小鼠、Gsdmd 对照小鼠和中性粒细胞耗竭的 Gsdmd 小鼠与 WT 对照处理的小鼠相比，肺功能下降较少，能更快地恢复到基线肺功能（图 6l）。重要的是，与体重下降的测量结果类似，我们没有观察到 Gsdmd 与中性粒细胞耗竭相结合会带来额外的益处（图 6l）。这些胸透测量结果表明，中性粒细胞耗竭可在 IAV 感染期间保护肺功能，这与 IAV 感染期间 GSDMD 的炎症性肺损伤效应在很大程度上是由中性粒细胞介导的这一观点是一致的。总之，我们的研究结果表明，流感病毒感染期间肺部的中性粒细胞活动在很大程度上依赖于 GSDMD，中性粒细胞会放大 IAV 感染期间的炎症反应和肺功能障碍。

 讨论


我们发现炎性体效应器 GSDMD 会对流感病毒感染的结果产生不利影响。在缺乏 GSDMD 的情况下，小鼠的发病率和死亡率降低，尽管肺部的病毒负荷未受影响。事实上，GSDMD 会导致肺部炎症、中性粒细胞活性和肺部功能障碍。与 WT 小鼠相比， 小鼠感染 IAV 后的预后有所改善，这与多种组织损伤性炎症通路的整体转录减少有关。此外，GSDMD缺失时中性粒细胞活性基因表达程序受损与疾病预后改善相关，我们随后通过外源消耗这些免疫细胞证实了这一点。虽然中性粒细胞耗竭与 GSDMD 的基因消减并不等同，但我们注意到，它们在 IAV 感染结果方面的表型相似，都是减轻体重、提高存活率、改善肺功能和减轻肺部炎症，而且都不影响病毒滴度。这些数据与 GSDMD 依赖性中性粒细胞活动驱动流感病毒发病机制的模型相一致。支持这一模型的其他数据包括1）中性粒细胞脱颗粒释放的组织破坏酶（中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶）水平降低
A
B
C


图 6 | 中性粒细胞会增加流感的严重程度。A IAV 感染（50 TCID50）和（B-I）抗体注射示意图。B 通过流式细胞术检测第 5 天 WT 和 Gsdmd 小鼠肺部的中性粒细胞数量（每个点代表一只小鼠，误差条表示 SEM， 值通过双尾非配对 -test）。C 每组小鼠的体重减轻（每个点是相对于第 0 天归一化为 的单个小鼠体重的平均值，误差条表示 SEM， ， ，通过双向方差分析，然后进行 Bonferroni 多重比较检验）。D 存活率分析。E 肺匀浆中的病毒滴度，每组 （每个点代表一只小鼠，误差带表示 SEM，通过双向方差分析和 Tukey's 多重比较检验，WT 和 Gsdmd 样本之间没有发现显著的统计学差异）。F ELISA 测量每组 感染后第 7 天的肺匀浆（每个点代表一只小鼠， 值由双尾非配对 t 检验确定）。G 感染 WT 和 的小鼠的存活率分析，每组 ，处理方法同 (A)。 小鼠的体重减轻（每个圆点是相对于第 0 天标准化为 的单个小鼠体重的平均值，误差条表示 SEM， ，采用双向方差分析，然后进行 Bonferroni 多重比较检验，星号表示与 WT-Isotype 比较的各自色标）。彩色线条对应的组别如 (G)。I 通过全身胸透测量 PenH（每个点是 小鼠的平均值，误差条表示 SEM， ，通过双向方差分析，然后进行 Bonferroni 多重比较检验，星号表示与 WT-Isotype 比较的相应色标）。彩色线条对应的组别如 (G)。B-F）中的数据代表一次实验，（G-I）中的数据代表另外一次独立实验。 肺中，2）Gsdmd 肺中与活化的中性粒细胞相关的基因表达量减少（如：KEGG NETosis、REAC、REAC......）、KEGG NETosis、REACTOME 脱颗粒），3）体外纯化的 中性粒细胞功能降低（NETosis 和脱颗粒），4）证明 Gsdmd 小鼠中性粒细胞的耗竭并不影响 IAV 诱导的体重减轻或肺功能，表明这些 KO 小鼠的中性粒细胞无功能。在控制流感病毒感染结果的免疫细胞类型中，中性粒细胞是最先浸润感染部位的细胞之一 。 中性粒细胞的有益功能包括吞噬活性、细胞因子和趋化因子的释放以及中性粒细胞胞外捕获物的形成，这些功能传统上与抗菌活动有关，但也能促进抗病毒状态 。相反，其他研究则强调了中性粒细胞无节制招募的潜在有害影响，其特点是过度炎症和肺损伤 。越来越多的研究表明，中性粒细胞的过度活动是导致不良疾病结局的一个驱动因素，我们的数据为这些研究增添了新的内容 。

虽然 GSDMD 对 IAV 复制或感染结果的影响研究不多，但它在其他情况下对巨噬细胞和中性粒细胞发挥重要作用的特性已得到充分证实 。事实上，在几种细菌感染中，巨噬细胞的脓细胞死亡以及 IL-1 和 IL-18 的释放广泛依赖于 GSDMD 。我们对 THP-1 巨噬细胞的体外研究结果表明，在感染 IAV PR8 株或季节性 H3N2 株后，GSDMD 的耗竭会导致促炎细胞因子的分泌减少。中性粒细胞的抗菌反应也依赖于 GSDMD，但据报道，GSDMD 孔主要形成于中性粒细胞的颗粒膜和自噬膜上，而不是质膜上 。这使得中性粒细胞弹性蛋白酶逃逸到细胞质中，从而催化 GSDMD 的非规范裂解，并通过自噬依赖机制进一步促进 IL- 的释放 。GSDMD 在中性粒细胞中的这种独特的前馈功能可能也与它在细菌挑战过程中对 NETosis 起关键作用有关 。我们的实验还表明，在 IAV 感染期间，GSDMD 可促进中性粒细胞的功能。虽然 GSDMD 的消减可能会抑制 IAV 在巨噬细胞和中性粒细胞中诱导的炎症过程，但我们的中性粒细胞耗竭实验表明，中性粒细胞的活动在介导 IAV 感染中的过度炎症和组织损伤方面尤为重要。
IAV infection is among the most common causes of acute respiratory distress syndrome (ARDS) in adults . Development of ARDS is marked by bilateral edema and worsened oxygen delivery
IAV 感染是导致成人急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的最常见原因之一 。ARDS 的发展以双侧水肿和供氧恶化为特征 ，而导致这些标准的主要因素是未受控制的呼吸道感染。

嗜中性粒细胞是为控制复制病毒而激活的细胞免疫反应所引起的炎症。具体来说，中性粒细胞的浸润和数量与 ARDS 的严重程度相关。
中性粒细胞分泌组织破坏酶，如中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶，以及炎性细胞外捕获物，可加剧 ARDS 的进展 。同样，在 LPS 诱导的 ARDS 模型中，由 GSDMD 促进的 NETosis 最近被确认为疾病进展的驱动因素 。事实上，全身 Gsdmd 小鼠在细菌性败血症模型中显示出更强的存活能力，这种表型与炎症和 NET 形成的减少有关 。然而，在一项后续研究中，中性粒细胞特异性缺失 GSDMD 竟然导致致死率增加 。中性粒细胞通常对细菌感染的清除至关重要，而我们的数据显示，中性粒细胞的缺失并不影响肺部 IAV 滴度。因此，虽然中性粒细胞在两种类型的感染中都会扩大炎症，但中性粒细胞在细菌性疾病和病毒性疾病中的功能可能并不完全相似。未来使用中性粒细胞特异性 GSDMD 缺失技术进行的研究可能会提供更多关于该蛋白在 IAV 感染期间中性粒细胞反应中的作用的信息。

虽然 GSDMD 是炎症小体激活所启动的热蛋白沉积途径中的一种效应蛋白，但其他中间蛋白也可能对 IAV 感染的结果有所影响。事实上，Caspase-1/ 小鼠的急性病加重，对流感病毒的适应性免疫力下降 。在 IAV 感染过程中，肺部 GSDMD 的激活是否需要特定的 Caspases，仍有待研究。有趣的是，中性粒细胞弹性蛋白酶也被证明能够裂解和激活 GSDMD ，这可能解释了 Caspase-1/11 缺陷与 Gsdmd 在 IAV 感染中的不同结果。

小鼠肺部的 IL-1 和 IL-18 水平在感染后有所降低，但这些细胞因子的水平并不完全依赖于 GSDMD，尽管 GSDMD 在 IL-1 和 IL-18 释放中起着典型的作用 。这些结果表明，在 IAV 感染期间，这些细胞因子的释放存在部分冗余机制。事实上，这些结果与我们发表的研究结果一致，即在感染 SARS-CoV-2 后第 2 天，肺中 IL 的水平依赖于 GSDMD，但在感染后较晚的时间点，IL-1 的释放不依赖于 GSDMD 9。有趣的是，我们发现 GSDMD 的缺失对 SARS-CoV-2 疾病的严重程度没有显著影响 ，这凸显了 SARS-CoV-2 与 IAV 所激活的病理机制的有趣差异，值得进一步研究。此外，我们还发现 GSDMD 在 IAV 感染期间促进 IFN 的表达和产生，进一步表明这种效应蛋白除了释放典型炎性体相关分子外，还能增强促炎反应。 小鼠中包括 IFN 在内的几种促炎细胞因子通路的衰减对病毒复制没有明显影响。然而，IFNs 的病理和组织损伤效应会在其抗病毒效应达到峰值后继续累积，这一点已得到公认 。我们的数据表明，在 IAV 感染期间，GSDMD 的缺失会平衡炎症反应，使其向组织损伤较小的表型发展，同时维持足以对抗病毒复制的反应。事实上，在修改我们的手稿期间，发表了一份报告，其中独立生成的 Gsdmd 小鼠品系在受到高剂量 H3N2 IAV 的挑战时，与 WT 动物相比，可免受病毒诱导的致死，而对病毒载量的影响微乎其微 。据报道，GSDMD 对中性粒细胞招募到肺部有轻微影响 。未来的研究可能会发现 GSDMD 的更多细微作用，这取决于不同病毒株的致病性和剂量。

总之，我们发现 GSDMD 会在 IAV 感染期间促进炎症基因程序、组织损伤性中性粒细胞活动和肺部病理变化。重要的是，虽然 GSDMD 会加重病情，但它对感染后的恢复（包括肺功能的恢复）并无作用，因此它有望成为 IAV 感染期间宿主定向治疗的候选靶点。

 方法


我们的研究符合所有相关的伦理法规，并获得了俄亥俄州立大学机构生物安全委员会（IBC）和机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

 病毒库


流感病毒株 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8, 由西奈山伊坎医学院的 Thomas Moran 博士提供) 和 A/Victoria/361/2011 (H3N2, 由 BEI Resources, NR-44042 提供)在 10 天胚胎鸡卵 (Charles River Laboratories) 中繁殖，并按照之前的描述进行滴定 。在 MDCK 细胞中生长的 PR8 种群由 Ryan Langlois 博士（明尼苏达大学）友情提供。所有病毒均在 MDCK 细胞上滴定。

 小鼠研究


由 Russell Vance 博士（加州大学伯克利分校）生成的 C57BL/6J 背景的雄性和雌性 Gsdmd 小鼠 购自 Jackson Laboratories（品系 # 032663）。WT 对照 C57BL/6J 小鼠也购自杰克逊实验室（Strain # 000664）。拥有阻止红色荧光蛋白tdTomato转录的loxP-fanked终止密码子的雌性小鼠购自杰克逊实验室（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato) Hze/J，C57BL/6J背景，品系#007914）。所有小鼠在实验时均为 8-12 周龄。小鼠饲养在俄亥俄州立大学的生物医学研究塔饲养室，温度保持在华氏 68-76 度，光暗周期为 12:12，湿度在 之间。饲养小鼠的笼子（Allentown）采用高压灭菌独立通风笼。小鼠自由采食辐照天然饲料（Evnigo Teklad Diet 7912）。反渗透纯净水由自动架式供水系统提供。笼子包括 14 英寸的玉米棒垫料（Bed-oCobs，The Andersons）和棉质方形筑巢材料。根据俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会批准的方案，在异氟醚麻醉下对小鼠进行鼻内感染。小鼠感染剂量为 50 TCID50 PR8 或 250 TCID50 PR8-Cre。使用较高剂量的 PR8-Cre 是由于其相对于 PR8 的适度衰减。在中性粒细胞耗竭实验中，小鼠在感染后第 3 天腹腔注射 抗小鼠 Ly6G 抗体（InVivoMAb，BE0075-1）或 大鼠 IgG2a 同型对照、抗三硝基苯酚抗体（InVivoMAb，BE0089）。从感染后第 4 天到第 8 天，小鼠腹腔注射 相同的抗体。增强停顿（PenH）值通过全身肺部胸透（Buxco 小型动物全身胸透）测定。小鼠在感染前 3 天适应胸透室 天。感染后第 天，将小鼠放入胸透室进行 适应，然后读取 。在 记录期间，每隔 测量一次 PenH 值，将 间隔期间的 PenH 值取平均值，并表示为当天的 PenH 绝对值。为了确定肺滴度和细胞因子水平，在对 MDCK 细胞进行滴度或通过 ELISA 进行分析之前，收集组织并在 的 PBS 中进行匀浆、速冻并保存在 。TCID50 值采用 ReedMuench 法计算。体重减轻超过 是小鼠实验中人道终点安乐死的主要标准。 所有实验均由俄亥俄州立大学 IACUC 批准，协议编号为 2016A00000051-R2。该方案遵循美国国立卫生研究院（NIH）通过的《实验动物护理和使用指南》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）所规定的准则。


细胞培养和感染


所有细胞均在 加湿培养箱中培养， 。载体对照和 GSDMD KD THP-1 细胞由慢病毒 shRNA 介导靶向生成，由俄亥俄州立大学 Amal Amer 博士慷慨提供。细胞保存在 RPMI 1640 培养基（Fisher Scientific）中，并补充 EquaFETAL 牛血清（Atlas Biologicals）。 phorbol myristate acetate (PMA)处理 3 天，使 THP-1 分化为巨噬细胞，如前所述 。用 PR8 或 H3N2 病毒感染 THP-1 细胞，MOI 为 10， ，然后收集细胞进行 Western 印迹分析或收集细胞介质测量细胞因子和 LDH 释放量。MDCK细胞（BEI Resources, NR-2628）在DMEM（Fisher Scientific公司）中培养，并添加 EquaFETAL牛血清。


体外骨髓中性粒细胞研究


根据 EasySep 中性粒细胞富集试剂盒推荐的方案（STEMCELL Technologies, 19762），从 WT 或 Gsdmd 小鼠骨髓中阴性筛选中性粒细胞。中性粒细胞富集通过流式细胞仪进行确认。中性粒细胞NETosis的量化方法是将富集的中性粒细胞按30,000个细胞/孔的比例接种到96孔板中，并加入RPMI 1640培养基（Fisher Scientific公司），同时添加 ethidium homodimer-1（Invitrogen公司，L3224B）。立即用 MOI 10 的 PR8 感染这些细胞， ，其间每十分钟用 SpectraMax i3X 多模式微孔板阅读器（Molecular Devices）测量一次荧光强度（激发/发射最大值 528/617）。不含乙二胺同二聚体-1 的相同平板感染 ，以测量细胞上清液中的中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶。

 Western 印迹


为检测肺组织中的蛋白质表达，样本在 SDS 缓冲液 SDS、 三乙醇胺 中裂解，该缓冲液含有磷酸酶蛋白酶抑制剂（Sigma，4906845001）和蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific，A32965）的鸡尾酒。裂解液在 离心 ，可溶性蛋白上清液用于 Western 印迹分析。等量的蛋白质 通过 SDS-PAGE 分离并转移到膜上。用 Tween-20 磷酸盐缓冲盐水（PBST）中的 脱脂牛奶对薄膜进行阻断，并用抗 GSDMD（1:1000，Abcam #ab219800；克隆 EPR20859）和肌动蛋白（1:1000，Abcam #ab3280；克隆 ACTNO5 (C4)）的抗体以及 HRP 结合的抗兔 IgG 二抗（1:10000，Cell Signaling Technologies (CST) #7074）进行探针检测。在对 THP-1 细胞进行 Western 印迹时，用 RIPA 缓冲液（ ; 1% IGEPAL CA-630; 0.5% sodium deoxycholate; SDS; Tris 8.0）收获细胞裂解液，并辅以 Benzonase 核酸酶和 HALT 蛋白酶及磷酸酶抑制剂。等量蛋白质 ( ) 经 SDS-PAGE 分析后转移到 PVDF 膜（BioRad）上。用 牛奶与 Tween 20 三缓冲生理盐水（TBST）稀释后阻断膜。用在 TBST 中以 5% BSA 稀释的抗体孵育一抗过夜，然后用在 TBST 中以 5% 牛奶稀释的物种特异性 HRP 结合物二抗孵育。使用了以下抗体裂解 PARP（Asp214）XP 兔 mAb（1:1000，CST #5625 S；克隆 D64E10）、单克隆抗流感 NP A/CA/04/09（H1N1）pdm（1:1000，BEI Resources #NR-19868；克隆 2F4）、GAPDH 兔 mAb（1:1000，CST #2118 L；克隆 14C10）、裂解 GSDMD（Asp275）兔 mAb（1：1000，CST #36425S；克隆 E7H9G），人 GSDMD（1:1000，Abcam #ab210070；克隆 EPR19829），过氧化物酶亲和纯驴抗鼠 IgG ( ) （1:10,000，Jackson ImmunoResearch #715-035-150），过氧化物酶亲和纯驴抗兔 IgG（H+L）（1:10,000，Jackson ImmunoResearch #711-035-152）。使用 ChemiDoc Touch (BioRad) 采集化学发光图像。


RNA 提取和基因表达定量


用 TRIzol 试剂匀浆小鼠肺组织。用 1 -溴-3-氯丙烷分离后，收集水相，用乙醇沉淀 RNA。使用 iScript cDNA Synthesis Kit（BioRad，#1708890）按照生产商的方案生成 cDNA。使用 iTaq Universal SYBR Green 试剂（BioRad）在 CFX384（BioRad）仪器上以 Chmp2a 作为参考基因进行 mRNA 定量。本研究使用的引物购自 Integrated DNA Technologies，列于补充数据 3。

 酶联免疫吸附试验


人 IL-1 、IL-6、TNF 和 IFN 以及小鼠 CCL1、TNF、IL-18、IFN 、IL 、IL-6、中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶 ELISA 是使用相应的 R&D Systems Duoset ELISA 试剂盒（目录号 # DY201、DY206、DY814-05、DY845、DY410、DY7625-05、DY8234-05、DY401、DY406、DY4517-05 和 DY3667）。

 流式细胞仪


用含有 Dnase I（Sigma Aldrich）和 IV 型胶原酶（Worthington Biochemical Corporation）的 GentleMACS C 管（Miltenyi）对模拟或感染的小鼠肺进行匀浆。使用 GentleMACS 设备将肺处理成单细胞悬浮液。用 CellBlox（Invitrogen 公司）对单细胞匀浆进行阻断，并按照生产商的说明使用 eFluor 780 固定活力染料（Invitrogen 公司，65-0865-14）进行活力染色。细胞洗净后用 Invitrogen 公司的 Ly6G（1:333，克隆 1A8-Ly6g，参考号 46-9668）、CD11b（1:333.克隆 M1/70，参考号 64-0112）、CD103（1:333，克隆 2E7，参考号 63-1031）、CD45R（1:333，克隆 RA3-6B2，参考号 12-0452）、MHCII（1:500，克隆 M5/114.15.2，参考号 78-5321）、CD8a（1:333，克隆 53-6.7，参考号 58-0081）、CD4（1:333，克隆 GK1.5，参考号 M001T02R02）、CD3e（1:333，克隆 17A2，参考号 367-0032-82）、CD69（1:333，克隆 H1.2F3，参考号 25-0691-82）、CD19（1:333，克隆 eBio1D3 (1D3)，参考号 670193-82）、NK1.1（1:200，克隆 PK136，参考号 61-5941-82）和 Ly6C（1:200，克隆 HK1.4，参考号 48-5932-82）和 BioLegend 抗体（CD45.2，1:333，克隆 104，参考号 109838）、CD11c（1:333，克隆 N418，参考号 117320）和 Siglec F（1:100，克隆 S17007L，参考号 155524）冰浴 30 分钟。用 BD FACS 裂解缓冲液固定细胞 ， ，重悬于 PBS，并在 Cytek Aurora 仪器上运行。在每个样本中加入计数珠（Invitrogen）以量化细胞总数。样本使用 FlowJo 软件（10.8.1）进行分析。

 组织学


肺组织样本在 中性缓冲福尔马林中固定， ， ，然后转移到 乙醇中。用石蜡包埋、切片、染色（H&E 和抗 CD45 染色），并用 Histowiz ( Histowiz.com, Brooklyn, NY, USA)成像。使用 ImageJ 软件和颜色去卷积法 对结果图像进行无偏电子量化。


RNA 测序和功能基因富集分析


使用 TRIzol（Invitrogen 公司）从肺组织中提取 RNA。RNA 文库制备和测序由 GENEWIZ 公司（GENEWIZ LLC./Azenta US, Inc South Plainfield, NJ, USA）进行，GENEWIZ 公司提供的方法如下："使用 Qubit 2.0 Fluorometer（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）对收到的 RNA 样品进行定量，并使用 TapeStation（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）检查 RNA 的完整性。使用用于 Illumina 的 NEBNext Ultra II RNA 文库制备试剂盒（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA, #E7770S），按照生产商的说明制备 RNA 测序文库。简而言之，首先富集 mRNA

用 Oligod(T) 磁珠进行检测。对富集的 mRNA 进行片段化处理。
。cDNA 片段经末端修复和 3'end 腺苷酸化，通用适配体与 cDNA 片段连接，然后添加索引，并通过有限循环的 PCR 进行文库富集。测序文库在 Agilent TapeStation（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）上进行验证，并通过 Qubit 2.0 荧光仪（ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）和定量 PCR（KAPA Biosystems，Wilmington，MA，USA）进行定量。测序文库被复用并聚类到流式细胞上。聚类后，按照制造商的说明将流式细胞装载到 Illumina HiSeq 仪器上。使用 2x150bp 配对端（PE）配置对样本进行测序。图像分析和碱基调用由 HiSeq 控制软件（HCS）进行。从 Illumina HiSeq 生成的原始序列数据（.bcl 文件）被转换成 fastq 文件，并使用 Illumina bcl2fastq 2.17 软件进行去多路复用。索引序列识别允许有一个错误匹配"。原始 fastq 文件由 ROSALIND 公司（ROSALIND, Inc. San Diego, CA, https://rosalind.bio/）开发的 HyperScale 架构进行处理、比对和量化。作为质量控制步骤的一部分，还生成了读数分布百分比、小提琴图、特征热图和样本 MDS 图。使用 ROSALIND 对差异基因表达进行统计分析。具体来说，使用 DESeq2 文库 通过相对对数表达对样本计数进行归一化。DEseq2 还用于计算折叠变化和 - 值。主成分分析、火山图和热图使用 ROSALIND 提供的数值格式化为 。基因本体分析使用 topGO R 软件包进行，以确定 GO 术语之间的局部相似性和依赖性，从而进行 Elim 剪枝校正。基因组富集分析（GSEA）采用已发表的方法进行。基因列表按表达量排序，并输入 GSEA 软件，使用 GO 生物过程数据库 进行分析。网络分析使用 Cytoscape 进行。其他分析使用 REACTOME 数据库 、PanglaoDB 、KEGG 数据库 和 Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen) 进行。部分功能富集分析使用 Enrichr 进行。

 报告摘要


有关研究设计的更多信息，请参阅本文链接的《自然组合报告摘要》。

 数据可用性


RNA 测序原始数据以及处理后的基因表达矩阵（原始和归一化计数）已存入 NCBI GEO 数据库，登录代码为 GSE230656。图和补充图中 Western 印迹和图表的原始数据在源数据文件中提供。本文随附原始数据。

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 致谢


Yount 实验室的研究工作得到了美国国立卫生研究院 Al130110、Al151230、HL154001、HL157215 号基金以及美国肺脏协会 COVID-19 和新兴呼吸道病毒研究奖的支持。AZ获得了国家自然科学基金-GRFP研究基金的资助。ADK 和 PJD 得到了机构 T32 博士后奖学金（美国国立卫生研究院培训基金 Al165391）的支持。Forero 实验室的研究得到了美国国立卫生研究院 R35 GM150806 基金的支持。我们感谢 Ryan Langlois 博士（明尼苏达大学）提供 PR8-Cre 种群。

 作者供稿


概念化：数据整理：A.O.A.、C.C.、J.M.和 J.S.Y.：形式分析：S.S.、M.I.M.、A.Z：调查：S.S.、M.I.M.、A.Z.、A.S.、A.D.K.、R.R.、E.A.H.、A.F.和 J.S.Y.：S.S., M.I.M., A.Z., A.S., S.L., J.E.R., A.D.K., H.B., L.Z., P.J.D., A.C.E. and E.A.H. Visualization：S.S., M.I.M., A.Z., A.S., A.D.K., A.F. and J.S.Y. Writing - Original Draft：S.S., M.I.M., A.Z., A.D.K., J.M., A.F. 和 J.S.Y. 监督：项目管理：J.S.Y：资金获取：J.S.Y：资源：资源：A.O.A.、C.C.和 J.M.

 竞争利益


作者声明不存在利益冲突。

 其他信息

Supplementary information The online version contains supplementary material available at https://doi.org/10.1038/s41467-024-47067-0 .
Correspondence and requests for materials should be addressed to Adriana Forero or Jacob S. Yount.

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(c) 作者 2024 年

  1. 美国俄亥俄州哥伦布市俄亥俄州立大学微生物感染与免疫系。 美国俄亥俄州哥伦布市俄亥俄州立大学传染病研究所。 美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学外科科学部。 这些作者的贡献相同：Samuel Speaks、Matthew I. McFadden、Ashley Zani。 电子邮件：Adriana.Forero@osumc.edu; Jacob.Yount@osumc.edu