用于测定抗氧化剂活性的分析方法：综述

 摘要

对抗氧化剂及其在食品工程、医学和药学等各个领域的影响的研究是科学界的主要兴趣所在。本文对用于确定抗氧化剂活性的最重要的测试方法、检测机制、适用性以及这些方法的优缺点进行了批判性介绍。在基于氢原子转移的测试中，主要介绍了以下几种：氧自由基吸收能力（ORAC）测试、羟自由基抗氧化能力（HORAC）测试、总过氧自由基捕获抗氧化参数（TRAP）测试和总氧自由基清除能力（TOSC）测试。基于一个电子转移的测试包括铜还原抗氧化能力（CUPRAC）测试、铁还原抗氧化能力（FRAP）测试和 Folin-Ciocalteu 测试。混合试验包括氢原子和电子的转移，包括 2,2′-叠氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）试验和[2,2-二（4-叔辛基苯基）-1-苦基肼]（DPPH）试验。所有这些检测方法都以化学反应为基础，评估动力学或达到平衡状态依赖于分光光度法，前提是要分析的溶液出现特征性颜色或褪色，这是通过特定波长的吸附进行监测的过程。这些检测方法已成功应用于抗氧化分析或复合样品抗氧化能力的测定。作为此类研究的补充方法，可以使用基于电化学（生物）传感器的方法，但需要经过校准和验证阶段。将化学方法与电化学方法结合使用，可以明确涉及多种抗氧化剂的过程的运行机制和动力学。

 1.导言

在分子生物学中，退化过程的发生与自由基过剩有关，自由基过剩会促进对人体有害的氧化过程。植物中含有大量具有抗氧化特性、能够捕捉自由基的化合物（类胡萝卜素、酚类、黄酮、花青素衍生物、不饱和脂肪酸、维生素、酶和辅助因子），这激发了人们将植物用于预防和治疗植物疗法的兴趣。

抗氧化剂的作用是中和生物细胞中的自由基，自由基对生物体有负面影响。超氧化物歧化酶（SOD）在中和与自由基存在有关的氧化压力影响方面发挥着特殊作用。它是一种具有亚单位结构组织的金属酶，是生物细胞氧化过程的主要调节器。这种酶催化氧自由基的重组反应。通过使用 SOD 进行抗氧化治疗，可以有效治疗人体的各种病理状态，并防止其发生（它可以防止过氧化氢和三重氧的形成）。

氧化应激是一个相对较新的概念，在过去三十年中被广泛应用于医学科学领域。它在糖尿病、高血压、子痫前期、动脉粥样硬化、急性肾功能衰竭、阿尔茨海默氏症和帕金森氏症等常见疾病的生理学中发挥着积极作用。细胞在代谢氧气的过程中会产生活性氧（ROS），而活性氧具有潜在的危害性。在正常情况下，氧化剂形成的速度和幅度与其清除的速度相平衡。然而，促氧化剂和抗氧化剂之间失去平衡会导致氧化应激。生物细胞中高浓度的 ROS 会对细胞的功能产生很大影响，导致细胞运转不畅、衰老或疾病[ 1]。

表 1 概述了推测的 ROS 和非自由基物种。

Table 1. Reactive oxygen species (ROS) and non free-radical species.

Reactive Oxygen Species		Non Free-Radical Species
Hydroxyl radical	HO•	Hydrogen peroxide	H2O2
Superoxide radical	O2•	Singlet oxygen	1O2
Hydroperoxyl radical	HOO•	Ozone	O3
Lipid radical	L•	Lipid hydroperoxide	LOOH
Lipid peroxyl radical	LOO•	Hypochlorous acid	HOCl
Peroxyl radical	ROO•	Peroxynitrite	ONOO−
Lipid alkoxyl radical	LO•	Dinitrogen trioxide	N2O3
Nitrogen dioxide radical	NO2•	Nitrous acid	HNO2
Nitric oxide radical	NO•	Nitryl chloride	NO2Cl
Thiyl radical	RS•	Nitroxyl anion	NO−
Protein radical	P•	Nitrosyl cation	NO+

大量研究表明，由于抗氧化剂具有减少氧化应激的能力，因此在维护人类健康、预防和治疗疾病方面发挥着至关重要的作用。因此，测量食品和生物样本的抗氧化活性/能力不仅对确保功能食品的质量至关重要，更重要的是对研究食品抗氧化剂在预防和治疗与氧化应激有关的疾病方面的效率至关重要。

抗氧化剂是一种化合物，当它以极低的浓度存在于食品或人体中时，可延缓、控制或防止氧化过程，从而导致食品质量下降或机体退化性疾病的发生和传播。这些抗氧化剂化合物在抑制氧化过程中涉及多种方法和活动[ 2]。

具有抗氧化特性的分子可以由内源性产生，也可以通过饮食或食物补充剂外源性摄入。主要的内源性抗氧化酶有 SOD、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。SOD 将超氧阴离子转化为 H ₂ O ₂ ，后者是 CAT 和 GSH-Px 的底物。过氧化氢酶在水和氧气中代谢 H ₂ O ₂ ，GSH-Px 与谷胱甘肽（GSH）反应后可还原 H ₂ O ₂ 和有机氢过氧化物。

外源性抗氧化剂，如维生素 E 和 C，可能存在于生物体的细胞膜、细胞内和细胞外液体中。它们与 ROS 发生反应，消除或抑制 ROS。膜内部的疏水性脂质需要不同种类的抗氧化剂。脂溶性维生素 E 是这种环境中最重要的抗氧化剂，可防止膜完整性的丧失。

脂溶性抗氧化剂对防止生物膜中的多不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化非常重要。水溶性抗氧化剂，如维生素 C，在中和亲水相中的 ROS 方面发挥着关键作用。

本综述概述了测量抗氧化剂活性的最新方法及其背后的化学原理。此外，还分析并强调了每种方法最重要的优点和缺点。了解测量方法的原理机制、优势和局限性，对于在实际应用中正确选择有效评估抗氧化潜力的方法非常重要。

2.抗氧化剂的分类

根据其作用机制，抗氧化剂可分为一级抗氧化剂和二级抗氧化剂。一级抗氧化剂抑制氧化链反应，充当自由基的氢供体或受体，产生更稳定的自由基。这类抗氧化剂主要具有酚类结构，包括：抗氧化矿物质、抗氧化维生素和植物化学物质，其中有类黄酮、儿茶素、类胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、二萜及其衍生物。这些化合物通过各种机制相互作用，包括结合金属离子、清除活性氧、将氢过氧化物转化为非自由基、吸收紫外线辐射或使单线态氧失去活性。这类化合物包括：丁基羟基茴香醇（BHA）、丁基羟基甲苯（BHT）和丙基半乳糖酸酯（PG）[ 3]。

抗氧化化合物的功效取决于多个因素，其中最重要的是结构特性、温度、易氧化基质的特性、浓度、协同和促氧化化合物的存在以及系统的物理状态。抗氧化剂的化学结构决定了它对自由基和其他 ROS 的内在反应性，从而影响抗氧化剂的活性。抗氧化剂的效率还取决于其在系统中的浓度和定位，例如界面分布[4]。在短期或长期保护作用中起重要作用的另一个因素是反应动力学。这涉及抗氧化剂与不同氧化剂之间的反应速率、反应的热力学以及抗氧化剂的反应能力[5]。在考虑效率和选择适合特定用途的抗氧化物质时，应将所有这些参数考虑在内。

图 1 说明了抗氧化剂的分类，图 2 则指出了抗氧化剂的应用范围。

图 1.抗氧化剂的分类[ 6]。

图 2.抗氧化剂的应用范围[ 7]。

3.测量抗氧化活性

过去几十年来，用于测量抗氧化剂活性的方法和仪器取得了显著进步。早期的方法是测量抗氧化剂对特定种类氧化产物形成的效率，因此是以测量脂质氧化为基础的。迄今为止，各种化学测试以及高灵敏度和自动化检测技术已被用于通过特殊方法评估抗氧化剂的活性，例如清除不同类型自由基或 ROS 的活性、还原力和金属螯合作用等。氧化底物也从食品模型系统扩展到化合物、生物材料、细胞系甚至活体组织[2]。

有许多测试方法可以直接测量抗氧化剂向自由基转移氢原子或电子的情况。这组方法中报告的抗氧化剂活性通常与它们中和某些自由基种类的能力有关，其中有些可能是人为的，与生物无关。因此，这些方法的缺点是不能反映氧化食物或体内的情况。不过，通过这些方法获得的氢原子转移数据或电子捐献能力数据可以提供有关其内在抗氧化潜力的重要信息，而且环境干扰极小。这些测试不需要脂质底物，通常使用一个包含氧化剂（自由基或其他 ROS）、氧化底物（有些测试不需要）和抗氧化剂的化学系统进行研究。

食品成分抗氧化活性的标准化方法应满足以下理想要求[ 8]：

• 
  使用的自由基源必须与生物相关；
• 
  最好简单明了；
• 
  所使用的方法必须有明确的终点和化学机制；
• 
  所使用的仪器和化学品都必须是现成的；
• 
  周期内和不同天之间的重现性是适当的；
• 
  它可以利用不同的自由基来源对亲水性和亲油性抗氧化剂进行分析；
• 
  该方法必须适用于质量控制分析。

需要强调的是，抗氧化活性不能只用一种方法来检测。应在体外进行几种抗氧化程序，以确定相关样品的抗氧化活性。考虑到这一点，很难将一种方法与另一种方法进行完全比较。因此，在选择一种分析方法用于研究之前，必须对其进行检查。

评估抗氧化能力的各种方法可分为三类，即光谱法、电化学法和色谱法[ 3] ，如表 2 所示。

Table 2. Different techniques used to measure antioxidant activity.

Techniques	Antioxidant Capacity Assay		Principle of the Method	End-Product Determination
Spectrometry		ORAC	Antioxidant reaction with peroxyl radicals, induced by 2,2′-azobis-2-amidino-propane (AAPH)	Loss of fluorescence of fluorescein
		HORAC	Antioxidant capacity to quench OH radicals generated by a Co(II) based Fenton-like system	Loss of fluorescence of fluorescein
		TRAP	Antioxidant capacity to scavenge luminol-derived radicals, generated from AAPH decomposition	Chemiluminescence quenching
		CUPRAC	Cu (II) reduction to Cu (I) by antioxidants	Colorimetry
		FRAP	Antioxidant reaction with a Fe(III) complex	Colorimetry
		PFRAP	Potassium ferricyanide reduction by antioxidants and subsequent reaction of potassium ferrocyanide with Fe3+	Colorimetry
		ABTS	Antioxidant reaction with an organic cation radical	Colorimetry
		DPPH	Antioxidant reaction with an organic radical	Colorimetry
	FluorimetricAnalysis		Emission of light by a compound, which has absorbed light or other electromagnetic radiation of a different wavelength	Recording of fluorescence excitation/emission spectra
Electrochemical Techniques		Voltammetry	The reduction or oxidation of a compound at the surface of a working electrode, at the appropriate applied potential, resulting in the mass transport of new material to the electrode surface and in the generation of a current	Measurement of the current of the cathodic/anodic peak
		Amperometry	The potential of the working electrode is set at a fixed value with respect to a reference electrode	Measurement of the current generated by the oxidation/ reduction of an electroactive analyte
		Biamperometry	The reaction of the analyte (antioxidant) with the oxidised form of a reversible indicating redox couple	Measurement of the current flowing between two identical working electrodes, at a small potential difference and immersed in a solution containing the analysed sample and a reversible redox couple
Chromatography		Gas chromatography	Separation of the compounds in a mixture is based on the repartition between a liquid stationary phase and a gas mobile phase	Flame ionisation or thermal conductivity detection
		High performance liquid chromatography	Separation of the compounds in a mixture is based on the repartition between a solid stationary phase and a liquid mobile phase with different polarities, at high flow rate and pressure of the mobile phase	UV-Vis (e.g., diode array) detection, fluorimetric detection, mass spectrometry or electrochemical detection

ORAC—Oxygen Radical Absorption Capacity; HORAC—Hydroxyl Radical Antioxidant Capacity; TRAP—Total Peroxyl Radical Trapping Antioxidant Parameter; CUPRAC—Cupric Reducing Antioxidant Power; FRAP—Ferric Reducing Antioxidant Power; PFRAP—potassium ferricyanide reducing power; ABTS—2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid; DPPH—[2,2-di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl].

4.确定抗氧化活性的化学测试

根据可能涉及的化学反应，这些测试可分为两类：基于氢原子转移（HAT）和单电子转移（SET）反应的方法。尽管动力学和反应阶段不同，但无论涉及哪种反应机制，最终结果都是相同的[8]。与质子交换反应耦合的 SET 和 HAT 反应可能与主反应同时发生，在这种情况下，特定体系中的主导机制取决于抗氧化剂的结构和特性、溶解度和分配系数以及溶剂体系。

测量抗氧化能力的化学测试方便、快捷，而且通常是自动化的，主要用于筛选和初步评估新的抗氧化化合物或最终实际产品/副产品的提取物。

4.1.基于氢原子转移（HAT）的测试

基于氢原子转移的测试测量抗氧化剂通过捐献一个氢原子来清除自由基的能力。在以下反应中，苯酚（ArOH）的氢原子（H）被转移到过氧自由基上，证明了 HAT 的抗氧化作用机制：

ROO^• + AH/ArOH ⇄ ROOH + A^•/ArO^•

其中：苯酚（ArOH，一种抗氧化剂）与过氧自由基（ROO）反应形成的芳氧自由基（ArO）通过共振得到稳定，AH 是受保护的生物大分子。

高效的酚类抗氧化剂应比生物大分子（受保护分子）与自由基的反应速度更快，从而对自由基的氧化起到保护作用[9]。

氧自由基吸收能力（ORAC）、过氧自由基捕获抗氧化剂总参数（TRAP）和总氧自由基清除能力（TOSC）检测就是基于 HAT 的检测的典型例子[10]。

 4.1.1.ORAC 试验

ORAC 试验通过监测过氧自由基氧化的抑制作用，来测量抗氧化剂对自由基连锁反应的分裂能力。在生理条件下，过氧自由基是生物系统和食品中脂质氧化的主要自由基。因此，一些研究人员认为 ORAC 值与生物相关，是抗氧化效率的基准。

本试验中常用的过氧自由基发生器以偶氮化合物为代表，包括亲脂性 α,α,-偶氮二异丁腈（AIBN）、2、2-叠氮双（2-脒基丙烷）氯化物（ABAP）、2,2′-叠氮双（2,4-二甲基戊酰氨基甲苯）（AMVN）和亲水性 2,2′-叠氮双（2-脒基丙烷）二盐酸盐（AAPH）[11]。

根据这种测试方法，发生器发出的过氧自由基与荧光样本发生反应，导致荧光损失，并在荧光计上记录下来。该方法采用了在抗氧化剂存在和不存在的情况下的曲线下面积技术。作为参考化合物使用的是标准抗氧化剂，通常是三氧化锡，被评估抗氧化剂的 ORAC 值用三氧化锡当量来描述。ORAC 测试描述的是抗氧化剂产生氢原子的能力，因此是一种基于氢原子的检测方法。为了改进该方法，已开发出一种使用多通道液体处理系统和微孔板荧光阅读器的高通量检测方法[ 12]。

通常使用 H ₂ O ₂ -CuSO ₄ 系统作为羟基自由基发生器，β-phycoerythrin 作为氧化还原敏感的荧光指示蛋白，以 Trolox 为标准，在自由基清除剂存在的情况下测量其荧光衰减（图 3）。第一步，H ₂ O ₂ 与 Cu（II）络合，形成过氧化氢铜（II）。后者在慢步骤中发生单分子分解，形成 Cu(I) 和 O ₂ ⁻ 。在没有氢原子供体的情况下，Cu-O 键的同解裂解可能是 CuOOH ⁺ 分解的首选途径。在下一个方程式中，Cu(I) 与 H ₂ O ₂ 反应生成羟基自由基。

图 3.检测羟自由基和过氧自由基的氧自由基吸收能力（ORAC）测定中涉及的反应方案。

偶氮 AAPH 化合物是亲水系统中最常用的过氧自由基发生器，使用的荧光探针是β-phycoerythrin 或最近使用的荧光素。因此，过氧自由基是由 AAPH 热分解生成的，生成的烷基自由基与分子氧反应生成过氧自由基。考虑到过氧自由基的生成受温度的影响，温度被认为是干扰结果的主要因素之一。微孔板外部孔内的微小温差都会降低检测的重现性。因此，在检测过程中监控和调整温度非常重要。不过，通过开发配备恒温器的自动荧光微孔板阅读器，这个问题已经得到了解决[ 8]。

研究人员介绍了一系列荧光材料，并建议将其作为 ORAC 测试的样品。最初，人们使用从蕨类植物中分离出来的蛋白质--β-phycoerythrin 作为荧光探针，它与 ROO 反应生成一种非荧光产物。然而，由于某些原因，在抗氧化检测中使用 β-斑蝥素存在缺陷：

• 
  β-phycoerythrin 与 ROO 的反应性差异很大，导致检测结果不一致；
• 
  β-phycoerythrin 在受到激发光照射后会因与多酚的非特异性蛋白质结合而发生光漂白[12]。

近几十年来，荧光素是 ORAC 测试中最常用的荧光样本。但研究表明，荧光素会发生不期望的荧光损失和二次反应[13]，因此有人提出了新的荧光分子。有人用尼罗河磷蓝作为替代样品来测定果汁和葡萄酒中的 ORAC 值，得到的值与使用荧光素的方法结果一致[ 14]。

Guclu 等人（2014 年）描述了通过荧光样本（即对氨基苯甲酸 (PABA)）测量一些肝脏和肾脏样本的 ORAC 值。作者建议在用于氨基酸、白蛋白、血浆和某些硫醇类抗氧化剂的 ORAC 测试中，用 PABA 取代荧光探针（通常是荧光素）。对谷胱甘肽和半胱氨酸等硫醇化合物的测试结果并不确定[ 15]。

Nkhili 等人（2011 年）指出，有必要继续改变 ORAC 方法，以消除测试系统中的金属离子对抗氧化化合物 ORAC 值测量的影响。这可能会导致与金属离子形成复合组合，从而导致低估它们中和过氧自由基的能力。乙二胺四乙酸（EDTA）可能有助于减弱干扰，在这方面，有报告称使用 EDTA 时 ORAC 值明显更高[ 16]。

总之，这种检测方法测量的是加入自由基生成物（如偶氮引发剂化合物）后，荧光分子、β-环糊精或荧光素的氧化降解情况。偶氮引发剂通过加热产生 ROO，从而伤害荧光分子，导致荧光消失。随着氧化变性的继续，荧光强度会下降，这种强度通常在加入作为自由基生成物的偶氮引发剂后半小时内记录下来。抗氧化剂可保护荧光分子免受氧化变性。保护程度可通过荧光计进行量化。目前，荧光素最常用作荧光探针。可自动计算容量的测量设备在市场上有售。

 4.1.2.HORAC 试验

该方法通过 Co(II) 复合物来评估对羟自由基形成的保护能力。先将荧光素与要分析的样品一起孵育，然后加入芬顿混合物（羟自由基的生成物）。测量原始荧光，然后在搅拌后每分钟读数一次。使用不同浓度的没食子酸标准溶液建立校准曲线。羟基自由基抗氧化能力（HORAC）测试通过中断自由基反应来直接测量抗氧化能力[17]。

 4.1.3.TRAP 试验

TRAP 测试基于抗氧化剂抑制过氧自由基和目标分子之间反应的能力，目标分子最初代表 2,2′偶氮双（2-脒基丙烷）二盐酸盐（ABAP）热分解引发的过氧化过程中 O ₂ 的消耗量（作为样品）。可以定量测量 O ₂ 吸收的延迟时间，即诱导期，并用 TRAP 值来表示样品的总抗氧化能力[ 9]。此后，该方法经过多次修改，使用了更多的样品、引发剂和终点测量方法，例如使用酶 AAPH 和过氧化物酶作为引发剂，使用荧光素、二醋酸二氢荧光素（DCFH-DA）和发光酚作为反应终点的测量方法[18]。二氢荧光素二乙酸酯和发光酚的化学结构见图 4。

图 4：(1) 二氢荧光素二乙酸酯；(2) 鲁米诺。

根据等式，TRAP 指数定义为每升液体（血浆）中所含 ROO 的摩尔数[ 19]：

TRAP=RROO• × τplasma$$\mathrm{TRAP}={\mathrm{R}}_{{\mathrm{ROO}}^{•}} \times {\mathsf{\tau }}_{\mathrm{plasma}}$$

(1)

其中，R _ROO 是 ROO 形成率，τ _plasma 是人体血浆存在时产生的耗氧量延迟时间。

人们提出了多种方法来评估天然产品的 TRAP 指数。其中一种方法使用鲁米诺（邻氨基邻苯二甲酰肼）和吡喃素（8-羟基-1,3,6-苯乙烯三磺酸）作为目标分子。发光酚与 ROO 发生反应，发出光子，可通过发光计进行测量，而由 ROO 触发的吡喃素氧化则可通过荧光测量进行追踪[9]。可以看出，发光酚与 AAPH 培养期间的发光强度与 AAPH 热解过程中产生的 ROO 的稳定状态浓度直接相关[9]。在酚类化合物（或其复合物混合物）存在的情况下，ROO 的稳定态浓度会降低，如下式所示：

[ROO•]ss=RROO•Σki$${\left[{\mathrm{ROO}}^{•}\right]}_{\mathrm{ss}}=\frac{{\mathrm{R}}_{{\mathrm{ROO}}^{•}}}{\mathsf{\Sigma }\mathrm{ki}}$$

(2)

其中 [ROO] _ss 是 ROO 的稳定状态浓度，R _ROO 是 ROO 的形成速率，Σki 是酚类化合物与 ROO 之间所有反应的速率常数。

当使用发光酚作为目标分子时，在研究样品浓度较高（酚类化合物浓度较高）的情况下，可以估算 TRAP 值。

TRAP = Σni[Xi]ΣnTROLOX$$\mathrm{TRAP} = \frac{\mathsf{\Sigma }\mathrm{ni}\left[{\mathrm{X}}_{\mathrm{i}}\right]}{{\mathsf{\Sigma }\mathrm{n}}_{\mathrm{TROLOX}}}$$

(3)

其中，∑ni 是每 i 个分子捕获的自由基数量，[X] 是该成分的微摩尔浓度，∑n _TROLOX 是 TROLOX 当量。

因此，TRAP 指数与酚类化合物和 ROO（n）之间反应的化学计量学直接相关，即酚类化合物捕获每个分子的 ROO 分子数。无论如何，在低浓度样品中，当酚类化合物的浓度不足以完全保护发光酚时，可以观察到只有[ROO] _ss 下降，而动力学曲线中没有出现延迟时间。在这种情况下，可以根据下式估算 TAR 指数，该指数反映了酚类化合物对 ROO 的反应活性。

TAR = ΣkikTROLOX$$\mathrm{TAR} = \frac{\mathsf{\Sigma }\mathrm{ki}}{{\mathrm{k}}_{\mathrm{TROLOX}}}$$

(4)

其中，∑ki 是所考虑的化合物与 TROLOX 在降低过程中所涉及的自由基的稳定态浓度方面的效率之比。

根据所研究样品的潜在用途，可以使用 TRAP 或 TAR 指数。如果在某种饮料（或油）中添加酚类化合物是为了提高其稳定性，那么了解样品中酚类化合物的 TRAP 值就非常重要。但是，如果该化合物将在生物系统中用作自由基捕获剂，则应考虑其对 ROO 的反应性（TAR）。

 4.1.4.TOSC 测试

TOSC 试验的基础是，在与α-酮-γ-硫醇丁酸（KMBA）竞争 ROS 的抗氧化化合物存在的情况下，抑制乙烯的形成（通过气相色谱法监测对照反应）。该测试使用乙烯浓度曲线下的面积与反应时间（最长 300 分钟）进行比较[20]。

4.2.基于单电子转移（SET）的测试

基于单个电子转移的测试，也称为电子转移（ET）测试，检测抗氧化剂转移电子以还原金属离子、羰基和自由基的能力[ 21]。抗氧化剂的 SET 作用机制可归纳为以下反应：

ROO^• + AH/ArOH → ROO⁻ + AH^•+/ArOH^•+

AH^•+/ArOH^•+ + H₂O ↔ A^•/ArO^• + H₃O⁺

ROO⁻ + H₃O⁺ ↔ ROOH + H₂O

SET 方法中的相对反应性主要基于反应性官能团的去质子化和电离电位。因此，SET 反应与 pH 值有关[ 22]。芳氧自由基（ArO）随后被氧化成相应的醌（Ar = O）。由于氧化还原电位降低，芳氧自由基越稳定，从 ArOH 氧化成 Ar = O 就越容易。这些测试中的抗氧化作用通常用合适的荧光或彩色样品代替过氧自由基来模拟。

光谱 SET 测试包括 Folin-Ciocalteu 测试（FC）、铁还原抗氧化能力测试（FRAP）和还原铜抗氧化能力测试（CUPRAC），用于测量抗氧化剂还原氧化剂的能力，氧化剂被还原时会变色。变色程度与总抗氧化能力的浓度相关。此外，电化学和纳米技术方法也属于 ST 类测试。

 4.2.1.CUPRAC 测试

用于测定总抗氧化能力的 CUPRAC 分析法是在 2000 年代初设计的[ 23]，但它已被修改为各种基于将铜（Cu ²⁺ ）还原为亚铜（Cu ⁺ ）的抗氧化活性测定方法。与其他检测方法类似，使用配体形成铜配体复合物，以方便吸光度测量。新乌头碱（Nc；2,9-二甲基-1,10-菲罗啉）是 CUPRAC 分析中常用的配体。这种方法已应用于含有亲脂性和亲水性抗氧化剂的各种基质。

这种方法可以用 Cu ²⁺ - 新铜试剂作为发色性氧化剂来测定食品成分的抗氧化能力。Cu ²⁺ 在新铜试剂的作用下被还原剂还原，生成 Cu ⁺ 复合物，其最大吸收峰在 450 纳米波长处（图 5）。CUPRAC 分析法的生色氧化剂试剂 Cu ²⁺ -Nc 与正电子还原型抗氧化物质 (AOX) 发生反应，如下式所示：

nCu(Nc) ₂ ²⁺ + 正电子还原剂 (AOX) ⇄ nCu(Nc) ₂ ⁺ + 正电子氧化产物 + nH ⁺

图 5.铜还原抗氧化能力（CUPRAC）测定中的反应方案。HA 代表抗氧化剂分子，A ⁺ 代表氧化的抗氧化剂分子 (a)；检测中的颜色变化 (b)。

在这种还原测定法中，多酚和其他抗氧化剂的活性 Ar-OH 基团被氧化成相应的醌类，而 Cu ²⁺ -neocuproine 则被还原成 Cu ⁺ -neocuproine 复合物，后者呈现强烈的橘黄色。需要注意的是，真正的氧化剂是 Cu(Nc) ₂ ²⁺ 物种，而不是单独的 Cu ²⁺ 物种，因为侣 (II/I)-Nc 的标准氧化还原电位为 0.6 V，远高于非络合侣 Cu ²⁺ /Cu ⁺ 的标准氧化还原电位（0.17 V）[ 9]。食品和生物化合物中的主要抗氧化剂的氧化还原电位与 Cu(II/I)-Nc 氧化还原偶的氧化还原电位一致，在 0.2-0.6 V 之间。

考虑到铜态会与新铜绿素发生有利的附着，反应结束时出现的发色团产物的数量与 Cu (II)-Nc 的数量相等。释放出的质子在含有醋酸铵的溶液中得到缓冲，pH 值为 7.0。这个 pH 值非常接近生理 pH 值（7.4），是进行 CUPRPAC 分析的最佳 pH 值。

对于一些特定化合物，包括表儿茶素半乳糖酸盐、迷迭香酸、槲皮素、表儿茶素、儿茶素、酸咖啡酸、表儿茶素、没食子酸、芦丁和绿原酸[24, 25]，使用 CUPRAC 方法可以获得最佳抗氧化能力。这是因为电子的最佳转移取决于羟基的数量和方向，还取决于整个分子的共轭程度[26]。

尽管菲啰林的其他衍生物可以选择性地稳定 Cu ⁺ 离子与 Cu ²⁺ 离子，其中包括 BCS（2,9-二甲基-4,7-二苯基-1,10-菲啰啉二磺酸）[27] 和双烟酸（BCA：28]，只有新橙皮甙作为 CUPRAC 分析的主要配体被广泛用于测量抗氧化能力。值得一提的是，与 Nc 相比，BCS 和 BCA 具有特殊的缺点。首先，由于 fenantrolin 环上存在带负电荷的磺酸基团，Cu(I)-BCS 复合物的总电荷高于 Cu(I)-Nc 复合物。离子与水分子之间的相互作用会导致发色团上的电荷与其疏水驱逐亲和力之间的反向上瘾。因此，Cu(I)-BCS 不可避免地会降低膜的渗透性，这也是它在非极性溶剂中用作 TAC 试剂的频率低于铜-Nc 的原因。

从反应动力学和对血浆中亲脂性抗氧化化合物（如 β-胡萝卜素、α-生育酚）的反应来看，Çelik 等人（2012 年）认为 Cu(I)-BCS 试验不能与 CUPRAC 试验进行实际比较[29]。

Zhou 等人（2012 年）的研究表明，Cu(I,II)-BCS 夫妇的还原电位值为 E° = 0.844 V [ 30]，略高于最常见的 ET 试剂：E° = 0.844 V [ 30]，略高于最常见的 ET 试剂。这可能会对真正抗氧化物质的选择性产生负面影响。

另一方面，即使 BCA 的最大吸收波长（558 nm）比 Nc 的铜络合物（可以去除大多数植物色素的背景色）更高，这显然是个优势，但我们也注意到，在进行 BCA 试验时，游离铜离子的浓度不能过高[ 31]。

此外，据报告，体外铜离子（Cu ²⁺ ）还原测量所获得的结果可能会更有效地扩展到体内抗氧化剂可能发生的反应。CUPRAC 致色氧化还原反应是在接近生理 pH 值（7.4）的 pH 值（7.0）下进行的。反应完成的时间在 30 到 60 分钟之间，取决于抗氧化剂的速度。例如，类黄酮苷可能需要初步水解才能充分凸显其抗氧化能力。

对最初的 CUPRAC 试验进行了修改，以便将各种样品纳入不同的应用中。例如，在甲基-β-环糊精的帮助下，丙酮/水环境被用于同时测定亲水性和亲油性抗氧化剂[32]。为了评估食品基质中游离态和捆绑态的酚类抗氧化剂，无需进行初步提取，也减少了复杂的水解过程，有人提出了将附着在 CUPRAC 试剂上的抗氧化剂强制溶解的方法，这种方法的优点在于固体物质（捆绑抗氧化剂）和液体物质（可溶性 CUPRAC 试剂）之间的表面反应现象[33]。这种改良方法适用于相对不溶解的食品基质以及不溶解的化妆品，如膏霜、香脂和粉末。

在另一种改进的 CUPRAC 试验中，对光学传感器进行了改进，使其含有固定的发色性氧化还原试剂，从而无需任何预处理即可测量液体样品的还原力[ 25]。CUPRAC Cu ²⁺ -neocuproin 试剂被固定在改变阳离子的 Nafion 薄膜上，复合物被抗氧化剂还原为 Cu ⁺ -neocuproin，在 450 纳米波长处产生吸光度变化，并通过分光光度法进行监测。另一种辅助 CUPRAC 测试的光学传感器使用微型反射分光光度计来测量 530 nm 处的反射变化，而不是吸光度[ 34]。

建议使用光学传感器，这样可以大大简化操作，因为它可靠耐用，可以现场估算各种食品提取物和生物样本的抗氧化能力。

Özyürek 等人（2011 年）[ 35]对 CUPRAC 试验及其为消除活性氧而进行的测量调整进行了分析，并强调了与其他基于 ET 的检测方法相比的某些优势。

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  CUPRAC 试剂能够快速氧化硫醇类抗氧化剂，而其他基于铁（III）的 ET 检测方法（如 FRAP 法）则无法测量某些硫醇类抗氧化剂，如谷胱甘肽。造成这种情况的原因可能是 Cu(II) 的电子结构能够实现快速动力学。
• 
  有利的 pH 值：产生有色物种的氧化还原反应是在 pH 值为 7.0 的缓冲液中进行的，而不是在 FRAP 的酸性条件（pH 值为 3.6）或 Folin-Ciocalteu 分析法的碱性条件（pH 值为 10.0）下进行。在比生理 pH 值 7.4 更酸的条件下，还原能力可能会受到抑制。其原因是抗氧化化合物上的质子化，而在碱性条件下，酚的酸解离（通过质子释放）会提高样品的还原能力，从而引发不切实际的 TAC 测量。
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  有利的氧化还原电位：CUPRAC 试剂具有选择性，因为在菲罗啉或类似配体存在的情况下，它的氧化还原电位低于铁-铁偶联物的氧化还原电位。Cu(II,I)-Nc氧化还原偶的标准电位约为 0.6V，接近 ABTS ⁺ /ABTS的标准电位，即 0.68V。由于单糖和柠檬酸不是真正的抗氧化剂，这些化合物不能被 CUPRAC 试剂氧化。
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  稳定性和便利性：与其他发色试剂（如 ABTS、DPPH）相比，该试剂更稳定、更易获得。
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  多功能性：该方法可同时测定亲水性和亲油性抗氧化剂（如 β-胡萝卜素和 α-生育酚）。通过正己烷提取血清，然后在二氯甲烷中显色，可将血清中的亲脂性抗氧化剂与亲水性抗氧化剂分开测定。与广泛使用的 Folin-Ciocalteu 试剂相比，CUPRAC 的优势在于可以测定亲脂性抗氧化剂，而 FCR 不能用于生物液体的 TAC 检测。
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  根据 Christodouleas 等人（2014 年）汇编的综合综述，食用油中的亲脂性抗氧化物质可通过 Cu(II)-Nc 试剂进行有效分析，以获得 TAC 值[ 36]。
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  稳健性：据观察，与 DPPH 等自由基试剂相比，空气、湿度、阳光等生理参数不会影响 CUPRAC 与抗氧化剂的反应。
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  灵敏度和线性响应：CUPRAC 方法的吸光度与浓度曲线在很大范围内呈线性关系，而其他方法的吸光度与浓度曲线呈多项式关系。对于正电子还原剂，摩尔吸收率（即 (7.5-9.5 × 10 ³ n) Lmol ⁻¹ cm ⁻¹ ）足够高，可以灵敏地测定重要的生物抗氧化剂。
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  使用 CUPRAC 发现的抗氧化剂 TAC 值是完全相加的，即混合物的 TAC 值等于其成分的 TAC 值之和。遗憾的是，由于氧化反应无法控制，在各种类似的 TAC 测试中，无法确保复杂混合物的抗氧化能力具有相加性（例如，在 FRAP 反应中，硫醇化合物与一些多酚化合物缺乏相加性）[ 29]。
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  不具有促氧化作用：由于 CUPRAC 氧化还原反应的产物 Cu(I) 离子处于螯合状态（即 Cu(I)-Nc ），因此它不能作为促氧化剂对体液中的生物大分子造成氧化损伤。稳定的 Cu(I)-chelate 不会与过氧化氢发生反应，但可以发生逆反应，即 H ₂ O ₂ 与 Cu(II)-Nc 发生氧化反应。因此，在没有 H ₂ O ₂ 或其前体的情况下，与 Nc 螯合的 Cu(I) 可能不会在 Fenton 型反应中对测试的抗氧化剂起到促氧化剂的作用。
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  该方法无需复杂的设备和合格的操作人员，只需使用标准色度计，即可在传统实验室中轻松、多样地应用[ 37]。
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  在食品和医药中的适用性：根据戈林斯坦因等人（2006 年）协调的研究小组的研究，CUPRAC 测试显示了某些多样化食品提取物（其中包括猕猴桃、大蒜和洋葱）在实际 pH 值和氧化还原电位方面的可重复结果[ 38]。Bean 和他的团队（2009 年）描述了对兔子膀胱组织阻塞和控制内抗氧化反应性的比较分析，其中涉及两种不同的 TAC 测试。与 FRAP 试验不同的是，CUPRAC 试验发现，与对照膀胱组织相比，阻塞膀胱组织的肌肉和粘膜中的抗氧化剂显著减少。Bean 等人（2009 年）得出结论，CUPRAC 试验在生理 pH 值下可接受亲水性、亲油性抗氧化剂和含硫醇的抗氧化剂，因此是分析组织中抗氧化剂反应性的更好工具[39]。

 4.2.2.FRAP 试验

FRAP 试验是一种典型的基于 SET 的方法，用于测量铁离子（Fe ³⁺ ）-配体的复合物在酸性环境中通过抗氧化剂还原为深蓝色的亚铁复合物（Fe ²⁺ ）。抗氧化活性根据 593 纳米吸光度的增加来确定，结果以 Fe ²⁺ 的微摩尔当量或与标准抗氧化剂的关系来表示 [ 5]。与其他基于 SET 的方法不同，FRAP 试验在酸性 pH 条件下进行（pH = 3.6），以保持铁的溶解度。低 pH 值下的反应会降低驱动电子转移的电离电位，提高氧化还原电位，从而导致主导反应机制的转变[40]。

最初的 FRAP 试验使用三嗪基三嗪（TPTZ）作为铁离子的连接配体，同时也使用其他配体来结合铁离子，例如使用铁嗪来评估抗坏血酸的还原能力[ 41]。

最近，铁氰化钾已成为 FRAP 试验中最常用的铁试剂。在后一种情况下，普鲁士蓝作为一种最终产物可以通过分光光度法进行量化，并显示出所测试的抗氧化剂的还原能力。普鲁士蓝可能以两种不同的方式形成，但结果相同。抗氧化剂可以将溶液中的 ^{3 +} 铁还原成 ^{2 +} 铁，后者与铁氰化物结合生成普鲁士蓝；或者将铁氰化物还原成亚铁氰化物，后者与溶液中的游离铁 ^{3 +} 结合生成普鲁士蓝。

图 6 显示了这两个反应的简化方案（a）和颜色变化以及反应机理（b）[ 42]：

图 6.铁还原抗氧化能力（FRAP）反应机理。ArOH 表示酚类抗氧化剂，[ArOH] ⁺ 表示氧化的酚类抗氧化剂（a）；参与化学反应的复合物的化学结构和颜色变化（b）。

这种 FRAP 试验的缺点是普鲁士蓝容易沉淀，形成悬浮液并弄脏测量桶。因此，添加 Fe ³⁺ （FeCl ₃ ）的时间至关重要，可能会导致结果解释错误。为了稳定普鲁士蓝以防止沉淀物，Berker 等人（2010 年）建议加入十二烷基硫酸钠（一种抗张化合物）和最佳 pH 值，以保持铁离子的氧化还原活性并防止水解过程 [ 42]。作者认为，这种改进还可以评估氧化还原电位不超过传统 FRAP 试验中 Fe ³⁺ /Fe ²⁺ 的抗氧化剂，如硫醇型生理抗氧化剂。在没有随机甲基化β-环糊精（RMCD）溶解度增效剂的情况下，通过选择水/丙酮作为溶剂，FRAP 试验得到了进一步改进，可以同时测量亲水性和亲油性抗氧化剂，而这在传统的 FRAP 试验中是受限制的[ 43]。

FRAP 试验简单、快速、成本效益高，而且不需要专用设备。不过，Pulido、Bravo 和 Saura-Calixto（2000 年）报告说，FRAP 结果可能会根据抗氧化剂与 Fe ³⁺ 反应的观察分析时间而变化，分析时间从几分钟到几小时不等 [ 44]。因此，单点吸收终点可能并不代表完整的反应，因为各种抗氧化剂的检测需要不同的反应时间[8]。

FRAP 测试最近采用了电化学检测技术，以提高灵敏度、准确性和可重复性。人们开发了一种新的库仑滴定法，用于测定不同抗氧化剂材料的 FRAP 值[ 45]。在这种改进的 FRAP 方法中，抗氧化剂与库仑滴定剂（电生铁氰化离子）发生反应，滴定到终点（恢复初始电流时）所消耗的电能量可作为抗氧化能力下降的指标[46]。库仑滴定法 FRAP 试验在评估还原力方面具有极高的灵敏度、可靠性和简便性。FRAP 试验的另一种电化学方法是对抗氧化剂的还原力进行计时器测定。正如 Brainina、Varzakova 和 Gerasimova（2012 年）所证实的，K ₃ [Fe(CN) ₆ ]/K ₄ [Fe(CN) ₆ ]系统电位的变化与抗氧化剂的还原力间接相关。更确切地说，在某些电位下（高于 0.35 V），氧化过程只形成 K ₃ [Fe(CN) ₆ ]，而 K ₄ [Fe(CN) ₆ ]的浓度完全来自 K ₃ [Fe(CN) ₆ ]与抗氧化剂的反应，与抗氧化剂的还原力成正比 [ 47]。这种计时器测定法具有良好的检测限（例如抗坏血酸的检测限为 2 × 10 ⁻⁶ M），因此被提议用于评估生物样品的抗氧化活性。

一般来说，FRAP 试验作为一种基于非自由基 SET 的方法，被认为与脂质系统中发生的自由基消亡过程（HAT 机制）关系不大，与其他抗氧化活性测量方法的相关性也较低。因此，建议将该测试与其他方法结合使用，以区分不同抗氧化剂的主导机制[ 8]。

抗坏血酸（维生素 C）是一种重要的生理抗氧化剂[ 48]。许多植物都富含维生素 C，是重要的膳食补充剂，因为人们必须摄入维生素 C，但却无法合成或储存维生素 C。通过对 FRAP 试验进行简单调整，就可以在同一样品中以与 FRAP 试验相同的方式测量抗坏血酸[ 49]。改进后的检测方法被称为还原铁和抗坏血酸抗氧化能力分析法（FRASC），并与 HPLC 参考方法进行了比较验证[ 50, 51]。

氧化还原能力作为抗氧化活性指标的概念有多种应用方式。有几种基于过渡金属（铁和铜）的测试方法，如使用铁氰化钾、铁嗪、普鲁士蓝或铜离子代替铁-TPTZ[52]。此外，已开发的方法还使用了氧化还原电化学信号的变化[9]。不过，FRAP 试验是最常用的；它经过了充分验证，并已在食品、饮料、体液和其他类型的样品中产生了大量数据。不同的用户对其进行了各种修改。这些修改通常很小，涉及 pH 值、温度、校准方法、反应持续时间和报告单位的修改。然而，由于存在差异，很难对不同研究的结果进行比较。因此，除非有必要改变某个实验系列或某类样品的反应条件，否则 FRAP 试验应使用标准操作程序，这样才能将结果与使用相同方法公布的总抗氧化活性指数（NEAC）数据联系起来进行解释。如果在反应条件或持续时间、标准化或结果表达方式等方面进行了修改，则必须说明修改的理由并作出清楚的描述，同时应将修改后的方法与标准程序进行比较验证。

FRAP 试验在全球范围内得到了大规模应用，其结果可用于多种用途，包括估算食品中的抗氧化剂含量及其对抗氧化剂供应的贡献，研究贮藏、生长、吃水、太阳辐射、加工、膳食剂和宠物食品基因改造的影响，以及比较食品、药品、传统药物、草药、香料、茶叶和葡萄酒中抗氧化剂的相对含量，以促进产品的区分、质量、控制和开发。

FRAP 试验还可用于检测水污染，并用于研究辐射、污染、气候变化和太空旅行对生物体的影响。该测试的灵敏度和准确性很高，可以区分不同的样本，用于评估摄入食物、饮料、药品或补充剂后抗氧化剂的吸收和系统分布（"生物利用率"）。

F.T. Pastor 等人（2020 年）研究了抗氧化剂将铁(III)还原为铁(II)的还原反应的适用性，以开发测定抗氧化剂活性的电化学方法，该方法采用了直流极谱法和循环伏安法。之所以选择铁（III）/铁（II）氧化还原体系，不仅因为它是测量抗氧化剂活性的最简单分光光度法的基础，还因为它是化学中的标准可逆氧化还原体系。电化学方法简单快捷，无需根据标准（如三氯氧磷或没食子酸）进行校准，可用于测量十种天然抗氧化剂的抗氧化活性。所获得的结果与通过 FRAP、ABTS 和 DPPH 试验测量的相同抗氧化剂的抗氧化活性进行了比较[ 53]。

此外，FRAP 试验还被广泛用于研究生活方式、饮食、保健品、怀孕、年龄、性别、疾病、医疗、传统/替代疗法等因素对血浆、尿液、唾液、卵泡液、肺泡液、精液、泪液、脑脊液和粪便等生物液体总抗氧化活性的影响。在生物监测和补充研究中，FRAP 试验被用于人体调查以及各种动物、昆虫和海洋生物的样本。

4.2.3.Folin-Ciocalteu 法

Folin-Ciocalteu 试验是一种著名的测定总酚含量（TPC）的方法。Folin-Ciocalteu 试验被广泛用于临床和营养学研究，以测定植物源食品和生物样本中的总多酚含量。该方法最初设计用于分析蛋白质，但后来被 Singleton、Orthofer 和 Lamuela-Raventos（1999 年）采用，用于分析葡萄酒中的酚类成分，之后成为食品和植物提取物抗氧化评估的常规检测方法[ 54]。

目前，Folin-Ciocalteu 试验可从几个重要的商业协会获得，因此该方法被广泛用于定量检测植物提取物[55]以及食品和饮料[9]中的多酚。药典中包括 Folin-Ciocalteu 试验[9]，欧洲将其作为测量葡萄酒中总酚含量的官方程序（欧洲共同体，1990 年）。

Folin-Ciocalteu 检验法是将 Folin-Ciocalteu 试剂与酚类化合物在碱性状态下进行还原。Folin-Ciocalteu 试剂的确切化学性质尚不明确，但据认为它可能含有磷钼酸/磷钨酸的复合物，这些复合物被还原后得到一种蓝色发色团，其最大吸收波长为 765 纳米（图 7）[ 56]。复合物中的中心钼离子被接受为还原位点，Mo ⁶⁺ 离子通过接受酚类抗氧化剂提供的电子被还原为 Mo ⁵⁺ 。磷钨酸和磷钼酸的阴离子衍生物具有 α-Keggin 结构，蓝色络合物具有团簇型大轮结构 Mo154（图 8）[57]。

图 7.酚类化合物与磷钨酸和磷钼酸的衍生物在碱性环境中发生反应，通过 Folin-Ciocalteu 法形成蓝色 (a)；化验中观察到的颜色变化 (b)。

图 8.(A) 阴离子衍生物 [PM ₁₂ O ₄₀ ] ³⁻ 的 α-Keggin 结构，其中 M 代表钼（Mo）或钨（W）；(B) 蓝色复合物[Mo ₁₂₆ ⁶⁺ Mo ₂₈ ⁵⁺ O ₄₆₂ H ₁₄ (H ₂ O) ₇₀ ]的大轮结构。 ¹⁴⁻ .

因此，Folin-Ciocalteu 检验是一种基于 SET 的检验，它与酚类抗氧化剂的还原能力有关。没食子酸是常用的参考标准，TPC 结果通常以没食子酸当量表示。不过，TPC 结果有时也以儿茶素、咖啡酸、绿原酸或亚铁酸当量表示，这就需要对报告结果进行标准化[58]。

用于测量 TPC 的 Folin-Ciocalteu 分析法具有许多优点，包括简便、可重现性和稳健性。不过，它也有一些缺点。首先，该试验对 pH 值、温度和反应时间很敏感，因此必须准确选择反应状态，才能获得一致可靠的结果。其次，TPC 过高估计是 Folin-Ciocalteu 试验的一个主要问题，这是因为在还原 Folin-Ciocalteu 试剂时，体系中存在的非酚类还原剂会起到一定的作用[59]。这类污染物包括还原糖和某些氨基酸。因此，与 HPLC 方法相比，TPC 测量的结果可能会被高估一倍。此外，该测试是在水性体系中进行的，对亲脂性酚类的应用有限，除非对溶剂体系进行了改良。

为了提高 Folin-Ciocalteu 试验的耐久性并降低成本和时间，设计了一种用于食品样本[ 60] 和尿液样本[ 61] 的 96 微孔板方法。

通过 Folin-Ciocalteu 试验测定的尿液中多酚含量被用作多酚供应的生物标志物，并与心血管风险参数（如高血压）的降低、作为潜在放松剂的一氧化氮的增加[62]、血脂状况和血糖反应的改善[63]以及 DNA 氧化的降低相关联。另一个优势是认知能力的提高，这与富含多酚的食物供应量增加有关[64]。

B. Alcalde 等人（2019 年）根据多酚的化学结构对其抗氧化能力进行了评估。他们采用了几种测试方法，其中包括 Folin-Ciocalteu (FC)、FRAP 和 TEAC，以选择羟基数量和位置不同的多酚。此外，还使用丝网印刷碳电极在 -0.2 至 0.9 V（相对于 Ag/AgCl 参比电极）范围内记录伏安法，以研究这些物质的氧化行为。测试结果之间存在微弱的相关性，这意味着每种化合物的行为都会随着所用方法的不同而变化[ 65]。

4.3.混合模式测试（HAT/SET）

这些混合模式试验一般基于消除稳定的发色团（如 2,2′-叠氮双-3-乙基苯并鱼唑啉-6-磺酸（ABTS）和 2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）），其中 HAT、ET 和质子偶联电子转移（PCET）机制可能会根据相应的反应条件（如 pH 值和溶剂）以不同的比例发挥不同的作用[66]。混合模式试验（HAT/SET）主要包括 ABTS/Trolox 等效抗氧化能力（TEAC）试验、DPPH 自由基中和试验和 N,N-二甲基对苯二胺二盐酸盐（DMPD）自由基中和试验。

4.3.1.ABTS (TEAC) 试验

TEAC 试验最早由 Miller 及其团队（1993 年）开发，是一种用于测量总抗氧化能力（TAC）的简单方便的方法[ 67]。该试验测量抗氧化剂中和 2,2′-叠氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS ^•+ ）稳定自由基阳离子的能力，ABTS 是一种蓝绿色发色团，在 734 纳米波长处有最大吸收，其强度在抗氧化剂存在时会降低。ABTS ^•+ 可在强抗氧化剂的作用下由 ABTS 生成。蓝绿色的褪色程度（以吸光度骤降至 734 纳米来量化）取决于反应持续时间、内在抗氧化剂活性和样品浓度（图 9）。

图 9.ABTS 检测中的颜色变化（a）；2,2′-叠氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基阳离子清除活性检测中涉及的反应方案（b）。

在最初的 TEAC 试验中，使用甲氧血红蛋白和过氧化氢生成中间自由基渡甲氧基血红蛋白，然后与 ABTS 反应生成 ABTS ^•+ 。后来，氧化剂被过氧化物或过硫酸盐取代。过硫酸钾是生成 ABTS ^•+ 的最常见氧化剂。

从下面的反应中可以看出，在 ABTS/H ₂ O ₂ /过氧化物酶形成的体系中，ABTS 起着还原剂的作用，它将酶的启用形式（命名为化合物 I）替换为化合物 II，后者又返回到酶的初始形式（E）。

E（过氧化物酶的原生形式） + H ₂ O ₂ → 化合物 I + H ₂ O

化合物 I + ABTS → 化合物 II + ABTS ^•+ （ABTS 阳离子-自由基）

化合物 II + ABTS → E + ABTS ^•+

ABTS 会被氧化剂氧化成其自由基阳离子 ABTS ^•+ ，呈蓝绿色。此外，ABTS 自由基可溶于水和有机溶剂，因此可以测定亲水性和亲油性化合物的抗氧化能力。

Durmaz（2012 年）通过将 ABTS 与过氧化二硫酸钾混合，然后将所得溶液干燥并冷冻，制备了一种即用型 ABTS ^•+ 自由基粉末[ 68]。然后用这种冻干自由基粉末替代新鲜配制的溶液，作者证明了改良测试的线性和准确性。

蓝绿自由基阳离子 ABTS ^•+ 的预形成溶液漂白已被广泛用于评估复合物混合物的抗氧化能力，以诱导芳香醇的氧化反应，并形成相应的醛。此外，ABTS 还被用于通过漆酶测定对羟基苯甲酸和多酚化合物[ 69, 70]，以及通过过氧化物酶测定各种类黄酮[ 71]。在这两种情况下，酶反应的结果都会形成 ABTS-多酚复合物。

TEAC 试验用于测量纯净物质、体液和植物材料的总抗氧化能力。TEAC 试验与其他自由基中和方法类似，可以自动进行，并适用于微孔板和流动注射技术。它还可与 HPLC 联用，包括与 ABTS 自由基阳离子进行柱后反应，以方便鉴定复杂混合物中的单个抗氧化剂。HPLC-TEAC 提供了一种快速有效的方法来分离和鉴定源材料中的生物活性化合物[ 72]。当该方法与其他检测技术（如安培计法[ 73] 和傅立叶变换红外光谱法[ 74]）结合使用时，TEAC 检测的灵敏度和效率会更高。许多改良的 TEAC 检测方法使用 ABTS ^•+ 的在线酶生成，主要是那些采用连续通量系统的检测方法。例如，Milardovic 等人（2007 年）报道了通过分别固定在管式流动反应器中的葡萄糖氧化酶和过氧化物酶生成 ABTS ^•+ ，用于分析酒精饮料的 TEAC 值[ 75]。

ABTS 自由基清除法可在较宽的 pH 值范围内进行评估，这有助于研究 pH 值对食品成分抗氧化机制的影响。此外，ABTS 自由基可溶于水和有机溶剂，因此既能测定亲脂性化合物的抗氧化能力，也能测定亲水性化合物的抗氧化能力。对于类胡萝卜素、生育酚等亲脂性化合物，使用均相溶液来评估脂溶性抗氧化剂对脂质的抗氧化程度和保护能力。

根据 Miller 等人[ 76] 制定的有关类胡萝卜素抗氧化活性的估算方案，将这些物质溶解在丙酮中，然后用正己烷和丙酮（90:10 v/v）的混合物稀释，并以二氧化锰作为反应介质。Böhm 等人（2002 年）改变了这种方法，使用正己烷作为溶解类胡萝卜素的溶剂。溶解阶段之后是离心和测量下层蓝绿色亲水层的吸光度[ 77]。然而，这些试验导致类胡萝卜素和 ABTS ^•+ 在水环境中发生严重的反应问题[78]。

根据辣根过氧化物酶在有机环境中运行的能力，Cano 等人（2000 年）描述了一种在有机环境中直接产生阳离子的方法[79]。他们使用了多种溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜，随后确定了反应的动力学以及自由基的稳定性。使用乙醇介质时，过氧化物酶生成 ABTS ^•+ 自由基的时间约为 100 秒。这种生成 ABTS ^•+ 自由基的活性的缺陷与 ABTS 在这种环境中的溶解性有关[ 80]。亲水性和亲油性化合物的总抗氧化活性（TAA）是通过 ABTS ^•+ 自由基阳离子结合亲油抗氧化活性（LAA）和亲油活性（LAA）确定的。

Puangbanlang等人（2019年）首次报道了使用一种纸上装置作为简单、廉价和快速的检测平台，同时测定食品样品中的抗氧化活性和总酚含量。两种抗氧化活性测试（包括阳离子自由基分析（ABTS）和铜离子还原抗氧化能力分析（CUPRAC））以及总酚含量测试（Folin-Ciocalteu 测试（FC））同时使用。该装置由一个中央采样区和四个连续的预处理和检测区组成，预处理和检测区负责主持所有三项测试，并对样品进行见证测量。测试方法是将样品固定在取样区，使其流经预处理区和检测区，预处理区和检测区都储存有用于每种抗氧化剂测试的试剂，从而引发颜色变化，并通过光比色法测量颜色变化。测试优化包括关键试剂的浓度、反应时间和表面调整，以获得灵敏度高、线性域宽的测试结果。随后对各种抗氧化剂标准进行了评估，以确定该方法的分析特性。纸上检测法成功地检测了 10 种饮料中的抗氧化活性和总酚含量，其没食子酸当量（GAE）值与传统检测法获得的值相似，置信区间为 95%。此外，纸上测试的三次分析所得到的样品的没食子酸当量值之间具有很好的相关性，皮尔逊相关系数相对较高。这些结果表明，纸质测试结果准确，适用于同时分析实际样品中的抗氧化活性和总酚含量[ 81]。

ABTS 试验的优势

• 
  TEAC 试验可测定多种抗氧化物质，因为 ABTS ^•+ 自由基会与食品成分中的合成和天然抗氧化物质（即酚、氨基酸、肽、维生素 E 和维生素 C）迅速发生反应[ 82]。
• 
  TEAC 抗氧化测试可用于较宽的 pH 值范围，但在许多情况下，测量抗氧化活性的样品可能会影响 pH 值[83]。这是因为反应机制可能随 pH 值的变化而变化，例如，酸性条件有利于电子转移[84]。
• 
  ABTS ^•+ 在缓冲和有机环境中的溶解性促使人们开发了亲水和亲油抗氧化活性的测定方法[ 80]，这些方法的总和可以准确测定产品的抗氧化能力[ 85]。
• 
  TEAC 检测仪价格便宜，操作简单。

ABTS 试验的缺点

在动力学测试中，TEAC 测试所涉及的反应是不确定的，因为测试物质可能会与氧化剂、酶和自由基阳离子发生反应，从而得到一个过高的值[ 86]。虽然褪色测试可以解决这个问题，但由于程序和机制的问题，还会出现其他缺点[ 87]。

TEAC 检测法也受到了质疑，因为它使用了食品或生物系统中不存在的人工 ABTS 自由基阳离子，缺乏生物相关性[ 88]。

许多酚类化合物的氧化还原电位较低，因此可与 ABTS ^•+ 发生反应。此外，TEAC 反应可能与缓慢反应不同，可能需要很长时间才能达到终点。在这种情况下，使用持续时间较短的终点（4 或 6 分钟）可能会导致在反应结束前读数而低估抗氧化能力[ 89]。

4.3.2.DPPH （2,2-二（4-叔辛基苯基）-1-苦基肼）试验

DPPH 自由基的特征

DPPH 是一种 π-自由基，以单体形式存在于固态和溶液中。最初的结构数据显示，DPPH 独特的低反应性主要受 "分子周围部分对肼结构的有效筛选 "影响，而较少受扩展共轭作用的影响[ 90]。研究证实，虽然移除对硝基的影响很小，但移除负责保护邻硝基的基团会显著提高反应活性。此外，两个苯基基团都是扭曲的也会对共轭稳定性产生不利影响。

这种自由基可溶于不同的有机溶剂，但不溶于水。它通常溶于甲醇、乙醇或它们的水性混合物。在这种情况下，水的含量不应超过 60%，以使自由基更容易溶解[91]。在含水量较高的情况下，溶解的 DPPH 的典型五元光谱会转化为单色光谱，这是固态自由基的典型特征。自由基溶解度的这种变化并不总是显而易见的。

中和 DPPH 试验是通过抗氧化剂提供电子来中和 DPPH 自由基。反应伴随着在 517 纳米波长下测量的 DPPH 颜色的变化，变色可作为抗氧化剂活性的指标（图 10）。DPPH 中和法的抗氧化活性通常用 EC ₅₀ 来表示，它被定义为将初始 DPPH 浓度降低 50%所需的抗氧化剂有效浓度。此外，还可以使用 T _EC50 ，即达到 EC ₅₀ 平衡状态所需的时间 [ 92]。

图 10.抗氧化剂（AH）清除 DPPH 的机制。

DPPH 测试是一项简单的技术，只需要一台 Vis 分光光度计或电子顺磁共振（EPR）光谱仪。不过，DPPH 并非天然自由基，但其与抗氧化剂的反应机理与过氧自由基 ROO 相似[ 93]。

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  涉及 DPPH 自由基的分析方案多种多样。制定分析方案似乎很简单。该自由基可自由溶解于甲醇或乙醇中，这些溶剂也可溶解大多数具有技术或功能意义的抗氧化剂。然而，还有许多其他因素，如反应时间（固定时间或动力学研究）、温度（室温或高温）和结果表达式等，都是被广泛研究的分析变量。许多评论和研究文章都提到了分析细节、方案变化和创新，如将反应监测波长从 515 纳米改为 580 纳米，以尽量减少类胡萝卜素造成的干扰[94]；通过 HPLC-PDA 检测器将被测化合物与自由基分离，以避免光谱重叠[95]；或通过 HPLC 柱后配置估算混合物中单个化合物的总抗氧化活性[96, 97]。为了评估化合物或提取物的自由基消除活性，Brand-Williams 等人（1995 年）提出的方案仍然是参考标准[9]。
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  测试用户可分为两大类：一类是将测试作为化合物或提取物比较评估的简单、快速、充分的测试；另一类是对抗氧化剂的机理/结构-活性关系或提取物活性的重要评估感兴趣的用户。
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  Cheng 等人（2006 年）提出了另一种建议，即测量 DPPH 分解曲线下的面积（AUC）[98]，这种方法已经用于其他抗氧化活性测试，如氧自由基吸收能力（ORAC）[8]。这种方法考虑了反应的动力学和热力学特性，并将结果与参考产品的 AUC 相比较。
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  为了尽量减少与检测灵敏度相关的问题，简化检测方法并使其自动化，不同的作者提出了检测调整方案[ 96]。Musa 等人（2013 年）研究了在基于微孔板的自动测试中使用 DPPH 干剂替代新鲜制备的 DPPH。改良方法通过经典的 DPPH 试验进行了验证，据作者称，该方法显示出极佳的灵敏度，操作更简单、更方便，所需的溶剂量极少[ 99]。
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  DPPH 自由基的中和可通过安培检测法进行监测。施加电压时，DPPH 自由基会产生恒定电流，抗氧化剂中和后自由基数量的减少会导致安培信号的减少。因此，抗氧化剂的定量是通过安培检测未反应的 DPPH 自由基的残留浓度来实现的。Sireerat 和 Schulte（2012 年）通过自动安培 DPPH 试验测量了茶饮料、果汁和蔬菜提取物的抗氧化活性，其中抗氧化能力的测量是以 DPPH 自由基作为氧化还原安培指示剂进行的。使用铅笔作为工作电极，反电极为铂电极，参比电极为银/氯化银电极。已知浓度的合成抗氧化剂对该方法进行了验证[ 100]。
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  DPPH 法被用于评估酚类化合物的抗氧化能力[ 101]，而 Sun-Kun Yim 等人则设计了一种连续分光光度法，用于在乙醇-水混合溶液中通过 NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还原形式）-细胞色素 P450 还原酶（CPR）还原 DPPH[ 102]。

E. Abuin 等人[103] 解释了尿酸与胶束中的 DPPH 的反应，而 D. Bandoniene 及其同事[104] 则通过 DPPH 和 HPLC-DPPH 方法检测了乙醇-水混合溶液中化合物消除自由基的活性。为了研究氨基酸的氧化动力学，G. Ionita 等人使用了一种水溶性 DPPH 衍生物[ 105]。

此外，还有关于电化学方法测量抗氧化剂活性的报道，这种方法基于生物传感器，使用循环伏安法作为检测技术[106]，测量叔丁基羟基苯甲醚的抗氧化能力[107]。这些方法被用于研究一些低分子量抗氧化剂的效率。

S. Milardović 等人[ 108] 描述了另一种基于 DPPH 在玻璃碳电极上的安培还原测定抗氧化活性的方法。该方法适用于评估某些可溶于水或乙醇的纯化合物、某些抗氧化剂以及某些茶、酒和其他饮料样品的抗氧化活性。所提出的安培法和传统的光谱法获得了良好的测量相关性（R ² = 0.9993），以特罗环当量表示。

最近，Xie 和 Schaich（2014 年）对 DPPH 试验进行了重新评估，以便通过动力学和化学计量学方法确定抗氧化剂的活性。作者对用 DPPH 试验对抗氧化剂进行分类提出了质疑，并认为可以用它来区分抗氧化剂的反应机制，即 SET 和 HAT，它们在各种溶剂中显示出不同的反应速率和模型[ 109]。

Masek 等人（2016 年）通过电化学方法、ABTS 和 DPPH 试验，研究了羟基氨基甲酸类植物源化合物的抗氧化活性[ 110]。根据 FRAP 和 CUPRAC 方法，通过分光光度分析测量了这些天然化合物还原铁和铜离子的潜力。这两种方法，即电化学法和分光光度法，都可以对植物化学样本进行定性分析。

El Moussaoui 等人（2019 年）评估了薇甘菊根和叶的抗菌、抗真菌和抗氧化活性。多酚含量通过 Folin-Ciocalteu 反应测定，抗氧化活性的测定采用四种方法：DPPH 试验、FRAP 试验、总抗氧化能力和 β-胡萝卜素褪色试验[ 111]。

DPPH 试验通常用于评估植物提取物的抗氧化活性。为了测试硼酸盐对 DPPH 试验可能产生的干扰，X. Chen 等人（2020 年）研究了硼酸盐（0-16 mM 四硼酸钠）对没食子酸（GA，10、20 和 40 mg/L）自由基中和能力的影响。硼酸盐的存在导致没食子酸对 DPPH 的抑制作用明显降低，其 DPPH 自由基中和能力可能随硼酸盐含量的增加而降低。这种干扰被解释为是 GA 自氧化以及 GA-硼酸酯复合物在碱性 pH 值（约 9.50）下形成的结果。从苹果皮、欧芹叶和绿色莴苣（硼酸盐含量可能较高的例子）中提取的天然多酚在富含硼酸盐时对 DPPH 自由基的中和能力也很低。为了避免这一缺点，有人建议在制备样品时使用 pH 值为 5.50 的醋酸棉条。这篇论文强调，通过 DPPH 试验，可能会低估主要来自用富硼或硼酸盐预处理过的植物的多酚提取物的抗氧化特性[ 112]。

DPPH 法的优势

应用这种检测方法可以理解各种化学现象，而且具有明显的优势，如成本低、易于进行实验、可重复性强、可在室温下使用以及可实现自动化。这也解释了为什么科学界仍在使用 DPPH 试验，并致力于优化/规范试验方案，以获得显著的可比结果。

5.结论和未来趋势

由于抗氧化剂在食品中对氧化变质和在人体中对氧化应激介导的病理过程具有保护作用，因此食品领域的科学家和医学专家对抗氧化剂越来越感兴趣。要有效地研究天然抗氧化剂的来源和设计新的抗氧化化合物，就必须采用可靠的抗氧化活性评估方法。

测量抗氧化剂活性的常规方法仍然需要，具体的方法规程比较复杂，需要较长的测试时间。抗氧化测试的重要选择参数之一是工作 pH 值。有在酸性（FRAP）、中性（CUPRAC）或碱性（Folin-Ciocalteu）条件下进行的测试。

此外，抗氧化剂测试对亲水性和亲油性抗氧化剂的适用性也是一个重要因素。ABTS 和 CUPRAC 试验可同时测量亲水性和亲油性抗氧化剂，但有些方法只能测量亲水性抗氧化剂（FRAP 和 Folin-Ciocalteu），有些方法则只适用于疏水性体系（DPPH）。

同时，食品基质中的背景颜色可能会引起吸光度的改变，与颜色形成反应（FRAP、CUPRAC）相比，褪色反应（ABTS、DPPH）的不利影响更为显著[9]。

因此，该研究领域具有巨大的潜力，可以开发新的分析方法来确定化合物的抗氧化能力，尤其是食品中的抗氧化能力。例如，开发电化学生物传感器并将其用于抗氧化研究可能会引起极大兴趣，并有助于研究过程动力学。生物识别中使用的大量元素，如酶、适配体、DNA/RNA 和整个细胞，是开发适用于抗氧化剂研究的电化学生物传感器的关键因素。在研究复杂样品中的抗氧化剂时，生物传感器的优势在于便携性、快速测量和使用少量样品。