Elsevier

水研究

第 279 卷 , 2025 年 7 月 1 日, 123472
Water Research

好氧颗粒物在微/纳米塑料压力下的反硝化功能受损：来自种间相互作用和电子转移过程的启示

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https://doi.org/10.1016/j.watres.2025.123472 获取权限和内容
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亮点

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    通过微生物社会行为揭示了 MPs/NPs 对 AGS 反硝化功能的损害。
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    QS 信号分子之间的相互作用因 20 mg/L MPs/NPs 而减弱。
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    QS 功能恶化导致通过交叉喂养的权衡调节减弱。
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    代谢物（如氨基酸和辅因子）的交叉喂养被 MPs/NPs 抑制。
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    代谢物缺乏导致反硝化电子传递活性降低。

摘要

废水中微/纳米塑料的积累显著阻碍了生物废水处理系统中的反硝化作用，但其内在机制尚未完全明了。在此，我们结合信号分子监测、电化学表征和多组学分析，研究了群体感应（QS）介导的微生物相互作用如何影响好氧颗粒污泥系统中的反硝化作用。结果表明，在微/纳米塑料暴露 90 天后，多种信号分子之间的相互作用显著下降，从而破坏了 QS 系统，无法适时感知外部环境的变化。由于 QS 受损，只有 5 个物种的编码氨基酸和辅助因子的基因上调，以维持交叉喂养，而其他物种作为“骗子”，依赖交叉喂养提供的代谢物，但不进行回报。这种不平衡导致代谢物供应不足，包括核黄素等氧化还原活性代谢物，进而恶化了反硝化电子转移过程。 与对照组相比，细胞外电子传递能力和反硝化电子传递链活性分别降低了 88.08%和 63.33%（微塑料暴露）以及 79.64%和 63.75%（纳米塑料暴露），这直接导致了氮去除能力的下降。总体而言，本研究从群体感应介导的微生物社会行为角度，为微/纳米塑料胁迫下复杂微生物群落中的反硝化过程提供了更深入的见解。

关键词

好氧颗粒污泥
氮去除
微/纳米塑料
群体感应
交叉喂养
多组学分析

1. 引言

废水中存在的微/纳米塑料因其对污水处理厂生物处理系统的潜在威胁而日益引起关注（ 黄等人，2023； 郑等人，2024）。作为一种有前景的替代传统活性污泥的方法（ 郭等人，2022），好氧颗粒污泥（AGS）系统由于其高污泥浓度和胞外聚合物（EPS）含量，在从废水中去除微/纳米塑料方面显示出巨大潜力（ 奥伯伊等人，2019）。然而，在这个过程中，大量微/纳米塑料被包裹并积累在 AGS 颗粒中，导致总氮（TN）去除能力显著抑制，尤其是反硝化过程（ 黄等人，2023）。 尽管先前研究将反硝化受损归因于微/纳米塑料引起的细胞毒性（ 张等人，2023），但 AGS 如何调控多种物种的行为以抵抗微/纳米塑料的胁迫是一个有趣的问题，目前仍处于边缘领域。
在微生物生态系统中，细菌通过信号分子介导的群体感应（QS）系统进行相互通信，这有助于根据环境条件及时调节集体行为（Pan 等人，2023）。因此，多种信号分子共存并协同调控复杂共生物种中的微生物行为，包括酰基高丝氨酸内酯（AHLs）、可扩散信号因子（DSF）和双（3′-5′）环二聚鸟苷酸单磷酸（c-di-GMP）。这种共存形成了复杂的信号转导网络，并提供了群体感应交叉 talk 的可能性，其中不同的信号通路在并行电路、竞争电路或顺序电路中相互影响（Waters 和 Bassler，2005）。已有文献记载，交叉 talk 可以作为信号放大器，使群体感应系统能够适时感知外部环境的变化（Pan 等人，2023；Wu 等人，2022b）。 在感知外部信号信息后，微生物群落通过调整下游基因表达来协调微生物代谢过程，例如 EPS 的产生、毒力因子的分泌以及生物膜形成的诱导（Moreno-Gámez et al., 2023; Papenfort et al., 2016; You et al., 2023）。然而，在长期不利的环境条件下，由 QS 系统调节的代谢过程会受损，导致反应器性能恶化。例如，在 60 天的 Zn(Ⅱ)暴露下，在部分硝化、anammox 和反硝化系统中，多种 AHLs 的浓度下降，进而减少了代谢产物（如黄素）的合成，并扰乱了氮去除性能（Liu et al., 2022）。然而，QS 系统如何通过感知、分析和处理信号信息来驱动微生物通信，以在微/纳米塑料压力下介导 AGS 系统中的社会行为，目前尚不清楚。
除了调节代谢产物的产生外，群体感应（QS）还发现能够通过资源分配来调节微生物之间的交换，即交叉喂养（公共物品的交换）Dandekar 等人，2012。这是通过激活下游转录调控因子的表达来实现的，以调节酶的分泌（例如消化酶）、协调微生物之间的代谢互补性，以及介导代谢物的利用效率 Guo 等人，2021；Ma 等人，2024。作为这里面的互惠行为，交叉喂养塑造了微生物群落的结构，并由群体感应调节，以在不利条件下稳定群落结构 Papenfort 等人，2016；Peng 等人，2024。 例如，厌氧氨氧化菌共培养群通过 QS 调控改变微生物代谢物偏好和互养策略来抵抗抗生素胁迫（Huang et al., 2023）。重要的是，一项先前研究表明，参与互养的许多交换代谢物具有氧化还原特性，这对电子转移至关重要（Glasser et al., 2017）。例如，Paracoccus denitrificans 和 Shewanella oneidensis 之间的硫胺素和铁硫素的互养促进了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的产生和电子转移（Zhao et al., 2023）。反硝化过程，定义为通过电子转移还原硝酸盐，由两条主要途径驱动，即反硝化电子转移链和胞外电子转移，这两者均由丰富的氧化还原物质介导（Kuypers et al., 2018）。 据此，我们假设受损的 QS 介导的跨营养作用可能是导致电子转移过程受阻并最终在微/纳米塑料压力下使 AGS 反硝化作用恶化的关键因素。
为验证这一假设，我们建立了三个好氧颗粒污泥（AGS）反应器，通过探索 QS 介导的微生物社会行为（例如通过交叉营养的权衡）与电子转移过程之间的内部联系，来研究微/纳米塑料如何抑制反硝化过程。本研究的目的是：i) 通过监测不同类型信号分子的浓度，评估 QS 对微/纳米塑料胁迫的响应性；ii) 通过多组学分析，确定 QS 如何调控微生物间的交叉营养；iii) 通过电化学实验，阐明参与交叉营养的微生物代谢物在反硝化电子转移过程中的作用；以及 iv) 提出微/纳米塑料通过破坏 QS 介导的交叉营养来抑制反硝化的机制。这些结果为 QS 介导的种间相互作用在生物反硝化过程中的作用提供了更深入的见解，并从社会微生物学的角度为理解微生物在不良环境下的行为奠定了基础。

2. 材料与方法

2.1. 微/纳米塑料和合成废水的制备

聚苯乙烯微塑料（MPs）（平均直径 50 μm）和纳米塑料（NPs）（平均直径 100 nm）购自广东的苏苏化工产业。这些颗粒的扫描电子显微镜（SEM）图像和性质表征在图 S1、表 S1 和文本 S1 中提供。先前研究表明，家庭污水中 MPs 的环境浓度范围为 0.1 至 5.6 mg/L（Hanachi 等人，2022；Simon 等人，2018）。考虑到其使用量和年产量不断增加，聚苯乙烯微/纳米塑料将逐渐释放到污水处理系统中。因此，在本研究中选择了 20 mg/L 的 MPs 和 NPs 浓度。这些颗粒分散在合成家庭污水中（Zhang 等人，2023），其详细成分在文本 S2 中显示。

2.2. 反应器设置和运行

本研究建立了三个高 70 厘米、直径 10 厘米、工作体积 5.5 升的圆柱形序批式反应器（SBR）。对照组反应器（指定为 R1）未暴露于微塑料（MPs）或纳米塑料（NPs），而另外两个反应器分别添加了 20 mg/L 的 MPs（指定为 R2）或 20 mg/L 的 NPs（指定为 R3）。接种物为从实验室规模 SBR（高 90 厘米、直径 14 厘米、工作体积 13.8 升）中获得的成熟 AGS，该 SBR 使用与上述相同的合成废水进行培养，未添加微/纳米塑料。AGS 的平均粒径为 942 μm（图 S2），5 分钟污泥体积指数（SVI5）为 56 mL/g。每个反应器以 4 小时为周期运行，包括 10 分钟进水、50 分钟不曝气、175 分钟曝气、3 分钟沉淀和 2 分钟排放。所有反应器连续运行 90 天，pH 值和温度分别控制在 6.5–7.5 和 22 ± 2 °C。

2.3. 原生组学和原转录组学分析

从三个反应器中采集了 90 天的污泥样品（10 mL）用于宏基因组学和宏转录组学分析。使用 E.Z.N.A.® 土壤 DNA 试剂盒（Omega Biotek，美国诺克斯）提取 DNA，用于宏基因组测序。进行了质量控制、组装和分箱，以获取宏基因组组装基因组（MAGs）（文本 S3）（Dou 等人，2023）。用于下游分析的 MAGs 完整度%>50%，污染度%<10%。使用DIAMOND将代谢功能注释到同源群数据库（COG）和京都基因与基因组百科全书通路数据库（KEGG）。
使用 E.Z.N.A.® 土壤 RNA Midi Kit (Omega Biotek, 美国诺克斯) 提取 RNA，用于宏转录组测序。经过纯化、重建和测序后获得干净读数 (Zhang et al., 2024)。详细步骤见文本 S4。每个样本的干净读数被映射到通过 BBmap 组装到草稿基因组中的所有连续序列。通过将草稿基因组中的每千碱基百万片段数 (FPKM) 中位数进行相对化来计算相对基因表达 (He et al., 2024)。使用 Fisher 精确检验确定反应器之间基因表达差异的显著性 (Xu et al., 2023)。原始宏基因组和宏转录组数据集已存档于 NCBI 序列读取存档数据库，BioProject 登录号为 PRJNA1162048。

2.4. 其他分析方法

反应器的流出液被收集用于分析 NH4+-N、NO2--N、NO3--N、PO43--P 和化学需氧量（COD）浓度，以及混合液悬浮固体（MLSS）浓度，采用标准方法（Zhang et al., 2023）。使用 SEM（GeminiSEM 300, ZEISS, Germany）观察微/纳米塑料的表面形貌。EPS 的提取方案、成分测定和电化学表征在文本 S5 中展示。信号分子（AHLs、c-di-GMP 和 DSF）的提取和分析在文本 S6 中详细说明。与氮代谢过程相关的微生物活性分析遵循先前研究中描述的程序，并进行了一些修改（文本 S7）（Qin et al., 2020）。zeta 电位、ROS 含量、ATP 酶活性和傅里叶变换红外光谱（FTIR）光谱的分析遵循 Huang et al. (2024)。 用于测定 NADH 和细胞色素 c (Cyt c) 含量、反硝化酶活性和电子传递系统活性的其他分析方法在 S8 文中介绍。此外，根据 S9 文中提供的详细方案，进行了分批测定以验证代谢物在电子传递过程中的潜在作用。

2.5. 统计分析

本研究中所有数据均为三次平行试验的平均值，误差线表示标准差 (n = 3)。统计分析使用 SPSS 26.0 软件进行单因素方差分析，p < 0.05 被认为具有统计学意义。基于不同信号分子之间的相关性，使用 Gephi 版本 0.9.1 (Bastian 等人，2009) 对网络进行了可视化。

3. 结果

3.1. 微观/纳米塑料压力下反应器的性能和微生物活性

基于 NH4+-N、NO2--N 和 NO3--N 的出流浓度变化，整个实验期间被分为三个阶段（ 图 1 和图 S3）。第一阶段包括前 15 天，所有反应器均表现出优异的氮去除性能，平均 TN 去除效率达到 80.85%。第二阶段从第 16 天到第 60 天，期间各反应器的 NO3--N 浓度存在差异（p < 0.05），但 NH4+-N 和 NO2--N 浓度无显著差异。第三阶段发生在第 61 天到第 90 天，R2 和 R3 中 NO3--N 过度积累，导致 TN 去除效率分别下降至 69.47%和 54.01%。 这些发现表明，微/纳米塑料的长期存在通过抑制 AGS 系统中的反硝化作用，恶化了氮的转化，正如 Huang 等人（2023）所报道的 [19]。这种抑制作用在 R3 中更为明显，这可能是由于 NPs（纳米颗粒）诱导了更大的 ROS（活性氧）产生（图 S4 和文本 S10），与 MPs（微塑料）相比，由于它们更小的尺寸、更大的表面积和更高的流动性，导致 AGS 微生物中更严重的细胞损伤 [22]。在整个实验过程中，三个反应器中 COD 和 PO43--P 的平均去除效率分别保持在 93.65%和 61.33%，没有显著差异（p > 0.05）（图 S3）。这表明，接触微/纳米塑料对碳和磷的去除影响很小，与先前的研究结果一致 [29]。
Fig 1
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图 1. 在微/纳米塑料胁迫下 AGS 系统中的氮去除效率（a）和微生物活性（b）随时间的变化。星号（*）表示显著差异：*，p < 0.05；**，p < 0.01。（SAOR：比氨氧化速率；SNOR：比亚硝酸盐氧化速率；SNIRR：比亚硝酸盐还原速率；SNRR：比硝酸盐还原速率）。

与氮代谢过程相关的微生物活性分析表明，在微/纳米塑料胁迫下，R2 和 R3 中的氨氧化速率在阶段Ⅲ时显著受到抑制（p < 0.05），这导致了 NH4+-N 去除效率的波动（ 图 1b）。与 R1 相比，R2 和 R3 在阶段Ⅰ时的亚硝酸盐氧化速率分别增加了 33.58%和 49.39%，随后在阶段Ⅱ-Ⅲ期间下降。值得注意的是，微/纳米塑料在整个实验过程中始终对亚硝酸盐还原速率和硝酸盐还原速率产生抑制作用，尤其对硝酸盐还原速率影响显著，在阶段Ⅲ结束时，R2 和 R3 的硝酸盐还原速率分别下降了 20.13%和 45.65%（p < 0.05）。这表明微/纳米塑料对反硝化细菌的活性产生了明显的不良影响（ 郑等，2016），特别是破坏了亚硝酸盐还原过程。

3.2. 微/纳米塑料胁迫下信号分子的时变规律

测定了三种信号分子（AHLs、c-di-GMP 和 DSF）的浓度，以评估群体感应（QS）对微/纳米塑料胁迫的时间响应。在阶段Ⅰ中，与 R1 相比，R2 中 C4-HSL、3OC6-HSL、C8-HSL 和 C10-HSL 的含量分别增加了 2.23、1.06、1.29 和 1.04 倍，R3 中分别增加了 3.96、1.20、1.58 和 1.04 倍（ 图 2 a）。同时，c-di-GMP 含量显著增加了 2.35 倍（R2）和 2.18 倍（R3），而 DSF 含量显著下降了 18.02%（R2）和 50.00%（R3）（ 图 2 b）。c-di-GMP 和 DSF 之间的这种负相关关系主要归因于 Clp 调节器通过降解 c-di-GMP，而 DSF 传感器含有 GGDEF 结构域对其进行调节（Hengge, 2009; Pan 等人, 2023）。 然而，由于在 AGS 颗粒中长期累积的微/纳米塑料（阶段Ⅱ-Ⅲ），在三个反应器中观察到信号分子浓度的显著变化，其中 R3 表现出所有研究信号分子的最低水平。在阶段Ⅲ中，与 R1 相比，R3 中 AHLs、c-di-GMP 和 DSF 的浓度分别下降了 60.71%、32.92%和 26.67%；与 R2 相比，分别下降了 72.52%、59.52%和 53.33%（ 图 2 a 和 b）。因此，在长期暴露于 MPs 和特别是 NPs 后，信号分子介导的 QS 系统在 AGS 系统中被减弱。
Fig 2
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图 2。三种阶段的 AHLs (a)、c-di-GMP 和 DSF (b) 浓度。(c) 选择了显著 (p < 0.05) 和强 (Spearman's R > 0.7) 的信号分子连接，并进行可视化。节点大小与连接数成正比，边框厚度表示相关程度。数字 (d) 和表达 (e) 为编码信号通路的 MAGs 基因的表达。显著差异表示如下：●，p < 0.05；●●，p <0.01；●●●，p <0.001。

多种信号分子共存于微生物群落中，引发了 QS“串扰”这种细胞间通讯的可能性（Wu et al., 2022a）。尽管微/纳米塑料压力导致信号分子浓度出现时间波动，但仍观察到密切相关性（ 图 2c）。在三个反应器中，短链 AHLs 与长链 AHLs 之间存在显著相关性，其中 3OC6-HSL 与 C10-HSL 之间的相关系数最强（p < 0.05）。此外，不同类型的信号分子之间也显示出强相关性。DSF 与 AHLs（包括 3OC10-HSL、C4-HSL、C10-HSL 和 3OC6-HSL）表现出密切相关性。类似地，DSF 与 c-di-GMP 之间也显示出强相关性（p < 0.05）。这些结果表明微生物群落内部存在串扰（Wu et al., 2022b）。 然而，信号分子之间的 Spearman's R 相关系数在 R2 和 R3 中降低（图 S5）。例如，与 R1（Spearman's R = -0.9, p < 0.05）相比，R2 中 C4-HSL 和 3OC6-HSL 之间的相关性较弱（Spearman's R = -0.6），而在 R3 中也观察到类似的趋势（Spearman's R = -0.3）。在 3OC10-HSL 和 DSF 之间的相关性中也观察到类似的模式，Spearman's R 相关系数在 R1 中为-0.9（p < 0.05），在 R2 中为-0.7，在 R3 中为-0.5。这些结果表明，在微/纳米塑料压力下，微生物群落内的跨 talk 减弱，响应性降低。

3.3. 具有高 QS 横向交流的遗传潜力

为了验证 QS 交叉对话是否通过调节信号分子的分泌来响应微/纳米塑料压力，我们首先搜索了包含细菌通讯基因的初步 MAGs。在所有反应器中，我们确定了 15 个高质量 MAGs（完整度>70%且污染度<10%），并列于表 S2 中。这些 MAGs 属于门酸杆菌门 （ACI）、 拟杆菌门 （BCD）、 微菌门 （BDE）、 假单胞菌门 （PSE）和疣微菌门 （VER）。它们构成了 AGS 系统的优势微生物群落，其总相对丰度范围为 59.65%至 72.37%（图 S6）。
为了阐明微生物群落中现有的 QS 电路（包括 AHLs-QS、c-di-GMP-QS 和 DSF-QS），我们研究了 MAGs（ 图 2d）中编码信号分子合成酶和传感器的基因。AHLs 合成酶（HdtS）在所有 MAGs 中均有鉴定，基因拷贝数为 1-5 个，而 AHLs 传感器（LuxR）在大多数 MAGs 中存在。这些发现表明，微生物群落具有通过 AHLs 介导的种内通讯的高遗传潜力。此外，c-di-GMP 合成酶（DGC）在 9 个 MAGs 中被鉴定，而 c-di-GMP 传感器（Clp）在所有 MAGs 中存在，基因拷贝数丰富（高达 9 个）。可以合理推断，尽管所有 MAGs 缺乏分泌 c-di-GMP 的能力，但它们能够感知 c-di-GMP 并操纵 Clp 来调控下游基因。相比之下，尽管 DSF 合成酶（RpfB 和 RpfF）在所有 MAGs 中被发现，基因拷贝数最多（高达 12 个），但 DSF 传感器（RpfC 和 RpfG）仅在 5 个 MAGs（PSE4-7 和 PSE10）中被发现。 这表明具有 DSF-QS 回路的 MAGs 能够通过感知 DSF 来准确估计环境信息，因为所有 MAGs 都可以通过分泌 DSF 来传输信息（Moreno-Gámez 等人，2023）。此外，尽管大多数 MAGs 具有多个 QS 回路，但只有 PSE6 和 PSE7 具有完整的 QS 回路（包括 AHLs、c-di-GMP 和 DSF 的合成酶和传感器）。
宏转录组分析表明，在长期暴露于微/纳米塑料后，编码 QS 电路的基因在不同 MAGs 中的表达水平差异很大（ 图 2e）。对于大多数缺乏完整 QS 电路的 MAGs，R2 和 R3 中的基因表达水平低于 R1，在 PSE8 和 PSE9 中观察到显著的抑制效应（p < 0.05）。例如，缺乏 DSF 传感器的 PSE8 显示出所有 QS 相关基因的显著下调，表明其与其他 MAGs 的沟通能力因微/纳米塑料而严重受阻。相比之下，具有完整 QS 电路的 PSE6 和 PSE7 表现出显著上调的 QS 电路编码基因（p < 0.05），尽管它们不拥有最多的基因拷贝数。更具体地说，与 R1 相比，PSE7 在 R2 中显示出 AHLs 合成酶（1.04 倍）和 c-di-GMP 合成酶（2.97 倍）基因表达水平的上调，在 R3 中分别为 1.92 倍和 1.01 倍。PSE6 也观察到类似的趋势。 因此，缺乏完整 QS 电路的种类在微/纳米塑料压力下经历了显著的抑制，而拥有完整 QS 电路的种类则能够通过分泌和感知各种信号分子迅速做出反应。

3.4. QS 介导的跨营养交换策略的改变

QS 系统通过调控微生物相互作用（例如交叉营养）来适应不良环境（Hu 等人，2024），进而支撑了微生物群落中能量和物质的流动（LaSarre 等人，2017）。宏转录组分析表明，在微/纳米塑料胁迫下，大多数物种（例如 PSE8 和 PSE9）表现出代谢物合成途径的下调，而其他物种则表现出特定代谢物合成途径的上调，其中 R3 的区分尤为明显（图 S7 和图 S8）。有趣的是，这些上调的代谢途径并非完全重复，甚至在不同 MAGs 之间形成了互补关系。因此，不良环境条件增强了某些微生物之间的协作，尽管微/纳米塑料抑制了整体的代谢活动。
为了进一步研究长期微/纳米塑料暴露下 AGS 微生物代谢产物潜在的交叉供给现象，我们关注了 5 个在 R2 和 R3 中代谢物合成途径显著上调的 MAGs，与 R1 相比，这些 MAGs 包括：Ferruginibacter sp. (BCD1)、Ga0074137 sp. (BDE)、Hydrogenophaga sp. (PSE3)、Thauera sp. (PSE6)和 UBA2357 sp. (PSE7) ( 图 3)。除了上述 5 个 MAGs 外，其他 MAGs 由于参与多种代谢物合成途径的基因下调甚至删除，对交叉供给的贡献极小。
Fig 3
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图 3。在微/纳米塑料胁迫下 BCD1、BDE、PSE3、PSE6 和 PSE7 之间的交叉供给谱。橙色和粉色箭头分别表示 R2 和 R3 中途径的上调。星号(*)表示与 R1 存在显著差异（p < 0.05）。

氨基酸的交叉供给减轻了微生物的代谢负担，并促进了微生物群落内的协同作用（Mee 等人，2014）。在本研究中，PSE6 和 PSE7 在 MAGs 中表现出氨基酸生物合成途径相关基因的最高表达水平，这些途径具有高代谢成本（i.e., 色氨酸和酪氨酸），使它们能够向其他 MAGs 供应这些途径中基因下调的氨基酸（图 S7）。蛋白质降解为群落提供了替代的氨基酸来源（Lawson 等人，2017）。在混合微生物群落中，BDE 表现出最高的肽酶基因表达水平，拥有 7 个基因拷贝，表明其在蛋白质降解方面具有潜在的主导地位（图 S9）。反过来，一些 MAGs 利用这些氨基酸生产必需的辅因子，这些辅因子对微生物生长至关重要，但能量消耗很大（Romine 等人，2017）。 例如，PSE6 和 PSE7 为 BCD1 和 BDE 提供氨基酸，以协助合成烟酸（VB3）和硫胺素（VB1），这一点由参与 VB3 和 VB1 合成的基因上调所证实（图 S8）。PSE3 为微生物群落提供了多种 B 族维生素（如 VB2、VB6、VB7 和 VB9）以及钼辅因子（MOCO），而其他 MAGs 则未显示出这些代谢潜力。
如前所述，当受到长期微/纳米塑料压力时，大多数微生物停止参与互惠的交叉喂养过程。这种情况下的典型例子是 ACI。在 R2 和 R3 中，尽管存在相关基因，ACI 沉默了与核黄素（VB2）、VB3、吡哆醛（VB6）和维生素 B12（FPKM = 0）合成相关的基因，表明其无法为与其他 MAGs 进行权衡而生产公共产品。因此，它们倾向于依赖微生物群落单方向的养分供应，但不会进行回报。这种不平衡可能导致所有 MAGs 的代谢物供应不足，因为生产者仅占整个微生物群落的 25.68%（R2）和 28.05%（R3），与消费者相比数量严重不足。这造成了一个养分缺口，威胁到微生物群落的稳定性。此外，许多 MAGs 在编码辅因子合成的基因上表现出缺失，需要摄取外源性辅因子，特别是维生素 B12，该基因仅在 PSE1 中上调（R2 中上调 2.14 倍，R3 中上调 1.32 倍）（图 S8）。 尽管 QS 系统试图通过调整互养策略来缓解微/纳米塑料压力，以稳定群落，但生产者与消费者之间不平衡导致的代谢物需求差距仍然存在，并最终降低了代谢物的含量。关键在于，参与互养的芳香氨基酸和辅因子充当重要的电子穿梭体和供体（Glasser 等人，2017）。这些代谢物的缺乏会损害电子传递过程，最终导致反硝化性能的抑制。

3.5. 微/纳米塑料压力下的电子传递能力抑制

评估了 AGS 中细胞外电子转移（EET）和反硝化电子转移链（DETC）的能力（ 图 4， 图 5）。通过分析 EPS 的电活性来研究 EET 能力。循环伏安法（CV）曲线表明，AGS 系统中的 EET 过程主要由细胞色素 c 和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）介导，无论是否暴露于微/纳米塑料（ 图 4a 和文本 S11）。还进行了电化学阻抗分析（EIS）来研究 EPS 的电子转移性能（ 图 4b 和表 S3）。溶液电阻与 EET 能力呈负相关（Li 等人，2022），在阶段Ⅲ中 R2（1.25 倍）和 R3（1.26 倍）显著增加（p < 0.05）。chronoamperometry 测试证实 EET 发生在提取的 EPS 溶液和工作电极之间。 在添加 EPS 溶液后，观察到电流增加，达到峰值后逐渐恢复到基线电流水平（图 S11）。为了进一步量化 EPS 的 EET 能力，通过积分电流峰值响应（ 图 4c）来确定电子转移能力。与 R1 相比，R2 和 R3 的电子接受能力分别降低了 11.92%和 29.86%，在阶段Ⅲ期间差异显著（p < 0.01），与观察到的 EIS 结果一致（表 S3）。显然，微/纳米塑料的长期存在损害了 AGS 中 EPS 的导电性和电子接受能力，这可能是由于受受损 QS 系统调控的氧化还原活性组分减少所致。
Fig 4
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图 4。EPS 在三个阶段结束时的循环伏安法曲线（a）、电化学阻抗谱（b）和电子转移能力（c）的电化学特性。星号（*）表示显著差异：**，p < 0.01；***，p < 0.001。

Fig 5
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图 5。 (a) DETC 的示意图。(b) 每个 MAGs 中硝化酶编码基因的相对表达水平。(c) R1-R3 在三个阶段的 ETSA 变化。(d) 每个 MAGs 中细胞色素 c 和醌库编码基因的相对表达水平。星号(*)表示显著差异：*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001。

DETC 由复合物、反硝化酶、醌库和细胞色素 c ( 图 5a) 组成。在长期暴露于微/纳米塑料后，DETC 活性在 R2 和 R3 中分别显著下降了 36.67%和 36.75% (p < 0.01) ( 图 5c)，同时伴随着电子供体减少 ( 张等人，2022)，这从 NADH 含量的降低（图 S12a）中得到了证实。为了进一步阐明微/纳米塑料对不同物种反硝化能力抑制效应，我们在 MAGs 中鉴定了编码异养反硝化酶的基因 ( 图 52R）的所有基因下调，而 R3 显示出更明显的抑制。因此，在第三阶段，与 R1 相比，R2 和 R3 中硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的活性逐渐下降，尤其是亚硝酸还原酶，在 R3 中显著下降了 73.40%（p < 0.001）（图 S13）。此外，编码细胞色素 c 和醌库的基因，它们都是 DETC 的关键电子传输枢纽（He 等人，2024），在多个 MAGs 中下调（ 图 5d），导致从复合物到反硝化酶的电子传输受损。例如，PSE5 在 R2 和 R3 中显示出编码醌库的基因沉默（FPKM = 0），表明它们失去了促进电子传输到 NAR 的能力。 总的来说，虽然少数 MAGs 表现出促进反硝化过程的潜力，这体现在反硝化酶相关基因的上调，但大多数 MAGs 显示出与 DETC 组分相关的基因下调，这对直接电子转移过程是不利的。
为验证代谢产物在电子传递过程中的作用，在微/纳米塑料胁迫下进行了批次实验，外加辅酶 VB2 (Text S12)。VB2 的补充显著恢复了 ATP 酶活性，从而增强 ATP 合成和代谢活性 (Fig. S14a)。同样，VB2 提高了还原力 NADH 的水平 (Fig. S14b)，这促进了反硝化电子传递和能量产生 (Zhang et al., 2022)。进一步分析表明，VB2 增加了参与多种代谢物合成（如酪氨酸、VB6 和维生素 B12）的基因相对丰度，暗示微生物群落中整体代谢物库可能得到增强 (Fig. S14e 和 S14f)。因此，电子传递效率 (EET) 能力和脱氮电子传递链 (DETC) 活性均显著恢复 (Fig. S14c 和 S14d)。 这可能归因于缓解了 AGS 颗粒中“公共产品”的代谢压力，因为 VB2 作为核黄素 5′-单磷酸（FMN）和 FAD 的前体，而 FMN 和 FAD 是参与细胞氧化反应的关键酶所必需的辅酶（You 等人，2021）。这些发现提供了强有力的证据，表明参与跨营养互作的代谢产物在多种电子转移过程中发挥了关键作用。

4. 讨论

4.1. QS 交叉对话对微/纳米塑料压力的响应

微生物中存在细菌通讯基因通常能够实现多种信号分子的合成和检测，这为种内和种间通讯提供了优势（Aframian and Eldar, 2020）。通常，AHL 介导的群体感应（QS）调节种内通讯，因为 AHL 受体对其对应信号具有特异性（Papenfort and Bassler, 2016）。种间通讯主要由 c-di-GMP 介导（Pan et al., 2023），而 DSF 已被证明能够介导种间和种内通讯（Tang et al., 2018）。本研究中鉴定的所有微生物并非都表现出完整的三个群体感应（QS）通路，大多数 MAGs 显示出 AHL 介导的种内和/或 c-di-GMP 介导的种间通讯（ 图 2d），表明其相互作用能力有限。 只有 PSE6 和 PSE7 拥有全部三种 QS 电路，这得益于它们多样的信号传递方式，从而展现出更优越的细菌通讯能力。这种多样化是进化和自然选择的结果，使得多种途径、组分或受体能够作为备用机制，确保它们的通讯网络在各种环境中有效运行 (Jin et al., 2024).
微生物通过检测细胞外信号分子的浓度来感知周围环境，当信号分子的浓度达到阈值时，随后调节其社会行为（Bettenworth 等人，2022）。在此过程中，受体对其相应的信号具有高度特异性和敏感性，从而启动不同的耦合调控通路（Aframian 和 Eldar，2020）。然而，已有报道称在 Vibrio fischeri、Pseudomonas 和 anammox 共培养体系中存在该范式之外的例外（Pan 等人，2023）。在此，AGS 体系中也观察到了信号分子相关性，表明发生了 QS 跨话（ 图 2c）。鉴于 QS 跨话可以通过促进其分泌来减少不同信号分子达到其阈值浓度所需的时间，我们认为它在快速响应环境方面发挥了关键作用。 在微/纳米塑料压力下，通讯主要受具有完整 QS 回路的 MAGs 主导，特别是 PSE6 和 PSE7（ 图 2d）。大多数 MAGs 能够分泌 DSF，但缺乏感知能力，而 PSE6 和 PSE7 可以通过 RpfG 传感器检测外源性 DSF，进而触发 AHLs 和 c-di-GMP 向周围环境的分泌。这随后使整个微生物群落能够检测 AHLs 和 c-di-GMP，并调节下游基因表达。DSF 可能作为 QS 通讯中的中介分子，影响 AHLs 和 c-di-GMP 的分泌。有证据表明，DSF 传感器能够降解 c-di-GMP（ 徐等人，2022），而先前研究也表明 DSF 对 AHLs 分泌的潜在影响（ 丁等人，2016），这与我们的假设一致。然而，在长期暴露于微/纳米塑料下，QS 通讯被削弱，如信号分子之间明显下降的相关性所示（图 S5）。 这种干扰限制了具有完整 QS 电路的 MAGs 向他人传递环境信息的能力，从而抑制了与信号分子分泌和感知相关的基因表达，最终对后续的调控过程产生了不利影响。

4.2. QS 调节的跨营养交换策略以抵抗微/纳米塑料压力

尽管先前研究表明，QS 系统可以通过修饰代谢途径和共养策略帮助微生物群落应对不良环境（ 高 et al., 2023），但复杂共培养体系中的种间相互作用却鲜有研究。在此，基于多组学分析，我们提出 QS 介导的代谢共养对于 AGS 微生物适应环境变化至关重要。有趣的是，研究发现 R2 和 R3 中某些 MAGs 的共养作用增强，尤其是在氨基酸和辅因子的交换方面，这些物质可以通过被动扩散、主动运输和细胞间接触进行转移（D'Souza et al., 2018）。一些 MAGs（如 PSE6）由于 DSF 的调控作用，氨基酸生物合成编码基因的表达上调（ 郭 et al., 2021）。BDE 也通过降解蛋白质提供氨基酸（图 S9）。 这些氨基酸随后通过特定的转运蛋白转移到细胞外环境中，促进了与其他 MAGs 的交叉营养。作为回报，BCD1 和 PSE3 利用氨基酸在群体感应调控下合成 B 族维生素和 MOCO 来喂养其他 MAGs，这一点由其合成基因上调且具有最高 FPKM 值的证据所支持（图 S8）。通过这种合作，MAGs 在合成代谢物时能够有效降低其代谢负担，通过缩短合成途径（Romine 等人，2017）。因此，群体感应通过在微/纳米塑料压力下改变代谢物生产偏好，对微生物的营养利用和能量消耗施加了限制性控制。这加强了微生物群落内代谢劳动的分工（Pande 等人，2014; Yin 等人，2024），其中微生物专门生产某些代谢物，而不是多维度的生产。 这项法规可以通过提高代谢效率并在不利情况下确保生态稳态，从而使整个社区受益（Pande 等人，2014）。
然而，并非所有 MAGs 都参与了跨营养，尽管它们利用了跨营养提供的代谢物。这些 MAGs（例如 PSE8 和 PSE9）被识别为作弊者，并表现出几乎所有代谢途径的下调。我们发现，在微/纳米塑料压力下，一些 MAGs 的跨营养增强，但作弊者的比例同时大幅增加，从而与跨营养的贡献者竞争代谢物（Sun 等人，2019）。目前，作弊者运作的确切机制尚不清楚。据推测，它们缺乏编码细菌通讯的基因，从而逃避 QS 的调控（Diggle 等人，2007; Stump 等人，2018a）。或者，它们可能只分泌信号，但不产生代谢产物（Czárán 和 Hoekstra，2009）。无论如何，作弊者的存在不应被忽视。 作弊者可以通过最小化生产成本来达到高增长率并超越生产者（Gore 等人，2009），导致生产者在获取足够代谢物时遇到困难，这对交叉养分的可持续性不利。此外，在微/纳米塑料压力下，信号分子含量的减少抑制了微生物群落及时应对不良环境的能力，从而限制了群体感应（QS）调整交叉养分策略以适应环境的能力。这最终导致了代谢物生产的减少（Stump 等人，2018b）。

4.3. 代谢产物在反硝化电子传递过程中的作用

大多数代谢产物对反硝化电子转移至关重要，不仅体现在 EET 过程中，也体现在 DETC 组件中（Glasser 等人，2017）。对于 EET 过程，Cyt c 介导的直接电子转移和电子穿梭体介导的间接电子转移都与辅因子合成途径直接相关（Ouboter 等人，2024）。一方面，位于外膜中的 Cyt c 可以与β-桶蛋白结合，在革兰氏阴性菌中跨外膜传递电子（Lovley 和 Holmes，2022）。因此，编码血红素（Cyt c 的主要成分）的基因的缺失和表达下调不可避免地对 Cyt c 含量产生了不利影响，这与图 5d 和图 S12b 所示的结果一致。 另一方面，芳香族氨基酸和 FAD 等电子穿梭体已被证明可以加速电子转移速率，电子跳跃被确定为间接电子转移的分子机制（Light 等人，2018; Xiao 等人，2017）。然而，作为 VB2 代谢后续物质的 FAD 编码基因的表达，仅在 3 种 MAGs（PSE2、PSE3 和 PSE7）中上调（图 S8）。FAD 含量的减少会阻碍 EET 过程的效率。
对于 DETC，电子输入和电子传输均被发现与代谢产物密切相关。NAD+ 的前体 VB3 由于通路下调导致需求显著不足，这导致通过氧化 NADH 向复合体 I 提供的电子供应减少。这一发现与 R2 和 R3 中观察到的 NADH 含量下降相一致（图 S12a）。此外，MOCO 是 NAR 酶的关键组成部分（Pienkos 等人，1977），其合成仅在 3 种 MAGs（PSE3、PSE6 和 PSE7）中被观察到（图 S8）。这表明硝酸盐还原能力受损，这与硝酸还原酶活性的降低相一致（图 S13）。
在长期微/纳米塑料压力下，投机者（例如 PSE10）表现出代谢物合成基因表达的下调和反硝化酶的上调，表明它们依赖生产者提供的代谢物进行反硝化电子转移（ 图 5b）。在这种情况下，物种可能会朝着非生产性的方向发展，直到共生关系崩溃（Stump 等人，2018a）。尽管群体感应（QS）有助于在恶劣环境中维持群落稳定性，但由于微/纳米塑料对 QS 基因的持续抑制作用，交叉喂养策略最终无法及时调整。结果，群落内的代谢负担无法有效分配，导致代谢产物产量减少，最终阻碍反硝化电子转移过程，并导致 AGS 反应器中 TN 去除率降低。

4.4. 本研究的重要性

与以往侧重于从细胞毒性角度研究微/纳米塑料对氮转化影响的研究不同（ 张等人，2023），我们的研究探讨了 QS 调控的种间相互作用如何影响 AGS 在暴露于微/纳米塑料时的反硝化电子传递过程。迄今为止，人们仅关注 QS 对合成微生物群落反硝化性能的影响（ 何等人，2024）。据我们所知，这是首次通过多组学分析阐明 QS 如何影响微/纳米塑料胁迫下混合微生物群落（AGS）反硝化机制的研究。我们的研究为理解 AGS 系统在应对聚苯乙烯微/纳米塑料胁迫时的微生物群行为提供了新视角，该机制可推广至其他生物污水处理系统。 然而，鉴于微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）在水处理中的普遍存在，且其类型、形状和尺寸各不相同，未来的研究应解决 QS 介导的种间相互作用如何应对复杂的微/纳米塑料污染的差距，并通过通过 QS 介导的公共产品调节细菌的社会性状，探索环境可持续策略以提升水处理性能。

5. 结论

我们结合了长期反应器性能与多组学分析，以提供关于微/纳米塑料压力下 QS 调控的跨营养对 AGS 系统反硝化电子转移的潜在影响的全新见解。结果表明，与 MPs 相比，NPs 对 QS 系统具有更显著的抑制作用，这体现在信号分子含量的降低以及 QS 跨 Talk 的受损。QS 的恶化导致代谢产物的分泌减少，并通过跨营养减弱了权衡的调控。这种现象对与电子转移相关的物质合成具有显著影响，包括芳香蛋白、维生素和 MOCO。因此，与对照组相比，细胞外电子转移能力和反硝化电子转移链活性显著下降，直接损害了 AGS 系统的反硝化性能。

CRediT 作者贡献声明

张冰： 撰写——初稿，指导，概念化。 齐 Bowen： 撰写——初稿，可视化，调查，数据管理。 石文欣： 撰写——审阅与编辑，指导，资金获取。 黄树昌： 撰写——初稿，调查。 徐伟： 撰写——初稿，方法学。 严鹏： 撰写——初稿，方法学。 张冰： 撰写——审阅与编辑，指导，资金获取。 Lens Piet N.L.： 撰写——审阅与编辑，指导。 彭永振： 撰写——审阅与编辑，指导。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本论文中报告的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金 (52270025 和 52370029) 和新重庆青年创新人才项目 (Z20241429) 的支持。

附录。补充材料

数据可用性

如需获取数据，请提出申请。

References

Cited by (2)

  • Attachment performance between micro particles and different sized aerobic granular sludge - from outside to inside

    2025, Water Research

  • Unmasking microplastics in anaerobic digestion: Hidden threats, synergistic pollutants, and biodegradation Frontiers — A comprehensive hotspot review

    2025, Environmental Chemistry and Ecotoxicology
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