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DNA 低甲基化使早期前列腺癌和 CTC 中的抗肿瘤免疫基因沉默
DNA 低甲基化使早期前列腺癌和 CTC 中的抗肿瘤免疫基因沉默
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总结 总结
癌症的特征是大染色质结构域的低甲基化相关沉默，其对肿瘤发生的贡献尚不确定。通过高分辨率全基因组单细胞 DNA 甲基化测序，我们鉴定了 40 个核心结构域，这些核心结构域从前列腺恶性肿瘤的最早可检测阶段到转移性循环肿瘤细胞 （CTC） 均次低甲基化。嵌套在这些抑制结构域中的是较小的基因座，这些基因座保留了甲基化，可以逃避沉默并富集细胞增殖基因。核心低甲基化结构域内的转录沉默基因富集为免疫相关基因;其中最突出的是一个基因簇，其中包含向NKT细胞呈递脂质抗原的所有五个CD1基因，以及四个与先天免疫有关的IFI16相关干扰素诱导基因。CD1 或 IFI16 小鼠直系同源物在免疫功能正常的小鼠中重新表达可消除肿瘤发生，同时激活抗肿瘤免疫。因此，早期的表观遗传变化可能会影响肿瘤发生，靶向确定的染色体位点内的共位基因。在富含 CTC 的血液标本中可检测到低甲基化结构域。
癌症的特征是大染色质结构域的低甲基化相关沉默，其对肿瘤发生的贡献尚不确定。通过高分辨率全基因组单细胞 DNA 甲基化测序，我们鉴定了 40 个核心结构域，这些核心结构域从前列腺恶性肿瘤的最早可检测阶段到转移性循环肿瘤细胞 （CTC） 均次低甲基化。嵌套在这些抑制结构域中的是较小的基因座，这些基因座保留了甲基化，可以逃避沉默并富集细胞增殖基因。核心低甲基化结构域内的转录沉默基因富集为免疫相关基因;其中最突出的是一个基因簇，其中包含向NKT细胞呈递脂质抗原的所有五个CD1基因，以及四个与先天免疫有关的IFI16相关干扰素诱导基因。CD1 或 IFI16 小鼠直系同源物在免疫功能正常的小鼠中重新表达可消除肿瘤发生，同时激活抗肿瘤免疫。因此，早期的表观遗传变化可能会影响肿瘤发生，靶向确定的染色体位点内的共位基因。在富含 CTC 的血液标本中可检测到低甲基化结构域。
关键词：DNA低甲基化，前列腺癌，循环肿瘤细胞，免疫监视，单细胞测序
简述 简述
对循环肿瘤簇细胞的分析揭示了早期前列腺肿瘤发生过程中的DNA低甲基化如何沉默免疫监视基因，同时保留增殖相关基因。
对循环肿瘤簇细胞的分析揭示了早期前列腺肿瘤发生过程中的DNA低甲基化如何沉默免疫监视基因，同时保留增殖相关基因。
介绍 介绍 介绍
癌症的特征是DNA甲基化水平的两个主要变化1–4.CpG 岛的局灶性高甲基化通常位于基因调控区域内，导致基因沉默，这是一种公认的肿瘤抑制基因失活机制5-7.此外，长程低甲基化区域，部分甲基化结构域 （PMD），与核层相关结构域 （LAD） 和大组织染色质赖氨酸 （K） （LOCK） 结构域重合8–10.这些染色体位点很大 （>100 kb），基因贫乏，与晚期复制的 DNA 相关，并且在拓扑学上与核层相关。PMDs中的重复序列和逆转录元件可能在癌症中被去抑制，但稀有的蛋白质编码基因被沉默11.两种与抑制相关的染色质修饰是显而易见的：H3K9me3 在低甲基化嵌段中丰富，而 H3K27me3 表示它们的边界12,13.相互矛盾的模型表明，低甲基化阻滞要么是细胞转化的直接结果14，或细胞增殖过度的偶然结果13,15.低甲基化相关基因沉默的功能后果，以及塑造这些结构域的潜在选择压力，尚不清楚。最近一项针对晚期结肠癌的研究提出了一种内在的肿瘤抑制机制，可以对抗细胞增殖13，尽管全基因组低甲基化在晚期癌症中广泛存在，并且可能无法揭示有助于早期肿瘤发生的特定靶点。
癌症的特征是DNA甲基化水平的两个主要变化 1–4 .CpG 岛的局灶性高甲基化通常位于基因调控区域内，导致基因沉默，这是一种公认的肿瘤抑制基因失活机制 5-7 .此外，长程低甲基化区域，部分甲基化结构域 （PMD），与核层相关结构域 （LAD） 和大组织染色质赖氨酸 （K） （LOCK） 结构域重合 8–10 。这些染色体位点很大 （>100 kb），基因贫乏，与晚期复制的 DNA 相关，并且在拓扑学上与核层相关。PMDs中的重复序列和逆转录元件在癌症中可能会去抑制，但稀有的蛋白质编码基因却被沉默 11 了。两种与抑制相关的染色质修饰是显而易见的：H3K9me3 在低甲基化嵌段中丰富，而 H3K27me3 表示它们的边界 12,13 。相互矛盾的模型表明，低甲基化块要么是细胞转化 14 的直接结果，要么是细胞过度增殖的偶然结果 13,15 。低甲基化相关基因沉默的功能后果，以及塑造这些结构域的潜在选择压力，尚不清楚。最近一项关于晚期结肠癌的研究提出了一种内在的肿瘤抑制机制，可以对抗细胞增殖 13 ，尽管全基因组低甲基化在晚期癌症中很广泛，并且可能不会揭示有助于早期肿瘤发生的特定靶点。
值得注意的是，前列腺癌的特征是缓慢地从细胞增殖水平低的癌前病变发展到更具侵袭性并最终转移性的恶性肿瘤。根据组织学分级，局限性前列腺癌可分为惰性（格里森评分 （GS） 6）或具有临床意义 （GS≥7），反映了分化、增殖指数和转移潜力的差异16,17.GS6 肿瘤通常无需治疗即可安全监测，而更具侵袭性的 GS7 及以上肿瘤则通过手术切除或放疗联合雄激素剥夺疗法进行治疗。GS8-10 表示低分化肿瘤，预后不良且转移倾向高。早期肿瘤的多个异质性病灶通常分散在整个前列腺中，使大量分子表征复杂化，需要使用单细胞分析策略进行仔细解剖。相反，晚期转移性前列腺癌主要影响骨骼，因此难以进行活检以研究播散性肿瘤沉积物。循环肿瘤细胞 （CTC） 包含从血液中分离出的潜在转移前体，因此能够对晚期前列腺癌进行单细胞分析。免疫检查点阻断 （ICB） 通常对治疗前列腺癌无效18-21，可能反映了原发性前列腺癌富含基质的免疫抑制环境，但肿瘤细胞自主机制也可能在原发性和转移性疾病中有所贡献。影响免疫调节基因表达和调节前列腺癌对免疫治疗反应性的表观遗传变化尚未得到表征。
除了生物学意义外，癌症相关的甲基化变化对于基于血液的癌症检测具有相当大的分子诊断意义。这些主要依赖于血浆中循环的短DNA片段（170bp）中富含CpG岛的甲基化，其中一部分是肿瘤来源的（ctDNA）22-24.然而，在局限性前列腺癌患者中，只有 11.2% 可使用血浆 CpG 岛高甲基化测定法检测到25，这让我们不禁要问，CTCs内低甲基化结构域提供的大基因组覆盖率是否可以提供补充信息。为了解决这些问题，我们首先建立了来自多个患者和癌细胞系的单个前列腺CTC内低甲基化结构域的全基因组、高分辨率单细胞亚硫酸氢盐测序，确定了40个核心PMD，这些PMD在转移性前列腺癌中共享。前列腺肿瘤发生过程中 DNA 低甲基化的时间表明，核心 PMD 早在惰性 GS6 肿瘤时就被低甲基化，确定了单个显性基因组位点，即 CD1A-IFI16 基因簇，包括整个 CD1 脂质抗原呈递基因家族和多个与先天免疫有关的干扰素诱导基因。早期低甲基化介导的基因沉默指向具有生物学和诊断意义的特定致瘤途径。
结果 结果
鉴定单个转移性前列腺癌细胞的共享核心 PMD 和 PMI
鉴定单个转移性前列腺癌细胞的共享核心 PMD 和 PMI
为了表征单个转移性前列腺癌细胞的全基因组 DNA 甲基化特征，我们富集了来自五名去势抵抗性前列腺癌患者的 CTC，这些患者都具有多发性骨转移和激素治疗难治性疾病，并进行了单个细胞显微操作和单细胞测序26,27(表 S1，请参阅方法）。我们将 44 个单 CTC 与来自 4 个前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、PC3 和 22Rv1）和 2 个未转化前列腺上皮细胞系（人前列腺上皮细胞 （HPrEC） 和良性前列腺肥大细胞 （BPH-1））的 40 个单细胞进行了比较。HPrECs代表正常的前列腺上皮细胞，而BPH-1细胞与癌症前体具有共同的管腔细胞特征28-31.作为对 CTC 富集临床标本中污染血细胞的对照，我们将单个前列腺细胞与来自四名年龄匹配的健康男性的 13 个微流控处理的单个白细胞 （WBC） 进行了比较。为了确认单个 CTC 的身份，我们采用了单细胞多组学测序，以实现从单个细胞的细胞质中分离细胞核，对前者进行单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序 （scBS-seq）32后者为单细胞RNA-seq（SMART-seq2）33 (图1A，请参阅方法）。平均而言，我们为每个单细胞 DNA 甲基化测序样本检测到 900 万个 CpG 位点，为每个单细胞 RNA-seq 文库检测到 5,790 个基因 （RPM>0）（图 S1A 和 S1B）。前列腺 CTC 的转录组证实了预期的谱系特异性和上皮转录本的表达，并且没有造血标志物 （图 1B和 S1C）。对所有单细胞RNA-seq数据进行无监督分层聚类分析，揭示了三种不同的聚类：白细胞、正常前列腺癌和前列腺癌（包括CTC和前列腺癌细胞系）（图S1D）。除转录确认外，所有前列腺CTC均表现出从单细胞DNA甲基化测序推断的广泛DNA拷贝数变异（CNV）（参见方法）。这些 CNV 模式与从来自同一单细胞的细胞质 RNA-seq 推断的模式相匹配 （图 1C、S1E 和 S1F）。作为对照，HPrEC 细胞和 WBC 显示正常的二倍体拷贝数 （图 1C，请参阅方法）。作为最终测试，启动子甲基化模式的主成分分析（PCA）很容易将所有肿瘤细胞与正常对照区分开来（图S2A）。总而言之，我们应用了非常严格的标准，包括转录和DNA拷贝数确认，以提名38/44（86.4%）最初选择的CTC作为真正的前列腺CTC进行详细的单细胞基因组分析。
为了表征单个转移性前列腺癌细胞的全基因组 DNA 甲基化特征，我们富集了来自五名去势抵抗性前列腺癌患者的 CTC，这些患者都具有多发性骨转移和激素治疗难治性疾病，并进行了单个细胞显微操作和单细胞测序 26,27 （ 表 S1，见方法）。我们将 44 个单 CTC 与来自 4 个前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、PC3 和 22Rv1）和 2 个未转化前列腺上皮细胞系（人前列腺上皮细胞 （HPrEC） 和良性前列腺肥大细胞 （BPH-1））的 40 个单细胞进行了比较。HPrECs代表正常的前列腺上皮细胞，而BPH-1细胞与癌症前体具有共同的管腔细胞特征 28-31 。作为对 CTC 富集临床标本中污染血细胞的对照，我们将单个前列腺细胞与来自四名年龄匹配的健康男性的 13 个微流控处理的单个白细胞 （WBC） 进行了比较。为了确认单个CTC的身份，我们采用了单细胞多组学测序，以实现从单个细胞的细胞质中分离细胞核，使前者接受单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序（scBS-seq）， 32 后者接受单细胞RNA-seq（SMART-seq2）（ 33 图1A，参见方法）。平均而言，我们检测到每个单细胞DNA甲基化测序样本的900万个CpG位点，以及每个单细胞RNA-seq文库的5,790个基因（RPM>0）（图S1A和S1B）。前列腺CTC的转录组证实了预期的谱系特异性和上皮转录本的表达，并且没有造血标志物（图1B和S1C）。对所有单细胞RNA-seq数据进行无监督分层聚类分析，揭示了三种不同的聚类：白细胞，正常前列腺和前列腺癌（包括CTC和前列腺癌细胞系）（图S1D）。 除转录确认外，所有前列腺CTC均表现出从单细胞DNA甲基化测序推断的广泛DNA拷贝数变异（CNV）（参见方法）。这些 CNV 模式与从来自同一单细胞的细胞质 RNA-seq 推断的模式相匹配（图 1C、S1E 和 S1F）。作为对照，HPrEC细胞和白细胞显示正常的二倍体拷贝数（图1C，参见方法）。作为最终测试，启动子甲基化模式的主成分分析（PCA）很容易将所有肿瘤细胞与正常对照区分开来（图S2A）。总而言之，我们应用了非常严格的标准，包括转录和DNA拷贝数确认，以提名38/44（86.4%）最初选择的CTC作为真正的前列腺CTC进行详细的单细胞基因组分析。
单个转移性前列腺癌细胞中的部分甲基化结构域 （PMD） 和保留的甲基化岛 （PMI）。
（A） 四氯化碳富集示意图（104-fold leukocyte depletion），以及来自单个前列腺 CTC 的配对 DNA 甲基化测序（细胞核）和 RNA-seq（细胞质）。
（B） 使用前列腺谱系和上皮细胞与白细胞标志物的严格 RNA 表达阈值确认 CTC 身份。上皮（KRT7、KRT8、KRT18、KRT19、EPCAM）和前列腺标志物（AR、KLK3、FOLH1、AMACR）的最大log10（RPM）表达与白细胞标志物（CD45、CD16、CD37、CD53、CD7、CD66b）作图。在分析中仅使用没有白细胞污染的确认的 CTC（红叉）。
（B） 使用前列腺谱系和上皮细胞与白细胞标志物的严格 RNA 表达阈值确认 CTC 身份。上皮（KRT7、KRT8、KRT18、KRT19、EPCAM）和前列腺标志物（AR、KLK3、FOLH1、AMACR）的最大log10（RPM）表达与白细胞标志物（CD45、CD16、CD37、CD53、CD7、CD66b）作图。在分析中仅使用没有白细胞污染的确认的 CTC（红叉）。
（C） 与二倍体正常前列腺上皮细胞 （HPrEC） 和健康供体来源的白细胞相比，对两名患者的个体 CTC 进行代表性 DNA 拷贝数变异 （CNV） 分析。利用单细胞DNA甲基化测序数据推断DNA拷贝数。
（C） 与二倍体正常前列腺上皮细胞 （HPrEC） 和健康供体来源的白细胞相比，对两名患者的个体 CTC 进行代表性 DNA 拷贝数变异 （CNV） 分析。利用单细胞DNA甲基化测序数据推断DNA拷贝数。
（D） 跨越 8 号染色体的 DNA 甲基化的 IGV 表示 （hg19），显示来自 4 名患者（GU114、GU216、GU181 和 GURa15）的 37 个个体 CTC 和来自前列腺癌细胞系的 17 个细胞（LNCaP、PC3、VCaP、22Rv1）的广泛 PMD（黄色）。作为对照，显示了 4 个正常块状前列腺组织 （NP）、来自两个前列腺上皮细胞系（HPrEC、BPH-1）和正常白细胞 （WBC） 的 36 个细胞。正常甲基化水平（蓝色）。
（D） 跨越 8 号染色体的 DNA 甲基化的 IGV 表示 （hg19），显示来自 4 名患者（GU114、GU216、GU181 和 GURa15）的 37 个个体 CTC 和来自前列腺癌细胞系的 17 个细胞（LNCaP、PC3、VCaP、22Rv1）的广泛 PMD（黄色）。作为对照，显示了 4 个正常块状前列腺组织 （NP）、来自两个前列腺上皮细胞系（HPrEC、BPH-1）和正常白细胞 （WBC） 的 36 个细胞。正常甲基化水平（蓝色）。
（英-法）IGV 中 8 号染色体的分辨率更高，显示单个 CTC 和前列腺癌细胞系共享的精确 PMD 边界（图 E），嵌套 PMI 的放大视图，括起几个基因，保留甲基化的精确边界两侧是深度低甲基化（图 F）。
（英-法）IGV 中 8 号染色体的分辨率更高，显示单个 CTC 和前列腺癌细胞系共享的精确 PMD 边界（图 E），嵌套 PMI 的放大视图，括起几个基因，保留甲基化的精确边界两侧是深度低甲基化（图 F）。
（G-H）编码基因的成分和重复序列的类别在PMDs与PMIs中差异富集（图G），重复序列的亚型之间存在差异（图H）。ns，不显著;*P<0.05;**P<0.01，通过排列检验评估。
（G-H）编码基因的成分和重复序列的类别在PMDs与PMIs中差异富集（图G），重复序列的亚型之间存在差异（图H）。ns，不显著;*P<0.05;**P<0.01，通过排列检验评估。
我们通过将基因组分箱到 100 kb 窗口来量化单个细胞的甲基化水平：正常细胞的甲基化分布是单峰的，单峰接近 80% 甲基化，而几乎所有肿瘤样本都表现出双峰分布，具有不同数量的低甲基化区域（图 1D–1楼和 S2B，请参阅方法）。总体而言，DNA低甲基化在患者来源的前列腺CTC和前列腺癌细胞系中占基因组的20-40%，但在正常前列腺细胞或血细胞中占<2.5%（图S2C）。与单个 CpG 岛 （CGI） 相比，CGI 通常在基因调控区域周围表现出局灶性高甲基化，前列腺肿瘤细胞中的低甲基化区域跨越非常大的基因贫乏区域，与先前描述的 PMD 一致。总的来说，我们在前列腺癌基因组中鉴定了1,496个平均大小为1.2 Mb（范围为250 kb至9.2 Mb）的PMD，这一数字与先前基于多种晚期癌症中大量肿瘤测序的测量结果一致8,12,34 (图S2D，表S2）。值得注意的是，在染色体范围的视图上，由于单细胞甲基化分析提供了高分辨率，一些PMD被较小的区域打断，其中DNA甲基化被保留（图 1D–1楼).我们称这些为保留甲基化岛（PMI，参见方法中的定义标准）（图S2D，表S2）。与大型基因贫乏的 PMD 相比，散布在低甲基化结构域中的 1,412 个 PMI 富含基因，具有清晰的甲基化边界，包围着单个基因或一小群基因（平均 PMI 大小 1.3Mb;范围 30.8 kb 至 11.1 Mb）（图 1F和和1G）。1克).PMIs的鉴定提出了一种可能性，即选择压力可能会在PMDs中嵌套的少量基因上保留甲基化，并可能保留基因表达。
正如在其他癌症中所证明的那样12,13,35，PMDs基因贫乏，并且对某些内源性逆转录病毒元件（ERV）具有很强的富集性，特别是长末端重复序列（LTR）。相比之下，前列腺癌中的 PMI 基因丰富，相对缺乏长散布核元件 （LINE） 和 LTR（图 1G和和1H）。1小时).先前的研究表明，乳腺癌和结肠癌中的PMD表现出活性染色质标记（H3K4me1/3，H3K27ac，H3K36me3）的耗竭和抑制性组蛋白修饰的富集，包括结构域中心的H3K9me3和其边界的H3K27me312,13.为了确认前列腺癌中的这些染色质变化，我们使用培养的细胞系，使用 ChIP 检测分析染色质景观。前列腺癌细胞（LNCaP 和 22Rv1）的分析证实了抑制性 H3K9me3 标记在中心和 H3K27me3 在低甲基化结构域边界的差异定位 （图2A,，2B2乙和 S3A）。然而，癌细胞与相同 PMD 下未转化的前列腺上皮细胞和基底细胞（HPrEC 和 BPH-1）的直接比较表明，与恶性肿瘤相关的变化主要与 H3K27me3 沉积有关。事实上，Cut and Run 检测显示，与正常细胞相比，癌细胞中 PMD 边界处的 H3K27me3 显著富集，而中心 H3K9me3 标记在这些位点上丰富，但在正常细胞和癌细胞之间是不变的 （图 2B–二 维和和 S3A–S3C）。因此，癌细胞中低甲基化相关的基因沉默主要与这些染色体结构域侧翼的 H3K27me3 组蛋白修饰的获得相关。相比之下，PMI 中的基因显示出强烈的激活富集（H3K4me1/3、H3K27ac 和 H3K36me3）和无抑制（H3K27me3 和 H3K9me2/3）（图2A).
前列腺癌 PMD 中获得的染色质标记和共享核心 PMD 的提名。
（A） 前列腺癌 PMD 和 PMI 中染色质标记的差异富集。ENCODE 中 PC3 细胞的 ChIP-seq 数据集中带注释的染色质标记 （https://www.encodeproject.org/）。ns，不显著;*P<0.05;**P<0.01，通过排列检验评估。
（A） 前列腺癌 PMD 和 PMI 中染色质标记的差异富集。来自 ENCODE 中 PC3 细胞的 ChIP-seq 数据集的注释染色质标记 （ https://www.encodeproject.org/）。ns，不显著;*P<0.05;**P<0.01，通过排列检验评估。
（B）与培养的良性前列腺增生细胞（BPH-1;2个生物学重复，绿线）和正常前列腺上皮细胞（HPrEC;2个生物重复，蓝线）相比，前列腺癌细胞（LNCaP;3个生物重复，红线）中整个基因组中PMD的沉默染色质标记的差异富集。在整个基因组中，前列腺癌细胞获得 H3K27me3，在 PMD 边界处水平最高（左图），而癌症和未转化的前列腺细胞（右图）之间对 PMD 中心的 H3K9me3 富集没有改变。
（B）与培养的良性前列腺增生细胞（BPH-1;2个生物学重复，绿线）和正常前列腺上皮细胞（HPrEC;2个生物重复，蓝线）相比，前列腺癌细胞（LNCaP;3个生物重复，红线）中整个基因组中PMD的沉默染色质标记的差异富集。在整个基因组中，前列腺癌细胞获得 H3K27me3，在 PMD 边界处水平最高（左图），而癌症和未转化的前列腺细胞（右图）之间对 PMD 中心的 H3K9me3 富集没有改变。
（C） 箱线图显示 LNCaP 细胞和未转化细胞系（HPrEC 和 BPH-1）之间前列腺癌 PMD 中 H3K27me3 的切割和运行信号富集，但未富集 H3K9me3。Pvalue，单尾学生 t 检验。
（C） 箱线图显示 LNCaP 细胞和未转化细胞系（HPrEC 和 BPH-1）之间前列腺癌 PMD 中 H3K27me3 的切割和运行信号富集，但未富集 H3K9me3。Pvalue，单尾学生 t 检验。
（D） IGV 轨迹显示具有代表性的癌症相关 PMD（DNA 低甲基化：黄色），癌细胞（LNCaP：红色）与未转化细胞（HPrEC：蓝色，BPH-1：绿色）相比，H3K27me3 在 PMD 边界处明显富集，而以 PMD 为中心的 H3K9me3 占有率保持不变。
（D） IGV 轨迹显示具有代表性的癌症相关 PMD（DNA 低甲基化：黄色），癌细胞（LNCaP：红色）与未转化细胞（HPrEC：蓝色，BPH-1：绿色）相比，H3K27me3 在 PMD 边界处明显富集，而以 PMD 为中心的 H3K9me3 占有率保持不变。
（E） 来自四名前列腺癌患者的单个 CTC （红色） 和来自前列腺癌细胞系的单个细胞之间 PMD 的患者间和患者内异质性。平均 Jaccard 指数表示异质性，平均分数越高表示样本之间的异质性越小。误差线，95% 置信区间 （CI） 的平均值。
（E） 来自四名前列腺癌患者的单个 CTC （红色） 和来自前列腺癌细胞系的单个细胞之间 PMD 的患者间和患者内异质性。平均 Jaccard 指数表示异质性，平均分数越高表示样本之间的异质性越小。误差线，95% 置信区间 （CI） 的平均值。
（F-G）8 个样本源（4 名患者和 4 个前列腺癌细胞系）中 3 号染色体位点的总 PMD 和核心 PMD 的 IGV 表示。总 PMD（蓝色）是每个样品源中定义的 PMD 的并集，而核心 PMD（黑色）在所有 8 个样品源之间共享（图 F）;来自单个样本源（来自患者 GU181 的 22 个 CTC）的单细胞组分的 PMD 表示，显示了在所有样本源（黑色）和相邻的非核心 PMD 之间共享的核心 PMD，这些 PMD 由该患者中 >90% 的 CTC 共享，但不跨不同的样本源（图 G）。有关核心 PMD 和 PMI 指定的标准，请参见图 S2D 和方法。
（F-G）8 个样本源（4 名患者和 4 个前列腺癌细胞系）中 3 号染色体位点的总 PMD 和核心 PMD 的 IGV 表示。总 PMD（蓝色）是每个样品源中定义的 PMD 的并集，而核心 PMD（黑色）在所有 8 个样品源之间共享（图 F）;来自单个样本源的单细胞成分（来自患者 GU181 的 22 个 CTC）的 PMD 表示，显示了在所有样本源（黑色）和相邻的非核心 PMD 之间共享的核心 PMD，这些 PMD 由该患者中 >90% 的 CTC 共享，但不是跨不同的样本源（图 G）。有关核心 PMD 和 PMI 指定的标准，请参见图 S2D 和方法。
在单细胞水平上，PMD 和 PMI 都显示出显著的患者内和患者间异质性 （图 2E–2G（2克）和 S3D-S3F），这使我们能够定义所有单个前列腺癌细胞共享的共同结构域，这些结构域可以识别共同且因此具有功能意义的通路。在 1,496 例 PMD 中，只有 40 例 （2.7%） 普遍低甲基化，平均分位数归一化甲基化水平<25%，来自所有 4 名转移性前列腺癌患者和 4 名前列腺癌细胞系的细胞（图 S2D，表 S2，参见方法）。40 个核心 PMD 的平均大小为 2.5 Mb（范围为 353.4 kb 至 7.7 Mb），包含 143 个蛋白质编码基因，基因密度为 1.44 个基因/Mb。15,36.事实上，我们注意到，与基因组中的其他PMD相比，核心前列腺PMD表现出降低的CpG残基含量（P<0.0066，图S3G），为它们的普遍低甲基化提供了可能的解释。在相同的单个前列腺癌细胞中，对所有前列腺癌患者和前列腺癌细胞系的 1,412 个 PMI 交叉的分析确定了 44 个核心 PMI（图 S2D，表 S2，参见方法）。核心 PMI 的平均大小为 371.7 kb（范围为 27 kb 至 1.9 Mb），包含 255 个蛋白质编码基因，基因密度为 15.6 个基因/Mb（图 S3H）。
我们对前列腺癌细胞的单细胞分析确定了一小部分普遍共享的PMD，我们将其描述为核心PMD，它还揭示了在这些大型PMD中散布着具有保留DNA甲基化的小基因丰富的岛屿，我们称之为PMI。
我们对前列腺癌细胞的单细胞分析确定了一小部分普遍共享的PMD，我们将其描述为核心PMD，它还揭示了在这些大型PMD中散布着具有保留DNA甲基化的小基因丰富的岛屿，我们称之为PMI。
核心PMD的低甲基化是前列腺肿瘤发生的早期事件
核心PMD的低甲基化是前列腺肿瘤发生的早期事件
DNA低甲基化在癌症进化过程中进展，最终包含晚期癌症中非编码和基因贫乏基因组的大区域37.然而，与早期遗传驱动突变类似，非随机表观遗传沉默可能在启动肿瘤发生中发挥重要作用，选择压力引导复发的早期事件。在确定了单个转移性前列腺癌细胞共享的核心PMD后，我们试图确定在肿瘤发生过程中始终受到早期沉默的基因组位点。鉴于肿瘤和基质细胞在局限性前列腺癌中的特征性混合，我们从前列腺切除术标本中获得了冷冻组织切片，并纯化了单核进行分子分析。通过从全基因组亚硫酸氢盐测序推断的 CNV 确认单个细胞核的肿瘤起源，我们计算了 CNV 评分（每 Mb 的绝对 DNA 拷贝数变化）以补充 Gleason 组织学评分，作为肿瘤进展的独立测量（图3A，请参阅方法）。除了局限性前列腺癌的格里森组织学评分外，我们还计算了CNV评分（每Mb的绝对DNA拷贝数变化），以量化来自不同前列腺切除术样本的单核的基因组不稳定性，作为肿瘤进展的独立测量。总的来说，我们分析了来自五名低级别 （GS6） 前列腺癌患者的 38 个原发性肿瘤细胞核、来自另外五名高级别 （GS≥8） 疾病患者的 62 个细胞核和来自邻近组织切片的 78 个正常前列腺细胞，将这些细胞与转移性疾病患者的 38 个 CTC 进行了比较（表 S1）。从我们的高分辨率单核分析中推断出的 CNV 将 Chr8p 缺失（包含 NKX3-1、BMP1、FGFR1 基因和多个 microRNA）确定为前列腺肿瘤发生中最早的遗传事件之一，GS6 肿瘤中 >43% 的癌细胞共享（图 S4A）。在前列腺癌中已有报道，该位点的早期等位基因丢失38–41. Interestingly, GS6 prostate cancer cells with Chr8p loss show more hypomethylation across PMDs, pointing to coordinated early timing of CNV and hypomethylation (Figure S4B). At the single-cell level across different tumors, hypomethylation at prostate PMDs exhibits less heterogeneity than do hypermethylated CpG promoter regions (Figures S4C and S4D).
DNA低甲基化在癌症进化过程中进展，最终包含晚期癌症中非编码和基因贫乏基因组的大区域 37 。然而，与早期遗传驱动突变类似，非随机表观遗传沉默可能在启动肿瘤发生中发挥重要作用，选择压力引导复发的早期事件。在确定了单个转移性前列腺癌细胞共享的核心PMD后，我们试图确定在肿瘤发生过程中始终受到早期沉默的基因组位点。鉴于肿瘤和基质细胞在局限性前列腺癌中的特征性混合，我们从前列腺切除术标本中获得了冷冻组织切片，并纯化了单核进行分子分析。通过从全基因组亚硫酸氢盐测序推断的 CNV 确认单个细胞核的肿瘤起源，我们计算了 CNV 评分（每 Mb 的绝对 DNA 拷贝数变化）以补充 Gleason 组织学评分，作为肿瘤进展的独立测量（图 3A，参见方法）。除了局限性前列腺癌的格里森组织学评分外，我们还计算了CNV评分（每Mb的绝对DNA拷贝数变化），以量化来自不同前列腺切除术样本的单核的基因组不稳定性，作为肿瘤进展的独立测量。总的来说，我们分析了来自五名低级别 （GS6） 前列腺癌患者的 38 个原发性肿瘤细胞核、来自另外五名高级别 （GS≥8） 疾病患者的 62 个细胞核，以及来自邻近组织切片的 78 个正常前列腺细胞，将这些细胞与转移性疾病患者的 38 个 CTC 进行了比较（表 S1）。 从我们的高分辨率单核分析中推断出的 CNV 将 Chr8p 缺失（包含 NKX3-1、BMP1、FGFR1 基因和多个 microRNA）确定为前列腺肿瘤发生中最早的遗传事件之一，GS6 肿瘤中 >43% 的癌细胞共享（图 S4A）。该基因座的早期等位基因缺失在前列腺癌 38–41 中已有报道。有趣的是，具有Chr8p缺失的GS6前列腺癌细胞在PMD中显示出更多的低甲基化，表明CNV和低甲基化的协调早期时间（图S4B）。在不同肿瘤的单细胞水平上，前列腺PMD的低甲基化表现出比高甲基化CpG启动子区域更少的异质性（图S4C和S4D）。
在前列腺肿瘤发生早期期间，核心PMD的去甲基化抑制了免疫相关基因，而核心PMI则保留了增殖基因。
(A) Schematic showing prostate tumor microdissection, single nucleus isolation and single-cell DNA methylation sequencing.
（A） 显示前列腺肿瘤显微切割、单核分离和单细胞 DNA 甲基化测序的示意图。
（B） 在所有 1,496 个 PMD 中 40 个核心 PMD（红点）的甲基化水平排名，作为从正常前列腺到局部 （GS6;GS8）和转移性癌症（CTCs），显示核心PMD的早期去甲基化。在正常前列腺中，所有 40 个核心 PMD 的甲基化水平均为 >75%，其中 31 个早在 GS6 就被低甲基化。
（C） 去甲基化作为格里森评分 （GS） 函数的定量。核心 PMD 的去甲基化（红色曲线）先于显微解剖前列腺肿瘤细胞和 CTC 中的其他 PMD（品红色）。相比之下，嵌套在PMD之间的核心PMI（蓝色）在肿瘤发生过程中显示出最小的DNA甲基化变化。误差线，SEM的平均值。 利用纵向线性混合效应模型对DNA甲基化曲线进行统计分析，通过该模型测试肿瘤进展x甲基化结构域。
（D） TCGA 前列腺癌甲基化阵列数据中作为 GS 函数的去甲基化定量，显示核心 PMD 甲基化的早期和渐进性丧失（红色曲线），其他 PMD 呈减弱趋势（品红色）。核心 PMI（蓝色）在前列腺肿瘤发生过程中显示出稳定的 DNA 甲基化模式。关于面板C的统计分析。
（英-法）与正常前列腺相比，原发性前列腺癌 （E） 中驻留在核心 PMD 内并下调的基因，以及驻留在原发性前列腺癌 （F） 中基因表达保留（上调且无显着变化）的核心 PMI 内的基因集富集分析 （GSEA）。（FDR <0.1;带 FDR 校正的双尾学生 t 检验）。
值得注意的是，最初由转移性前列腺癌细胞中普遍低甲基化定义的核心 PMD 在肿瘤发生的最早阶段显示出深刻的富集。在早期 GS6 肿瘤中，77.5% （31/40） 的核心 PMD 被低甲基化，而非核心 PMD 仅为 8% （115/1,456） （图3B).事实上，核心 PMD 中的平均定量甲基化水平从 78.4%（正常前列腺）下降到 70.4% （GS6）、57.2% （GS8） 和转移性 CTC 的 20.2%。 所有前列腺 PMD 的可比甲基化水平下降得更慢：82.2%（正常前列腺）、80.9%（GS6）、74.7%（GS8）和 57.6%（CTC）（图3C).相比之下，散布的核心 PMI 的甲基化显示出从正常前列腺核到 GS6、GS8 和转移性前列腺 CTC 的变化很小。 与大染色体结构域的低甲基化相比，基因调控区域内 CpG 岛的局灶性高甲基化逐渐从 27.5%（正常前列腺）增加到 30.7% （GS6）、31.9% （GS8） 和 34.3% （CTC）（图 S4E），通过 CNV 评分测量的非整倍体也是如此（图 S4F).我们观察到核心PMD的CNV和DNA甲基化之间没有混杂相关性（FDR>0.1）（图S4G）。我们对早期前列腺癌中核心PMD加速进行去甲基化的观察结果通过Gleason Score分层的TCGA前列腺癌甲基化阵列数据（图3D），以及原发性和转移性前列腺肿瘤的全基因组双硫酸盐测序34,42 (图S4H）。核心PMI显示保留的甲基化模式与格里森评分无关（图 3D和 S4H）。
综上所述，核心PMD在惰性GS6前列腺癌中开始失去DNA甲基化，GS6前列腺癌是前列腺肿瘤发生中最早可识别的病变之一。这种早期时机解释了它们在晚期癌症中的普遍低甲基化，与随后肿瘤进展过程中出现的更异质的低甲基化结构域相比。
综上所述，核心PMD在惰性GS6前列腺癌中开始失去DNA甲基化，GS6前列腺癌是前列腺肿瘤发生中最早可识别的病变之一。这种早期时机解释了它们在晚期癌症中的普遍低甲基化，与随后肿瘤进展过程中出现的更异质的低甲基化结构域相比。
核心 PMD 中免疫相关基因的沉默和 PMI 中增殖基因的持续表达
核心 PMD 中免疫相关基因的沉默和 PMI 中增殖基因的持续表达
为了解决早期 DNA 低甲基化的功能后果，我们确定了定位于核心 PMD 的蛋白质编码基因，这些基因在大型前列腺癌 TCGA 数据库中显示表达缺失39.在 40 个核心 PMD 中的 143 个蛋白质编码基因中，68 个 （48%） 在正常前列腺肿瘤和原发性前列腺肿瘤中一致且显着差异地表达，其中 61 个 （90%） 在癌症中被抑制，7 个 （10%） 被诱导。值得注意的是，核心前列腺PMD中12/61（20%）的沉默基因与免疫相关。GSEA分析显示脂质抗原加工和呈递（P<1.96E-13）和细胞对干扰素的反应（P<2.74E-5）是两种最富集的途径（图 3E，请参阅方法）。相反，在 44 个核心 PMI 中的 255 个蛋白质编码基因中，有 161 个 （63.1%） 在同一个 TCGA 数据库中的前列腺癌和正常前列腺组织中表达相当。GSEA的主要通路都与细胞增殖有关，包括E2F靶标（P<0.000975）和DNA修复（P<0.00116）（图3F，S4I-J）。作为对照，GSEA通路分析没有发现在前列腺癌中未表达或未沉默的核心PMD衍生基因之间，或在未保留表达的核心PMI衍生基因中具有统计学意义的富集。因此，识别前列腺癌细胞中DNA甲基化的早期和一致变化表明免疫相关基因的沉默，选择性保留编码增殖驱动因素的基因，作为前列腺肿瘤发生的初始步骤。
CD1A-IFI16基因簇的PMD相关沉默
CD1A-IFI16基因簇的PMD相关沉默
核心 PMD 相关基因沉默的一个显着特征是靶向脂质抗原呈递基因的整个 CD1 家族（CD1A、CD1B、CD1C、CD1D 和 CD1E）和 Pyrin 和 HIN 结构域 （PYHIN） 家族的四个干扰素诱导基因，参与非自身 DNA（IFI16、AIM2、PYHIN1 和 MNDA）的免疫感应。这些基因聚集在染色体 1q23.1 的同一核心低甲基化阻滞（以下简称 CD1A-IFI16 阻滞）内，与在整合这两种免疫识别途径中起主要作用的单个基因组位点一致 （图4A).CD1 基因家族编码 MHC I 类样分子，这些分子仅将非肽（例如糖脂）呈递给自然杀伤 T （NKT） 细胞，这是一种罕见的 T 细胞亚群，与先天免疫和适应性免疫有关43-45.CD1 通路主要与对感染因子的先天免疫有关，尽管脂质抗原也可能在抗肿瘤免疫中发挥作用46,47.在干扰素诱导基因中，IFI16 在正常前列腺细胞中高度表达：据报道，它以 DNA 长度依赖性方式结合细胞核和细胞质中的非自身 dsDNA，募集 STING 并进一步激活干扰素信号传导48.
（A） CD1A-IF16基因组位点单细胞DNA甲基化的IGV，包括5个脂质抗原呈递和4个干扰素诱导基因。肿瘤细胞（来自四名前列腺癌患者的 37 个单 CTC（红色）和来自四个前列腺癌细胞系的 17 个单细胞（绿色））在该位点表现出明显的低甲基化（黄色阴影），而正常样本（4 个大量正常前列腺组织、来自正常前列腺细胞系和白细胞的 37 个单细胞（蓝色））显示保留的 DNA 甲基化（蓝色阴影）。
（A） CD1A-IF16基因组位点单细胞DNA甲基化的IGV，包括5个脂质抗原呈递和4个干扰素诱导基因。肿瘤细胞（来自四名前列腺癌患者的 37 个单 CTC（红色）和来自四个前列腺癌细胞系的 17 个单细胞（绿色））在该位点表现出明显的低甲基化（黄色阴影），而正常样本（4 个大量正常前列腺组织、来自正常前列腺细胞系和白细胞的 37 个单细胞（蓝色））显示保留的 DNA 甲基化（蓝色阴影）。
（B） 所有 1,496 例前列腺癌 PMD 中单细胞 DNA 甲基化水平的热图（上图;低甲基化阴影为黄色）和匹配的定量散点图（下图），显示从正常前列腺癌到局限性前列腺癌（GS6、GS8）和转移性 CTC 的进展。CD1A-IFI16 位点（垂直红色虚线）显示早期和深度去甲基化，从 GS6 开始，括号中显示其在每个肿瘤阶段的所有 PMD 中的排名号（红色）。
（B） 所有 1,496 例前列腺癌 PMD 中单细胞 DNA 甲基化水平的热图（上图;低甲基化阴影为黄色）和匹配的定量散点图（下图），显示从正常前列腺癌到局限性前列腺癌（GS6、GS8）和转移性 CTC 的进展。CD1A-IFI16 位点（垂直红色虚线）显示早期和深度去甲基化，从 GS6 开始，括号中显示其在每个肿瘤阶段的所有 PMD 中的排名号（红色）。
（C） 单细胞 DNA 甲基化数据的 IGV 屏幕截图，显示 CD1A-IFI16 位点（带有红色虚线的框）从正常前列腺细胞逐渐去甲基化为局部（GS6 和 GS8）和转移性前列腺癌 （CTC）。单细胞间低甲基化（黄色阴影）的异质性在 GS6 中很明显，在 GS8 中变得更加普遍，并且在 CTC 中是均匀的。
（C） 单细胞 DNA 甲基化数据的 IGV 屏幕截图，显示 CD1A-IFI16 位点（带有红色虚线的框）从正常前列腺细胞逐渐去甲基化为局部（GS6 和 GS8）和转移性前列腺癌 （CTC）。单细胞间低甲基化（黄色阴影）的异质性在 GS6 中很明显，在 GS8 中变得更加普遍，并且在 CTC 中是均匀的。
(D) Plots showing suppressed expression of lipid antigen presentation and interferon inducible genes within the CD1A-IFI16 locus, during transition from normal prostate to low-grade GS6, with persistent silencing in higher grade GS7, 8 and 9 cancers (TCGA dataset). Error bar, mean with SEM.
（D） 在从正常前列腺过渡到低级别 GS6 期间，CD1A-IFI16 位点内脂质抗原呈递和干扰素诱导基因的表达受到抑制，在高级别 GS7、8 和 9 癌症中持续沉默（TCGA 数据集）。误差线，SEM的平均值。
(E) Analysis of 33 different tumor types (TCGA) for DNA methylation differences at core prostate cancer PMDs, compared with corresponding normal tissues. 30 of 35 (86%) evaluable PMDs are hypomethylated across all tumor types (red circles), with the CD1A-IFI16 locus having the strongest hypomethylation.
（E） 分析 33 种不同肿瘤类型 （TCGA） 的核心前列腺癌 PMD 的 DNA 甲基化差异，与相应的正常组织进行比较。35 个可评估的 PMD 中有 30 个 （86%） 在所有肿瘤类型（红色圆圈）中均被低甲基化，其中 CD1A-IFI16 位点具有最强的低甲基化。
(F) Histograms of DNA methylation level within 100kb windows (200bp offsets) across the genome in normal prostate cells (BPH-1), following 5-azacytidine treatment (days 1 and 5), compared with DMSO control.
（F） 与 DMSO 对照相比，在 5-氮杂胞苷治疗（第 1 天和第 5 天）后，正常前列腺细胞 （BPH-1） 基因组中 100kb 窗口（200bp 偏移）内 DNA 甲基化水平的直方图。
(G) Quantitation of H3K27me3-related fluorescence intensity within single-cell nuclei (confocal microscopy). Error bar, mean with SEM. P-value, two-tailed Student’s t-test.
（G） 单细胞核内 H3K27me3 相关荧光强度的定量（共聚焦显微镜）。误差线，SEM 的平均值。 P 值，双尾学生 t 检验。
(H) Sequential reduction in CD1d protein expression in normal prostate cells (BPH-1) treated with 5-azacytidine, compared with DMSO control. Representative flow cytometry (left panel); median fluorescence intensity (right panel). Error bar, mean with SEM. P-value, two tailed Student’s t-test.
（H） 与 DMSO 对照相比，用 5-氮杂胞苷处理的正常前列腺细胞 （BPH-1） 中 CD1d 蛋白表达的顺序降低。代表性流式细胞术（左图）;中值荧光强度（右图）。误差线，SEM 的平均值。 P 值，双尾学生 t 检验。
(I-J) Western blot showing reduced H3K27 trimethylation in 22Rv1 cells treated with EZH2 inhibitor GSK126 for 6 days (panel H); qPCR of genes within the CD1A-IFI16 cluster show induced expression (panel I), while non-PMD resident control genes (PP1A, HPRT and β-actin) remain unchanged. P-value, Tukey’s multiple comparison tests, where GSK126 treatment conditions (red bars) were compared to controls (blue bar). n.s. not significant; ****P<0.0001.
（I-J）Western 印迹显示用 EZH2 抑制剂 GSK126 处理 6 天的 22Rv1 细胞中 H3K27 三甲基化降低（图 H）;CD1A-IFI16簇内基因的qPCR显示诱导表达（图I），而非PMD驻留对照基因（PP1A、HPRT和β-肌动蛋白）保持不变。P 值，Tukey 的多重比较检验，其中 GSK126 处理条件（红色条）与对照组（蓝色条）进行比较。n.s. 不重要;P<0.0001。
DNA methylation of the CD1A-IFI16 locus declines early and rapidly, scoring as the 14th earliest across all genome-wide PMDs measured at GS6 (Figure 4B). Heterogeneity in hypomethylation at CD1A-IFI16 is evident within single prostate cancer cells at early stage GS6 tumors, progressively increasing in both fraction of tumor cells and degree of hypomethylation within individual tumor cells as they evolve to GS8 and ultimately to metastatic CTCs (Figures 4C and S5A). This early and progressive loss of DNA methylation at the CD1A-IFI16 locus, compared with the slower rate of demethylation genomewide, is also evident in analysis of public databases of primary and metastatic prostate cancer34,42 (Figure S5B). Analysis of TCGA prostate cancer data stratified by Gleason Score further confirms early progressive loss of methylation within the CD1A-IFI16 locus (Figure S5C), and the associated transcriptional downregulation of the encoded genes as early as GS6 tumors (Figures 4D). The accelerated decline in DNA methylation at CD1A-IFI16 is not driven by gene copy number changes, as confirmed by comparing single nuclei with or without CNV at this locus (Figure S5D).
Early DNA hypomethylation at the CD1A-IFI16 locus is not restricted to prostate cancer. DNA methylation datasets at defined stages of cancer progression are available for both colon and thyroid cancers9, both of which demonstrate earlier and more progressive demethylation of CD1A-IFI16, when compared to other core PMDs (Figure S5E). Furthermore, analysis of methylation profiles in a TCGA cohort including more than 1,000 samples spanning 33 cancer types (https://portal.gdc.cancer.gov) identifies the CD1A-IFI16 locus as consistently hypomethylated in 23 different cancers (Figures S5F–G). Across all 33 cancer types, CD1A-IFI16 demonstrates the greatest degree of DNA hypomethylation compared with all other core PMDs (Figure 4E), and 19 of the 33 cancers show a significant correlation between hypomethylation of this locus and reduced RNA expression of CD1A-IFI16 resident genes (Figure S5H). Early and profound DNA hypomethylation at CD1A-IFI16 is thus a consistent feature across multiple cancers.
Along with DNA hypomethylation of the CD1A-IFI16 locus, we observed the expected enrichment for H3K27me3 chromatin marks, comparing prostate cancer versus normal prostate cell lines, together with suppression of the encoded genes within that locus (Figures S6A, B and S6C, Table S3). Extending this analysis to nuclei from microdissected GS6 and GS8 tumors using ultra-low-input native ChIP-seq (ULI-NChIP), we observe marked progressive enrichment of H3K27me3 at the CD1A-IFI16 locus in early GS6 tumors compared with normal prostate epithelium (Figures S6D–E), whereas other PMDs show increased H3K27me3 only at GS8 (Figure S6F). Finally, within high purity TCGA prostate samples (tumor purity >0.5 inferred by ABSOLUTE algorithm), all five lipid antigen presentation genes and three of the four PYHIN interferon inducible genes are suppressed in primary prostate tumors (n=188) compared with normal prostate (n=14) (Figure S6G). The suppression of CD1A-IFI16 gene expression is observed at the earliest timepoint of DNA hypomethylation (GS6), and it persists as DNA hypomethylation progresses, suggesting a potential threshold effect. Thus, immune-related genes within the CD1A-IFI16 cluster are among the earliest targets of cancer hypomethylation-induced transcriptional silencing.
随着 CD1A-IFI16 位点的 DNA 低甲基化，我们观察到 H3K27me3 染色质标记的预期富集，将前列腺癌与正常前列腺细胞系进行比较，以及该位点内编码基因的抑制（图 S6A、B 和 S6C，表 S3）。使用超低输入天然 ChIP-seq （ULI-NChIP） 将这种分析扩展到显微解剖的 GS6 和 GS8 肿瘤的细胞核，我们观察到与正常前列腺上皮相比，早期 GS6 肿瘤中 CD1A-IFI16 位点的 H3K27me3 显着进行性富集（图 S6D-E），而其他 PMD 仅在 GS8 处显示 H3K27me3 增加（图 S6F）。最后，在高纯度TCGA前列腺样品（肿瘤纯度>通过ABSOLUTE算法推断0.5）中，与正常前列腺（n = 14）相比，原发性前列腺肿瘤（n = 188）中的所有五个脂质抗原呈递基因和四个PYHIN干扰素诱导基因中的三个都被抑制（图S6G）。在 DNA 低甲基化 （GS6） 的最早时间点观察到 CD1A-IFI16 基因表达的抑制，并且随着 DNA 低甲基化的进展而持续存在，这表明存在潜在的阈值效应。因此，CD1A-IFI16簇中的免疫相关基因是癌症低甲基化诱导的转录沉默的最早靶标之一。
Functional recapitulation of hypomethylation-associated silencing at CD1A-IFI16 locus
CD1A-IFI16 位点低甲基化相关沉默的功能概括
To investigate the functional relationship between DNA methylation, repressive chromatin marks and expression of PMD-resident genes, we applied the DNA demethylating agent 5-azacytidine (5 μM) to the human prostate epithelial cells (BPH-1), in which the CD1A-IFI16 locus shows normal DNA methylation levels (Figure 4A). Global DNA methylation declines by 4.9 % after 24 hrs of 5-azacytidine, and by 37.7% after 5 days of drug exposure, compared with DMSO controls (Figure 4F), with the CD1A-IFI16 locus showing progressive DNA demethylation upon 5-azacytidine treatment (Figure S7A). Bisulfite treatment and Sanger sequencing confirms gradual demethylation at CD1A-IFI16 (DMSO: 75.9%, day5: 40.8%) (Figure S7B). Ectopically-induced demethylation is accompanied by marked increase of the chromatin silencing mark H3K27me3, as shown by quantitative imaging of nuclei (7.18-fold increase after 5 days) (Figures 4G and S7C), along with H3K9me3 (Figures S7D–E), and associated with reduced expression of CD1 (Figure 4H). Thus, DNA hypomethylation appears to trigger the recruitment of chromatin suppressive marks at the CD1A-IFI16 locus, along with repression of the resident genes.
We then tested the converse model, using an inhibitor of the EZH2 methyltransferase, GSK126, to suppress H3K27me3 in prostate cancer cells, in which the CD1A-IFI16 locus is hypomethylated and silenced. Treatment of three prostate cancer cell lines (22Rv1, LNCaP and VCaP) with GSK126 results in loss of global H3K27 trimethylation, associated with a dramatic increase in expression of all the genes within the CD1A-IFI16 locus (Figures 4I–J and S7F–G). Together, these observations further support the role of chromatin silencing marks in repressing coding genes within the CD1A-IFI16 locus and other PMDs.
Re-expression of lipid antigen presentation or interferon-inducible genes restores anti-tumor immunity in a mouse model
脂质抗原呈递或干扰素诱导基因的再表达可恢复小鼠模型中的抗肿瘤免疫
To explore the potential significance of CD1A-IFI16 silencing, we tested the consequences of restored expression in a murine model of early prostate tumorigenesis. The mouse prostate cancer cell line Myc-CaP is derived from a genetically engineered model with prostate-specific expression of a c-Myc transgene driving androgen-dependent tumorigenesis49. Single-cell methylation sequencing of Myc-CaP cells shows uniform hypomethylation of two chromosomal loci syntenic with the single human CD1A-IFI16 locus, and encompassing the two murine lipid antigen presentation genes (Cd1d1 and Cd1d2) and the orthologous PYHIN interferon inducible genes (Ifi204, Aim2, Pyhin1 and Mnda), respectively (Figures S8A and S8B). Repressive H3K27me3 and H3K9me3 marks are enriched at the Cd1d and interferon inducible genes (Figures S8A and S8B). The major CD1 murine ortholog Cd1d1 and the IFI16 murine ortholog Ifi204 are repressed in Myc-CaP tumor cells, compared with normal prostate tissues dissected from isogenic FVB mice (Figure 5A). We ectopically expressed Cd1d1 (16.1-fold) or Ifi204 (4.1-fold) in Myc-CaP cells by lentiviral transduction, achieving levels comparable to those of normal mouse prostate (Figure 5A and Table S3, see Methods). Cell surface localization of restored Cd1d1 is evident using both flow cytometry and confocal microscopy (Figures S8C and S8D).
恢复CD1A-IFI16同源位点内基因的表达可消除免疫功能正常的小鼠前列腺癌模型中的肿瘤发生。
(A) Plots quantifying Cd1d1 and Ifi204 mRNA in the murine prostate tumor cell line Myc-CaP, which have silenced the syntenic genes (blue), compared to normal prostate cells from 4 isogenic mice FVB (orange). Ectopic expression of murine Cd1d1 (CD1D ortholog, green) and Ifi204 (IFI16 ortholog, red) is comparable to that of normal prostate. Error bar, mean with SEM.
（A） 与来自 4 只同基因小鼠 FVB（橙色）的正常前列腺细胞相比，定量小鼠前列腺肿瘤细胞系 Myc-CaP 中的 Cd1d1 和 Ifi204 mRNA，这些细胞系沉默了同源基因（蓝色）。小鼠 Cd1d1（CD1D 直系同源物，绿色）和 Ifi204（IFI16 直系同源物，红色）的异位表达与正常前列腺相当。误差线，SEM的平均值。
(B) Overexpression (OE) of Cd1d1 or Ifi204 in Myc-CaP cells does not alter in vitro proliferation compared with controls. Error bar, mean with SD.
（B） 与对照组相比，Myc-CaP 细胞中 Cd1d1 或 Ifi204 的过表达 （OE） 不会改变体外增殖。误差线，用标准差表示。
(C) Overexpression of either Cd1d1 (green) or Ifi204 (red) in Myc-CaP cells (mCherry-luciferase tagged) suppresses tumorigenesis in isogenic immunocompetent FVB mice. Mock-transfected control tumors are shown as control (blue). Tumor size quantified by luciferase imaging (representative images). Error bar, mean with SEM.
（C） Myc-CaP 细胞（标记的 mCherry-荧光素酶）中 Cd1d1（绿色）或 Ifi204（红色）的过表达抑制同基因免疫功能正常的 FVB 小鼠的肿瘤发生。模拟转染的对照肿瘤显示为对照（蓝色）。通过荧光素酶成像量化的肿瘤大小（代表性图像）。误差线，SEM的平均值。
(D) Myc-CaP cells engineered as in (C) show no difference in tumor growth in immune-deficient NSG mice. Error bar, mean with SEM.
（D）按（C）所示工程化的Myc-CaP细胞在免疫缺陷NSG小鼠的肿瘤生长中没有差异。误差线，SEM的平均值。
(E) Flow cytometry of Cd1d-restored Myc-CaP tumors in FVB mice, showing recruitment of CD1d-restricted NKT cells (marked by α-GalCer CD1d Tetramer) and activated NKT cells (marked by CD69), compared with controls. Error bar, mean with SD.
（E） FVB 小鼠中 Cd1d 恢复的 Myc-CaP 肿瘤的流式细胞术，显示与对照组相比，CD1d 限制性 NKT 细胞（以 α-GalCer CD1d 四聚体标记）和活化的 NKT 细胞（以 CD69 标记）的募集。误差线，用标准差表示。
(F) Flow cytometry of Ifi204-restored Myc-CaP tumors in FVB mice, showing unaltered infiltration of total CD4 and CD8 T cells, but reduced immune infiltration by PD-1 CD8 T cells and increased presence of TNFα CD8 T cells, compared with controls. Error bar, mean with SD. P-values, two-tailed Student’s t-test; ns, not significant.++++++
Ectopic expression of Cd1d1 in Myc-CaP cells does not alter proliferation in vitro, but these cells fail to produce tumors in isogenic immune competent FVB mice, when inoculated either subcutaneously or by direct intraprostatic injection (Figures 5B, ,5C5C和 S8E）。这种作用取决于免疫细胞的活化，因为将相同的表达 Cd1d1 的 Myc-CaP 细胞接种到免疫缺陷的 NSG 小鼠中不会抑制它们产生原发性肿瘤的能力 （图5D).Cd1d 特异性介导 NKT 细胞的脂肪生成抗原呈递和激活，NKT 细胞是一种表达 Cd40lg 和 Icos 的罕见 T 细胞亚群 （http://rstats.immgen.org/Skyline/skyline.html)50，FVB免疫感受态小鼠中来自Cd1d1恢复的Myc-CaP细胞的肿瘤显示Cd40lg的表达增加（2.8倍;P=0.0063）和Icos（3.2倍;P=0.00023）与对照组相比（图S8F和表S3）。Cd1d1恢复肿瘤中肿瘤免疫浸润的流式细胞术分析表明，Cd1d限制性NKT细胞更丰富（P=0.0042），与高亲和力合成NKT细胞配体α-半乳糖基神经酰胺（α-GalCer）四聚体的结合增加，NKT细胞活化的CD69标志物增加（P=0.0099）（图 5E和 S9A-C）。为了测试在另一种小鼠同基因肿瘤模型中恢复 Cd1d1 表达的后果，我们在不表达 Cd1d1 的 LLC-1 肺表皮样癌模型中恢复了其表达。尽管体外增殖未改变，但 LLC-1 中 Cd1d1 的异位表达在皮下接种到免疫感受能力强的等基因 C57BL/6 小鼠中时会减少肿瘤生长（图 S8G-J）。
Myc-CaP细胞中Cd1d1的异位表达不会改变体外增殖，但当皮下接种或直接前列腺内注射时，这些细胞不能在等基因免疫感受态FVB小鼠中产生肿瘤（图5B，，5C5C和S8E）。这种作用取决于免疫细胞的活化，因为将相同的表达Cd1d1的Myc-CaP细胞接种到免疫缺陷的NSG小鼠中不会抑制它们产生原发性肿瘤的能力（图5D）。Cd1d 特异性介导脂肪生成抗原呈递和激活 NKT 细胞，NKT 细胞是表达 Cd40lg 和 Icos 的罕见 T 细胞亚群 （http://rstats.immgen.org/Skyline/skyline.html）， 50 FVB 免疫功能正常小鼠中来自 Cd1d1 恢复的 Myc-CaP 细胞的肿瘤显示 Cd40lg 的表达增加（2.8 倍;P=0.0063）和Icos（3.2倍;P=0.00023）与对照组（图S8F和表S3）相比。Cd1d1恢复肿瘤中肿瘤免疫浸润的流式细胞术分析表明，Cd1d限制性NKT细胞更丰富（P = 0.0042），与高亲和力合成NKT细胞配体α-半乳糖基神经酰胺（α-GalCer）四聚体的结合增加，NKT细胞活化的CD69标志物增加（P = 0.0099）（图5E和S9A-C）。为了测试在另一种小鼠同基因肿瘤模型中恢复 Cd1d1 表达的后果，我们在 LLC-1 肺表皮样癌模型中恢复了其表达，该模型不表达 Cd1d1。 尽管体外增殖未改变，但 LLC-1 中 Cd1d1 的异位表达在皮下接种到免疫感受态等基因 C57BL/6 小鼠中时会减少肿瘤生长（图 S8G-J）。
然后，我们测试了 Ifi204 在 Myc-CaP 细胞中恢复表达的影响，Ifi204 是干扰素诱导基因 IFI16 的小鼠直系同源物。再表达 Ifi204 还抑制免疫感受态 FVB 小鼠的 Myc-CaP 肿瘤发生，在体外没有任何抗增殖作用 (图 5B和和5C）。5C（5摄氏度）).这种作用在免疫缺陷的NSG小鼠中并不明显，表明免疫作用（图5D).FVB小鼠中表达Ifi204的Myc-CaP细胞的T体在CD4，CD8 T细胞总数或T细胞活化一般标志物的表达（++图 5F、S9D 和 S9E）。然而，与亲本对照组相比，Ifi204 重组的肿瘤在 CD8 T 细胞内共抑制受体 PD-1 的表达显着降低 （P=0.00042），同时功能性细胞内细胞因子 TNFα 增加 （P=0.0374），所有这些都与活化的 CD8 T 细胞细胞毒性功能一致 （++图 5F、S9F 和 S9G）。CD8 T细胞中其他共抑制受体（TIGIT，LAG3或TIM3）或细胞因子（IFNγ）的表达没有明显变化（图S9H-S9K）。+
然后，我们测试了 Ifi204 在 Myc-CaP 细胞中恢复表达的影响，Ifi204 是干扰素诱导基因 IFI16 的小鼠直系同源物。再表达 Ifi204 还抑制免疫感受态 FVB 小鼠的 Myc-CaP 肿瘤发生，在体外没有任何抗增殖作用（图 5B 和 5C）。这种作用在免疫缺陷的NSG小鼠中并不明显，表明具有免疫作用（图5D）。FVB小鼠中来自表达Ifi204的Myc-CaP细胞的肿瘤在CD4 + 、CD8 + T细胞总数或T细胞活化一般标志物的表达方面没有差异（图5F，S9D和S9E）。然而，与亲本对照相比，Ifi204 重组的肿瘤在 CD8 + T 细胞内共抑制受体 PD-1 的表达显着降低 （P=0.00042），同时功能性细胞内细胞因子 TNFα 增加 （P=0.0374），所有这些都与活化的 CD8 + T 细胞细胞毒性功能一致（图 5F、S9F 和 S9G）。CD8 + T细胞中其他共抑制受体（TIGIT，LAG3或TIM3）或细胞因子（IFNγ）的表达没有明显变化（图S9H-S9K）。
因此，在具有 DNA 低甲基化诱导的沉默的癌细胞中，CD1 或 IFI16 小鼠直系同源物的异位恢复表达抑制了肿瘤的形成，这一发现仅在免疫功能正常的小鼠中明显，并且与选择性增加的抗肿瘤活性的证据相关。我们的结果表明，CD1A-IFI16位点（受Cd1d1调节的NKT细胞和受Ifi204影响的细胞毒性CD8 + T细胞）的沉默至少会损害两个不同的免疫群体，这表明该多基因位点在肿瘤发生中具有复杂的免疫调节功能。
使用纳米孔测序检测血液样本中 CTC 衍生的 DNA 低甲基化
While our study was focused on the characterization of early methylation changes in prostate tumorigenesis and their potential biological consequences, we also note the recent application of CpG island hypermethylation as a blood-based diagnostic assay for early cancer detection24,25. Genome-wide screening for changes in DNA methylation may be more sensitive than mutation-based assays, particularly in tumors like prostate cancers, which do not harbor well defined recurrent driver mutations. Nonetheless among all cancers tested, early prostate cancer shows one of the lowest detection rates (11.2%), using screening for CpG island hypermethylation25. CTCs are shed into the blood by invasive localized prostate cancers long before they establish metastases51–53, raising the possibility that they may provide an orthogonal assay for early cancer detection. Given the specificity of DNA hypomethylation domains in cancer cells and their large genomic size, we reasoned that they may provide high sensitivity and quantitative signal for cancer detection, following CTC enrichment in blood specimens. For such blood-based rare cell signal detection studies, we applied a screen for all prostate PMDs, rather than the much smaller number of core PMDs, so as to increase coverage to a large fraction of the prostate cancer genome. Oxford Nanopore long-read native sequencing typically produces sequencing reads up to 100 kb, and directly identifies methylated CpG residues (5mC), without requiring bisulfite conversion in library preparation54,55.在目前的配置中，纳米孔信号分析不容易识别 5-羟甲基胞嘧啶 （5hmC），其丰度远低于 5mC，并且在常规亚硫酸氢盐测序中也无法与 5mC 区分开来。事实上，VCaP前列腺癌细胞系的纳米孔测序清楚地定义了DNA低甲基化结构域，这些结构域使用标准亚硫酸氢盐测序忠实地概括了在这些细胞中鉴定出的结构域（图6A和和6B）。在6乙).与Illumina测序的短读长（通常每个读长包含<5个CpG位点）相比，数学建模表明，纳米孔测序产生的长读长将使检测的稀有信号（图 6C和和6D，6D的，请参阅方法）。因此，我们处理了来自局部或转移性前列腺癌患者的 10 ml 血液样本，使用微流控富集来消耗白细胞 （104-倍数耗尽），但无需进一步纯化 CTC 或单独进行 CTC 显微操作 （图 6E，请参阅方法）。虽然 23 名年龄匹配的健康供体 （HD） 显示出最小的 DNA 低甲基化信号 （<0.6%），但 7 名转移性前列腺癌患者中有 6 名 （86%） 具有显着信号（测序读数的 0.62% 至 11.08%，P=0.00011），6/16 （37.5%） 的局限性前列腺癌患者（测序读数的 0.62% 至 2.29%，P=0.004）（图 6F和和6G6G系列
虽然我们的研究重点是前列腺肿瘤发生中早期甲基化变化的表征及其潜在的生物学后果，但我们也注意到最近将 CpG 岛高甲基化作为早期癌症检测 24,25 的基于血液的诊断测定的应用。DNA甲基化变化的全基因组筛查可能比基于突变的检测更敏感，特别是在前列腺癌等肿瘤中，这些肿瘤没有明确定义的复发性驱动突变。尽管如此，在所有测试的癌症中，早期前列腺癌的检出率最低（11.2%），使用筛查CpG岛高甲基化 25 。CTCs在发生转移之前很久就被浸润性局限性前列腺癌排入血液中 51–53 ，这增加了它们为早期癌症检测提供正交检测的可能性。鉴于癌细胞中DNA低甲基化结构域的特异性及其较大的基因组大小，我们推断，在血液样本中富集CTC后，它们可能为癌症检测提供高灵敏度和定量信号。对于这种基于血液的稀有细胞信号检测研究，我们对所有前列腺PMD进行了筛选，而不是对数量少得多的核心PMD进行了筛查，以增加对前列腺癌基因组很大一部分的覆盖率。Oxford Nanopore长读长非变性测序通常产生高达100 kb的测序读长，并直接鉴定甲基化的CpG残基（5mC），而无需在文库制备 54,55 中进行亚硫酸氢盐转化 图6A和和6B）。在6乙图 6C和和6D，6D的 4 图 6Etu 6F和和6G6G系列，表S4和S5）。因此，长程低甲基化结构域是前列腺癌的普遍特征，并且可以从患者来源的血液标本中的罕见 CTC 中检测到它们。纳米孔测序的简单性和成本效益提高了基于低甲基化的癌症检测的可能性。
虽然我们的研究重点是前列腺肿瘤发生中早期甲基化变化的表征及其潜在的生物学后果，但我们也注意到最近将 CpG 岛高甲基化作为早期癌症检测 24,25 的基于血液的诊断测定的应用。DNA甲基化变化的全基因组筛查可能比基于突变的检测更敏感，特别是在前列腺癌等肿瘤中，这些肿瘤没有明确定义的复发性驱动突变。尽管如此，在所有测试的癌症中，早期前列腺癌的检出率最低（11.2%），使用筛查CpG岛高甲基化 25 。CTCs在发生转移之前很久就被浸润性局限性前列腺癌排入血液中 51–53 ，这增加了它们为早期癌症检测提供正交检测的可能性。鉴于癌细胞中DNA低甲基化结构域的特异性及其较大的基因组大小，我们推断，在血液样本中富集CTC后，它们可能为癌症检测提供高灵敏度和定量信号。对于这种基于血液的稀有细胞信号检测研究，我们对所有前列腺PMD进行了筛选，而不是对数量少得多的核心PMD进行了筛查，以增加对前列腺癌基因组很大一部分的覆盖率。Oxford Nanopore 长读长非变性测序通常可产生高达 100 kb 的测序读长，并直接鉴定甲基化的 CpG 残基 （5mC），而无需在文库制备 54,55 中进行亚硫酸氢盐转化。 在目前的配置中，纳米孔信号分析不容易识别 5-羟甲基胞嘧啶 （5hmC），其丰度远低于 5mC，并且在常规亚硫酸氢盐测序中也无法与 5mC 区分开来。事实上，VCaP前列腺癌细胞系的纳米孔测序清楚地定义了DNA低甲基化结构域，这些结构域忠实地概括了使用标准亚硫酸氢盐测序在这些细胞中鉴定的结构域（图6A和6B）。In6B）。与较短的Illumina测序读长相比（通常隐藏<每次读取 5 个 CpG 位点），数学建模表明，纳米孔测序产生的长读取将显著提高稀有信号的检测精度（图 6C 和 6D，6D，参见方法）。 因此，我们处理了来自局限性或转移性前列腺癌患者的 10 ml 血液样本，使用微流控富集来消耗白细胞 （10 4 -倍数耗尽），但没有进一步的CTC纯化或单独的CTC显微操作（图6E，参见方法）。虽然 23 名年龄匹配的健康供体 （HD） 显示出最小的 DNA 低甲基化信号 （<0.6%），但 7 名转移性前列腺癌患者中有 6 名 （86%） 具有显着信号（测序读数的 0.62% 至 11.08%，P=0.00011），6/16 （37.5%） 的局限性前列腺癌患者（测序读数的 0.62% 至 2.29%，P=0.004）（图 6F 和 6G6G， 表S4和S5）。因此，长程低甲基化结构域是前列腺癌的普遍特征，并且可以从患者来源的血液标本中的罕见 CTC 中检测到它们。纳米孔测序的简单性和成本效益提高了基于低甲基化的癌症检测的可能性。
使用纳米孔测序检测血液样本中 CTC 衍生的 DNA 低甲基化。
（A） IGV 屏幕截图，显示 Oxford Nanopore 对散装 VCaP 细胞 [B] 的天然测序与 Illumina 对三个单个 VCaP 细胞 （#1、#2、#3） 的亚硫酸氢盐测序之间的 DNA 低甲基化测量结果的一致性。图中显示了整个 4 号染色体的 DNA 甲基化（黄色阴影中的低甲基化）。
（A） IGV 屏幕截图，显示 Oxford Nanopore 对散装 VCaP 细胞 [B] 的天然测序与 Illumina 对三个单个 VCaP 细胞 （#1、#2、#3） 的亚硫酸氢盐测序之间的 DNA 低甲基化测量结果的一致性。图中显示了整个 4 号染色体的 DNA 甲基化（黄色阴影中的低甲基化）。
（B）散点图显示Nanopore天然测序与Illumina亚硫酸氢盐测序之间的Pearson相关性较高（r=0.81）。
（C-D）数学建模显示，使用短读长（平均每次读长 5 个 CpG 位点）检测低甲基化 DNA 结构域的精度最低。通过询问预定的PMD而不是全基因组（图C），可以适度改善检测。使用 Nanopore 长读长测序（每次读长 10 或 50 CpGs）可预测显著提高精度。通过将纳米孔长读长（每次读长 >10 个 CpG 位点）与选定的分析预定 PMD 区域（图 D）相结合，获得最高的预测准确性。
（E）微流控CTC富集示意图（随后对散装细胞进行直接纳米孔测序（CTC纯度约为0.1%）。HMW，高分子量。
（F-G）通过纳米孔测序对低甲基化信号进行散点图定量，比较手术切除或放疗前转移性（图 F）或局限性前列腺癌患者的白细胞耗竭血液样本（图 G）与健康年龄匹配的男性供体 （HD）。误差线表示 SEM 的平均值。 P 值通过双尾学生 t 检验评估。虚线表示低甲基化信号的阈值，包括所有接受测试的健康供体，低甲基化信号高于该阈值的癌症患者比例被认为是阳性的。
（F-G）通过纳米孔测序对低甲基化信号进行散点图定量，比较手术切除或放疗前转移性（图 F）或局限性前列腺癌患者的白细胞耗竭血液样本（图 G）与健康年龄匹配的男性供体 （HD）。误差线表示 SEM 的平均值。 P 值通过双尾学生 t 检验评估。虚线表示低甲基化信号的阈值，包括所有接受测试的健康供体，低甲基化信号高于该阈值的癌症患者比例被认为是阳性的。
讨论 讨论
使用单细胞 DNA 甲基化分析，从惰性低级别局限性前列腺癌到转移性 CTC，我们以高分辨率注释了构成核心 PMD 的共享低甲基化结构域，以及散布的具有保留甲基化的岛屿，我们在这里将其鉴定为 PMI。已知 PMD 与细胞核的外周和转录沉默的 B 区室有关13,56，增加了PMI环入活性A区室区域的可能性，因此在空间上与周围的沉默染色质不同。鉴于细胞间异质性，核心 PMD 的内涵来自来自多个独立前列腺癌的许多单细胞的 PMD 交叉。然而，这些核心PMD也因其在最早的低级别前列腺癌（GS6）中的检测而脱颖而出，从而表明它们是由肿瘤发生的早期选择压力驱动的，并解释了它们在晚期前列腺癌中的普遍沉默。事实上，核心低甲基化结构域内的沉默似乎针对免疫相关基因，包括包含整个CD1基因家族的单个染色体位点和一组干扰素诱导基因。相比之下，PMI保留了与细胞周期和DNA损伤修复途径有关的增殖相关基因的表达。因此，DNA甲基化变化可能在前列腺癌发展中传达选择性优势，抑制有助于新生肿瘤免疫监视的基因的表达，同时屏蔽增强细胞增殖的邻近基因。这种选择压力可以驱动富含免疫的CD1A-IFI16位点的早期靶向，正如小鼠模型中的体内重建实验所证明的那样。虽然早期的PMD，如CD1A-IFI16位点，可能仅来自有利于逃避免疫监视的增殖前列腺细胞的选择压力，但这些位点也可能具有有利于早期DNA甲基化丢失的内在特性。
使用单细胞 DNA 甲基化分析，从惰性低级别局限性前列腺癌到转移性 CTC，我们以高分辨率注释了构成核心 PMD 的共享低甲基化结构域，以及散布的具有保留甲基化的岛屿，我们在这里将其鉴定为 PMI。已知PMD与细胞核的外周和转录沉默的B区室有关 13,56 ，增加了PMIs环入活性A区室的可能性，因此在空间上与周围的沉默染色质不同。鉴于细胞间异质性，核心 PMD 的内涵来自来自多个独立前列腺癌的许多单细胞的 PMD 交叉。然而，这些核心PMD也因其在最早的低级别前列腺癌（GS6）中的检测而脱颖而出，从而表明它们是由肿瘤发生的早期选择压力驱动的，并解释了它们在晚期前列腺癌中的普遍沉默。事实上，核心低甲基化结构域内的沉默似乎针对免疫相关基因，包括包含整个CD1基因家族的单个染色体位点和一组干扰素诱导基因。相比之下，PMI保留了与细胞周期和DNA损伤修复途径有关的增殖相关基因的表达。因此，DNA甲基化变化可能在前列腺癌发展中传达选择性优势，抑制有助于新生肿瘤免疫监视的基因的表达，同时屏蔽增强细胞增殖的邻近基因。 这种选择压力可以驱动富含免疫的CD1A-IFI16位点的早期靶向，正如小鼠模型中的体内重建实验所证明的那样。虽然早期的PMD，如CD1A-IFI16位点，可能仅来自有利于逃避免疫监视的增殖前列腺细胞的选择压力，但这些位点也可能具有有利于早期DNA甲基化丢失的内在特性。
核心PMD的早期低甲基化
低甲基化相关基因沉默发生早期并有利于肿瘤发生的模型在概念上与晚期结肠癌研究中提出的假设不同，后者低甲基化可能起到内在的肿瘤抑制机制，抑制不受控制的细胞增殖13.值得注意的是，结肠癌研究分析了大量肿瘤物质，包括癌细胞以及反应性基质和免疫细胞，因此它排除了免疫相关基因的分析，其起源细胞被全肿瘤测序混淆。因此，单细胞水平分析允许将DNA甲基化的所有变化分配给适当的细胞类型。然而，最重要的是我们对一小部分 PMD 的定义，这些子集被注释为核心 PMD（占所有 PMD 的 2.7%），它们出现在肿瘤发生的早期，并在多个独立的肿瘤中均匀共享。表观遗传沉默靶向的早期癌症驱动因素的鉴定可能与在随后的癌症进展过程中沉默的其他PMD编码基因的贡献不同，因为DNA低甲基化延伸到基因组的主要部分。与在早期癌症中发现的少量核心PMD相比，在晚期肿瘤中被低甲基化的癌症基因组的很大一部分可能因此反映了不同的选择压力，以及影响基因贫乏PMD的旁观者效应和重复元件的去抑制。虽然我们的研究以前列腺癌为中心，但核心PMDs的相关性延伸到其他癌症，正如TCGA分析所示，它们在多个肿瘤中具有一致的早期低甲基化，而大多数PMDs显示出相当大的肿瘤间异质性。事实上，TCGA甲基化数据显示，CD1A-IFI16基因座在33种不同癌症与其正常组织对应物之间的DNA甲基化差异最强。因此，这种特定的位点编码以前未被提名为关键癌症基因的免疫相关基因，因此似乎是肿瘤发生早期表观遗传沉默的一致靶标。我们使用去甲基化剂 5-氮杂胞苷和 EZH2 抑制剂 GSK126 的功能测定支持将染色质沉默标记募集到低甲基化的 PMD 上，作为转录沉默的机制。然而，需要进一步的研究来更好地了解PMD低甲基化在整个基因组中的选择性，以及将核心PMD与更全面的去甲基化区分开来的基因组结构和选择压力。
低甲基化相关基因沉默发生早期并有利于肿瘤发生的模型在概念上与晚期结肠癌研究中提出的假设不同，后者低甲基化可能起到内在的肿瘤抑制机制，抑制不受控制的 13 细胞增殖。值得注意的是，结肠癌研究分析了大量肿瘤物质，包括癌细胞以及反应性基质和免疫细胞，因此它排除了免疫相关基因的分析，其起源细胞被全肿瘤测序混淆。因此，单细胞水平分析允许将DNA甲基化的所有变化分配给适当的细胞类型。然而，最重要的是我们对一小部分 PMD 的定义，这些子集被注释为核心 PMD（占所有 PMD 的 2.7%），它们出现在肿瘤发生的早期，并在多个独立的肿瘤中均匀共享。表观遗传沉默靶向的早期癌症驱动因素的鉴定可能与在随后的癌症进展过程中沉默的其他PMD编码基因的贡献不同，因为DNA低甲基化延伸到基因组的主要部分。与在早期癌症中发现的少量核心PMD相比，在晚期肿瘤中被低甲基化的癌症基因组的很大一部分可能因此反映了不同的选择压力，以及影响基因贫乏PMD的旁观者效应和重复元件的去抑制。虽然我们的研究以前列腺癌为中心，但核心PMDs的相关性延伸到其他癌症，正如TCGA分析所示，它们在多个肿瘤中具有一致的早期低甲基化，而大多数PMDs显示出相当大的肿瘤间异质性。 事实上，TCGA甲基化数据显示，CD1A-IFI16基因座在33种不同癌症与其正常组织对应物之间的DNA甲基化差异最强。因此，这种特定的位点编码以前未被提名为关键癌症基因的免疫相关基因，因此似乎是肿瘤发生早期表观遗传沉默的一致靶标。我们使用去甲基化剂 5-氮杂胞苷和 EZH2 抑制剂 GSK126 的功能测定支持将染色质沉默标记募集到低甲基化的 PMD 上，作为转录沉默的机制。然而，需要进一步的研究来更好地了解PMD低甲基化在整个基因组中的选择性，以及将核心PMD与更全面的去甲基化区分开来的基因组结构和选择压力。
The CD1A-IFI16 immune gene cluster
CD1A-IFI16免疫基因簇
CD1A-IFI16 位点的独特之处在于包含了 CD1 基因的整个基因家族，这些基因与 IFI16 类干扰素诱导基因一起介导脂质抗原呈递。众所周知，在肿瘤发生过程中，位于单个基因组位点内的基因可能通过染色体缺失或扩增事件成为靶向，这种单一遗传事件可能介导物理聚集基因之间同时失去功能或获得功能。从概念上讲，在早期前列腺肿瘤发生过程中CD1A-IFI16位点的低甲基化沉默可能实现类似的功能，抑制T细胞对脂质抗原的识别以及双链DNA感应，作为影响两个等位基因的单个表观遗传事件的一部分。如此强大的选择压力可以解释癌症中该位点的早期和频繁靶向。1q23.1基因组位点在种系关联研究中与神经退行性疾病和自身免疫性疾病有关57,58，由其驻留基因调控的免疫途径与针对传染性病原体的先天免疫有关。这些基因在早期癌症免疫监视中的潜在作用将需要进一步的功能分析。抗原呈递途径的改变是肿瘤逃避先天性和治疗性免疫激活的最关键机制59,60. In this respect, the presentation of lipid antigens to NKT cells, a highly specialized subpopulation of T cells, is of particular interest, given potential therapeutic implications. Within prostate cancer, the silencing of CD1A-IFI16 genes is also noteworthy in that it points to tumor cell-intrinsic factors contributing to the escape from immune surveillance, in addition to the proposed immunosuppressive effects of the tumor microenvironment.
CD1A-IFI16 位点的独特之处在于包含了 CD1 基因的整个基因家族，这些基因与 IFI16 类干扰素诱导基因一起介导脂质抗原呈递。众所周知，在肿瘤发生过程中，位于单个基因组位点内的基因可能通过染色体缺失或扩增事件成为靶向，这种单一遗传事件可能介导物理聚集基因之间同时失去功能或获得功能。从概念上讲，在早期前列腺肿瘤发生过程中CD1A-IFI16位点的低甲基化沉默可能实现类似的功能，抑制T细胞对脂质抗原的识别以及双链DNA感应，作为影响两个等位基因的单个表观遗传事件的一部分。如此强大的选择压力可以解释癌症中该位点的早期和频繁靶向。1q23.1基因组位点在种系关联研究中与神经退行性疾病和自身免疫性疾病 57,58 有关，其驻留基因调控的免疫途径与针对传染性病原体的先天免疫有关。这些基因在早期癌症免疫监视中的潜在作用将需要进一步的功能分析。抗原呈递途径的改变构成了肿瘤逃避先天性和治疗性免疫激活的最关键机制 59,60 。在这方面，鉴于潜在的治疗意义，脂质抗原呈递给NKT细胞（一种高度特化的T细胞亚群）特别令人感兴趣。 在前列腺癌中，CD1A-IFI16基因的沉默也值得注意，因为它指出了肿瘤细胞内在因素有助于逃避免疫监视，以及肿瘤微环境的免疫抑制作用。
Diagnostic implications 诊断意义
最后，从癌症诊断的角度来看，基于血液的早期浸润性癌症检测仍然是一项重大的技术挑战。对于前列腺癌，它需要能够区分与血清 PSA 非特异性升高相关的惰性病变和可能具有相似血清 PSA 水平但需要治疗干预的更具侵袭性的癌症。早期浸润性前列腺癌在转移形成之前很久就将 CTC 排入循环中第51-53页，虽然这些罕见的早期CTC可能不足以引起传播，但它们可以作为侵袭性疾病的潜在生物标志物。对血液中非常罕见的 CTC 进行显微成像具有挑战性，因此需要对富含 CTC 的血液样本进行灵敏和定量的分子读数。虽然这项研究并非旨在正式测试PMD的纳米孔测序作为CTC的定量分子替代物，但它表明，这种长程DNA测序策略可以补充当前依赖于短ctDNA片段中CpG岛的高甲基化的方法。鉴于这种远程基因组分析固有的信息内容，这些方法还可以增强组织起源的测定。
最后，从癌症诊断的角度来看，基于血液的早期浸润性癌症检测仍然是一项重大的技术挑战。对于前列腺癌，它需要能够区分与血清 PSA 非特异性升高相关的惰性病变和可能具有相似血清 PSA 水平但需要治疗干预的更具侵袭性的癌症。早期浸润性前列腺癌在转移形成 第51-53页 之前很久就将 CTC 释放到循环中，虽然这些罕见的早期 CTC 可能不足以引起扩散，但它们可以作为侵袭性疾病的潜在生物标志物。对血液中非常罕见的 CTC 进行显微成像具有挑战性，因此需要对富含 CTC 的血液样本进行灵敏和定量的分子读数。虽然这项研究并非旨在正式测试PMD的纳米孔测序作为CTC的定量分子替代物，但它表明，这种长程DNA测序策略可以补充当前依赖于短ctDNA片段中CpG岛的高甲基化的方法。鉴于这种远程基因组分析固有的信息内容，这些方法还可以增强组织起源的测定。
研究的局限性 研究的局限性
我们的研究表明，前列腺癌中核心PMD的早期低甲基化差异性地沉默了免疫监视相关基因，同时保留了介导细胞增殖的基因。虽然我们在多种不同的癌症中发现了核心PMD的共同模式，但不同的肿瘤类型也有可能针对其他生物学相关途径。需要对不同的早期癌症进行额外的研究，以区分共享的低甲基化靶标和显示组织特异性模式的靶标，并且需要分析每种肿瘤类型中的其他患者来源的样本。脂质抗原呈递基因和IFI16相关双链DNA感应基因在免疫监视中的潜在作用值得使用额外的实验系统进行进一步的功能分析，以确定它们在早期肿瘤发生的相关性，以及它们对抗癌治疗的潜在相关性。最后，PMD检测在基于血液的癌症诊断中的潜在效用将需要在大量不同的临床标本中进一步验证。
我们的研究表明，前列腺癌中核心PMD的早期低甲基化差异性地沉默了免疫监视相关基因，同时保留了介导细胞增殖的基因。虽然我们在多种不同的癌症中发现了核心PMD的共同模式，但不同的肿瘤类型也有可能针对其他生物学相关途径。需要对不同的早期癌症进行额外的研究，以区分共享的低甲基化靶标和显示组织特异性模式的靶标，并且需要分析每种肿瘤类型中的其他患者来源的样本。脂质抗原呈递基因和IFI16相关双链DNA感应基因在免疫监视中的潜在作用值得使用额外的实验系统进行进一步的功能分析，以确定它们在早期肿瘤发生的相关性，以及它们对抗癌治疗的潜在相关性。最后，PMD检测在基于血液的癌症诊断中的潜在效用将需要在大量不同的临床标本中进一步验证。
STAR 方法 STAR 方法
资源可用性 资源可用性
牵头联系人
重新分析本文中报告的数据所需的进一步信息以及对资源和试剂的请求应直接发送给牵头联系人 Daniel A. Haber （ude.dravrah.hgm@rebahd），并由其完成。
主要联系人 重新分析本文中报告的数据所需的进一步信息以及对资源和试剂的请求应直接发送给主要联系人 Daniel A. Haber （ude.dravrah.hgm@rebahd）。
材料可用性
本研究中产生的质粒可根据书面要求提供。
材料可用性 本研究中产生的质粒可根据书面要求提供。
数据和代码可用性
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- 本研究中的所有原始和处理测序数据，包括单细胞 DNA 甲基化测序、单细胞 RNA-seq、ChIP-seq、切割和运行测定以及纳米孔测序，均已存入 NCBI 基因表达综合 （GEO） 数据库GSE208449.截至发布之日，所有数据均公开提供。
本研究中的所有原始和处理测序数据，包括单细胞 DNA 甲基化测序、单细胞 RNA-seq、ChIP-seq、切割和运行测定以及纳米孔测序，均已存入 NCBI 基因表达综合 （GEO） 数据库，并已列入 GSE208449。截至发布之日，所有数据均公开提供。 - 本文分析了现有的、公开可用的数据或应作者要求提供的数据。数据集的这些登录号列在关键资源表.
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试剂或资源 源 标识符 抗体 小鼠抗CD45生物素化（克隆2D1）
小鼠抗CD45生物素化（克隆2D1）安迪生物R&D 货号# BAM1430;RRID：AB_356874
货号# BAM1430;RRID：AB_356874小鼠抗CD66b（克隆80H3）
小鼠抗CD66b（克隆80H3）Bio-Rad MCA216T; RRID:AB_2291565 MCA216T;RRID：AB_2291565 Mouse anti-human CD16 biotinylated (clone 3G8)
小鼠抗人CD16生物素化（克隆3G8）BD Biosciences 碧迪医疗生物科学 Cat#555405; RRID:AB_395805
货号#555405;RRID：AB_395805AF488-conjugated mouse anti-human EpCAM (clone VU1D9)
AF488偶联小鼠抗人EpCAM（克隆VU1D9）Cell Signaling Technology
细胞信号转导技术Cat#5198; RRID:AB_10692105
货号#5198;RRID：AB_10692105PE-conjugated mouse antibody anti-CD45 (clone HI30)
PE偶联小鼠抗体抗CD45（克隆HI30）BD Biosciences 碧迪医疗生物科学 Cat#560975; RRID:AB_2033960
货号#560975;雷达：AB_2033960Rabbit anti-histone H3K27me3 (Western blot)
兔抗组蛋白H3K27me3（蛋白质印迹）Thermo Fisher Scientific 赛默飞世尔科技 Cat#MA5–11198; RRID:AB_2899176
货号#MA5–11198;RRID：AB_2899176Rabbit anti-histone H3K27me3 (ChIP and CUT&RUN) Active motif Cat#39155; RRID:AB_2561020 Rabbit anti-histone H3K9me3 (ChIP) Abcam Cat#ab8898; RRID:AB_306848 Rabbit anti-IgG control (clone DA1E) (CUT&RUN) Cell Signaling Technology Cat#66362; RRID:AB_2924329 Rabbit anti-histone H3 total Abcam Cat#1791; RRID:AB_302613 Rabbit anti-H3K27me3 (clone C36B11) (immunofluorescence) Cell Signaling Technology CST#9733; RRID:AB_2616029 APC conjugated mouse anti-human CD1d (FACS) BioLegend Cat#350308; RRID:AB_10642829 APC conjugated mouse anti-human CD1d (clone CD1d42) BD Biosciences BD#563505; RRID:AB_2738246 APC-conjugated isotype control BD Biosciences BD#555751 Rat inVivoMab anti-mouse CD1d (clone 20H2) (FACS for Myc-CaP cells) Bio X Cell #BE0179; RRID:AB_10949293 Rat InVivoPlus anti-mouse isotype control (clone HRPN) (FACS for Myc-CaP cells) Bio X Cell #BE0088; RRID:AB_1107775 APC conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific Cat#A10540 Rat anti-mouse CD16/CD32 blocking reagent (Clone: 2.4G2) BD Biosciences Cat#553142; RRID:AB_394657 BV510-viability dye BD Biosciences BD#564406; RRID:AB_2869572 APC-α-GalCer-mCD1d Tetramer TetramerShop Cat#MCD1d–001 BV711-conjugated anti-mouse CD69 (clone: H1.2F3) BioLegend Cat#104537; RRID:AB_2566120 PerCP-Cy5.5-conjugated anti-mouse TCRβ (clone: H57–597) Biolegend Cat#109228; RRID:AB_1575173 BV605-conjugated anti-mouse CD3e (clone: 145–2C11) BioLegend Cat#100351; RRID:AB_2565842 BUV395-conjugated anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) BioLegend Cat#564144 BV711- conjugated anti-mouse CD8a (clone: 53–6.7) BioLegend Cat#100759; RRID:AB_2563510 BV650- conjugated anti-mouse CD4 (clone: RM4–5) BioLegend Cat#100546; RRID:AB_2562098 FITC- conjugated anti-mouse CD44 (clone: IM7) BioLegend Cat#103006; RRID:AB_312957 PE-Cy7- conjugated anti-mouse PD-1 (clone: RMP1–30) BioLegend Cat#109110; RRID:AB_572017 BV421-conjugated anti-mouse TIM3 (clone: 5D12) BioLegend Cat#747626 APC- conjugated anti-mouse TIGIT (clone: 4D4/mTIGIT) BioLegend Cat#156106; RRID:AB_2750515 BV785- conjugated anti-mouse LAG3 (clone:C9B7W) BioLegend Cat#125219; RRID:AB_2566571 PE- conjugated anti-mouse TNFα (clone: MP6-XT22) BioLegend Cat#506306; RRID:AB_315427 BV650- conjugated anti-mouse CD4 (clone: RM4–5) BioLegend Cat#100546; RRID:AB_2562098 BV605-conjugated anti-mouse IFNγ (clone: XMG1.2) BioLegend Cat#505840; RRID:AB_2734493 Biological samples Healthy donors for blood samples This paper N/A Blood samples from patients with a diagnosis of localized of metastatic prostate cancer This paper N/A Localized tumor tissue cohort (core biopsies or surgical resection) This paper N/A Chemicals, peptides, and recombinant proteins 5-azacitidine Selleck Cat#S1782 GSK126 Selleckchem Cat#S7061 MNase enzyme (micrococcal nuclease) NEB Cat# M0247S G418 Sigma Aldrich Cat#G8168 Blasticidin InvivoGen Cat#ant–bl–05 Cell Stimulation Cocktail eBioscience Cat#00–4970–93 Protein Transport Inhibitor Cocktail eBioscience Cat#00–4980 Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Invitrogen Cat#65–601 Critical commercial assays EZ DNA methylation kit Zymo Cat#D5001 Zero blunt PCR cloning kit ThermoFisher Cat#K270020 Magnetic MyOne Carboxylic Acid Beads Invitrogen Cat#65011 NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit NEB Cat#E7645L CUT&RUN Assay kit Cell Signaling Technology Cat#86652S RNeasy Mini kit QIAGEN Cat#74104 SuperScript III One-Step qRT-PCR kit Invitrogen Cat#11732020 NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning kit NEB Cat#E5520S BD Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences Cat#554714 HMW DNA extraction kit QIAGEN Cat#67563 Rapid Barcoding Kit Nanopore Cat#SQK–RBK004 Deposited data Raw and analyzed data This paper GEO: GSE208449 Human reference genome NCBI build 37, GRCh37 (hg19) Genome Reference Consortium https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/ Illumina Infinium Human Methylation 450 K BeadChip National Cancer
Institute’s GDC Data Portalhttps://portal.gdc.cancer.gov DNA Methylation 450 K BeadChip datasets National Cancer
Institute’s GDC Data Portalhttps://portal.gdc.cancer.gov TCGA (PRAD samples) CBioPortal https://www.cbioportal.org/ Methylation profiles (TCGA cohorts, 33 cancer types) TCGA Research Network https://portal.gdc.cancer.gov Genome annotations (TSS, exon, intron, intragenic regions, CpG islands (CGIs), repetitive elements and UCSC gap regions) - UCSC genome table browser Karolchik et al, 2004 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables DNA methylation datasets (colon and thyroid) Timp et al, 2014 GEO: GSE53051 DNA methylation of normal prostate tissues and primary prostate tumors Yu et al., 2013 Obtained from authors. https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2013.08.018 DNA methylation of metastatic prostate tumors Zhao et al., 2020 dbGAP: phs001648 Experimental models: Cell lines Human prostate cancer cell line (LNCaP, clone FGC) ATCC CRL–1740 Human prostate cancer cell line (VCaP) ATCC CRL–2876 Human prostate cancer cell line (PC3) ATCC CRL–1435 Human prostate cancer cell line (22Rv1 ) ATCC CRL–2505 Murine prostate cancer line (Myc-CaP) ATCC CRL–3255 Normal cultured prostate epithelial cells (HPrEC) ATCC PCS–440–010 Benign prostatic hypertrophy cells (BPH-1) Sigma-Aldrich SCC256 Murine Lewis lung carcinoma cells (LLC-1) ATCC CRL–1642 Experimental models: Organisms/strains Mouse: FVB mice Jackson Laboratory Strain#001800 Mouse: NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson Laboratory Strain#005557 Mouse: C57BL/6 Jackson Laboratory Strain#000664 Oligonucleotides Primers for qRT-PCR This paper Table S3 Primers for Bisulfite PCR This paper Table S3 Recombinant DNA pLenti-murine Cd1d1-mGFP Origene Cat#MR226027L4 pLenti-C-mGFP Origene Cat#PS100093 pLenti-Ifi204-Myc-DDK-Puro Origene Cat#MR222527L3 pLenti-C-Myc-DDK-Puro Origene Cat#PS100092 lentiCRISPRv2-blast Addgene Cat#98293; RRID:Addgene_98293 N174-MCS Addgene Cat#81061; RRID:Addgene_81061 pMD2.G Addgene Cat#12259; RRID:Addgene_12259 psPAX2 Addgene Cat#12260; RRID:Addgene_12260 Software and algorithms QUMA Kumaki et al., 2008 http://quma.cdb.riken.jp/ ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/ FlowJo software (v10.4) BD Bioscience https://www.flowjo.com/ Trim Galore (v0.4.3) Babraham Bioinformatics https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore Tophat (v2.1.1) Trapnell et al., 2012 https://github.com/infphilo/tophat Samtools (v1.3.1) Li et al., 2009 http://samtools.sourceforge.net/ HTseq (v0.6.1) Anders et al., 2015 https://htseq.readthedocs.io/en/master/ Cufflinks (v2.1.1) Trapnell et al., 2012 https://github.com/cole-trapnell-lab/cufflinks R (v3.1.2) R Core Team, 2021 https://www.R-project.org/ Graph Prism 9 GraphPad https://www.graphpad.com/ Bismark tool (v0.17.0) Krueger and Andrews, 2011 https://github.com/FelixKrueger/Bismark UCSC lift-over tool Hinrichs et al., 2006 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver ABSOLUTE algorithm Carter et al., 2012 http://software.broadinstitute.org/cancer/cga/absolute_download Molecular Signatures Database (MSigDB) (v7.2) Broad Institute & UC San Diego
Subramanian, Tamayo et al., 2005
Liberzon et al., 2011https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp Bioconductor package regioneR (v1.18.1) with overlapPermTest function Gel et al., 2016 https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/regioneR.html Ginkgo Garvin et al., 2015 http://qb.cshl.edu/ginkgo InferCNV (V 1.10.1) Tickle et al., 2019 https://github.com/broadinstitute/infercnv BWA men Li and Durbin, 2009 https://github.com/lh3/bwa Sambamba Tarasov et al., 2015 https://github.com/biod/sambamba MACS2 (v2.0.10) Zhang et al., 2008 https://github.com/macs3-project/MACS DeepTools Ramirez et al., 2016 https://github.com/deeptools/deepTools phyper R function Johnson et al., 1992 https://www.R-project.org/ ONT Albacore software (v2.3.1) Oxford Nanopore Technologies https://nanoporetech.com/community Nanopolish software (v0.10.2) Simpson et al., 2017 https://github.com/nanoporetech/nanopolish PRROC R-package Grau et al., 2015 https://cran.r-project.org/web/packages/PRROC/index.html BioRender BioRender https://www.biorender.com/ Other Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen Cat#1668019 LentiX concentrator Clontech Labs NC0448638 Polybrene Santa Cruz sc–134220 Nanopore MinION device with R9.4 flowcell Oxford Nanopore Technologies FLO–MIN106D HRP conjugated secondary antibodies Bio-rad Cat#5196–2504 Laemmli buffer Sigma S3401–10VL - This paper does not report original code. All the scripts and mathematical algorithms used in this study will be available from the corresponding authors upon request.
本文不报告原始代码。本研究中使用的所有脚本和数学算法将根据要求从通讯作者处获得。 - All the versions of software packages used in this study are listed in the key resource table and noted in the data analysis method accordingly.
- Any additional information required to reanalyze the data reported in this paper is available from the lead contact upon request.
重新分析本文中报告的数据所需的任何其他信息可根据要求从主要联系人处获得。
Experimental model 实验模型
Clinical Specimens
All patient samples were collected in this study after written informed consent, in accordance with Institutional Review Board (IRB) protocols (DF/HCC 05–300, 11–497, 13–217 or 14–375). For the CTC cohort, 10–20 ml of blood was drawn from patients with a diagnosis of metastatic prostate cancer, localized prostate cancer, or age-matched males without a diagnosis of cancer at Massachusetts General hospital (MGH). For the localized tumor tissue cohort, all samples were acquired from either core biopsies or surgical resection of untreated localized prostatic adenocarcinoma (Gleason scores 6 and 8) from patients at MGH. In cases with the lowest grade tumors (Gleason score 6), normal prostate tissue was also identified in the tissue specimen by a Genito-Urinary (GU) specialized pathologist and used as a source of matched normal prostate cells. Both normal and tumor tissue samples were de-identified, snap frozen and sectioned. Only tumor sections with >80% tumor content, as assessed by a specialized GU pathologist were used in this study. The clinical data of the patients with metastatic prostate cancer enrolled in the single-cell CTC analysis and patients with resected localized prostate cancer used for single nucleus analysis are described in Table S1. The clinical data of the patients with localized prostate cancer and metastatic prostate cancer enrolled in Nanopore sequencing anlysis of CTC-enriched blood are described respectively in Table S4 and Table S5.
Cell culture
Human prostate cancer cell lines (LNCaP, VCaP, PC3 and 22Rv1), murine prostate cancer line (Myc-CaP), normal cultured prostate epithelial cells (HPrEC), benign prostatic hypertrophy cells (BPH-1) and murine Lewis lung carcinoma cells (LLC-1) were all obtained from ATCC, after authentication by short tandem repeat (STR) profiling. All cell lines used in the paper were derived from male mice or male human patients. They were cultured in the following media at 37°: RPMI-1640 (ATCC) medium supplemented with 10% FBS (Gibco) and 1X Pen/Strep (Gibco) (for LNCaP, VCaP, PC3, 22Rv1 and BPH-1 cells); Prostate Epithelial Cell medium (ATCC) with 6 nM L-glutamine (ATCC), 0.4% Extract P (ATCC), 1.0 mM Epinephrine (ATCC), 0.5 ng/ml rh-TGFα (ATCC), 100ng/ml hydrocortisone hemisuccinate (ATCC), 5 mg/ml rh-Insulin (ATCC), 5 mg/ml Apo-transferrin (ATCC), 33 μM Phenol red (ATCC) and 1X Pen/Strep/Ampho Solution (ATCC) (for HPrEC cells); DMEM high glucose medium (Gibco) with 10% FBS (Gibco) and 1X Pen/Strep (Gibco) (for Myc-CaP cells and LLC-1 cells). All the cell lines used in this study were checked for mycoplasma every 4 months using Mycoalert kit (Lonza).
Mouse xenograft assays
All animal experiments were carried out in accordance with approved protocols by the MGH Subcommittee on Research Animal Care (IACUC). All the mice used in this study were maintained under a 12/12 h light/dark cycle in MGH animal facility. 6–8 weeks old FVB male mice (Jackson Laboratory, Strain#001800) or 6–8 weeks old male immunodeficient NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice (Jackson Laboratory, Strain#005557) were used for intraprostatic injection or subcutaneous injection of Myc-CaP cells stably expressing luciferase and mCherry. 6–8 weeks old C57BL/6 female mice (Jackson Laboratory, Strain#000664) were used for subcutaneous injection of LLC-1 cells stably expressing luciferase. Littermates of the same sex were randomly assigned to experimental groups. For intraprostatic inoculation, mice were first anesthetized using isoflurane, and a 1 cm skin incision was performed along the midline of the abdomen to expose the inner muscle layer, which was then separated. The tip of seminal vesicle was raised gently with forceps to expose the anterior lobe of the prostate gland. 50,000 Myc-CaP cells 1:1 mixed with Matrigel (v/v) (total volume: 30 μl) were slowly injected into the prostate lobe. All the tissues were then returned into the abdomen, and continuous sutures were used to close the inner muscle layer, followed by separate skin closure. For subcutaneous injections, mice were anesthetized, and 50,000 Myc-CaP cells or 1,000,000 LLC-1 cells 1:1 mixed with Matrigel (v/v) (total volume: 100 μl) were injected into the flank. Tumor cell-derived bioluminescent signal was quantified every other day for the Myc-CaP cells and 3 times a week for the LLC-1 for mice after either orthotopic injection or subcutaneous injection. At 2–3 weeks after inoculation, mice were sacrificed and tumors were harvested for flow cytometry and RNA extraction for the Myc-CaP experiments.
Method Details 方法详细信息
CTC isolation
CTCs were isolated from fresh blood specimens drawn from patients with prostate cancer, following negative depletion of leukocytes using the microfluidic CTC-iChip as reported previously26,27. Briefly, 10–20 ml of whole blood specimens were incubated with biotinylated antibody cocktails against CD45 (R&D Systems, clone 2D1), CD66b (AbD Serotec, clone 80H3), and CD16 (BD Biosciences), followed by incubation with Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Invitrogen) for magnetic labeling and depletion of leukocytes. After CTC-iChip processing, the CTC-enriched product was further stained with FITC-conjugated antibody against EpCAM (Cell Signaling Technology, clone VU1D9) and PE-conjugated antibody against CD45 (BD Biosciences, clone HI30). Single CTCs (FITC positive and PE negative) or white blood cells (WBCs, FITC negative and PE positive) were individually picked into PCR tubes containing 5 μl RNA/DNA lysis buffer using micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK 2) and snap-frozen in liquid nitrogen. In total, 38 CTCs from 5 different patients (GU114, GU169, GU181, GU216 and GURa15) with metastatic prostate cancer were individually picked, sequenced and lineage-confirmed based on transcriptome and DNA copy number. One patient sample (GU169) had only one CTC, and it was therefore excluded from some downstream analyses focused on the four patients with multiple CTCs.
Nuclei isolation from frozen tumor sections
Tumor tissue sections with high tumor content (>80%) and adjacent normal tissue section were micro-dissected and transferred into a pre-chilled Dounce homogenizer containing ice-cold 1 ml 1X HB buffer (0.26 M sucrose, 30 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM Tricine-KOH, 1 mM DTT, 0.5 mM Spermidine, 0.15 mM Spermine, 0.3% NP-40 and 1X complete protease inhibitor). Tissue was homogenized with ~10 strokes of “A” loose pestle, followed by another ~10 strokes of “B” tight pestle. The tissue homogenate was then filtered using a 70 μm strainer and pelleted by centrifugation. Nuclear pellets were resuspended and purified by density gradient centrifugation (top layer: 25% Iodixanol solution; middle layer: 30% Iodixanol solution; bottom layer: 40% Iodixanol solution). The nuclear band at the interface of 30% and 40% Iodixanol solutions was collected into a new Eppendorf tube and washed twice with ice-cold 1X PBS. 20% of the purified nuclei were used to isolate single nuclei using fluorescence-activated cell sorting (FACS) for single-cell DNA methylation analysis, while the remaining 80% of the nuclei were subjected to ChIP-seq analysis.
Western Blot
Cells or tumor tissues were lysed in Laemmli buffer (Sigma) and cleared. Protein concentration was determined using DC protein assay (Bio-rad). Proteins (25 μg) were separated on precast NuPAGE 4–12% Bis-Tris protein gels (ThermoFisher), and transferred onto nitrocellulose membranes (Bio-Rad). After blocking with 5% BSA buffer for 1 hour at room temperature, membranes were incubated with primary antibodies overnight at the recommended concentrations. HRP conjugated secondary antibodies (1:10,000; Bio-rad; Cat#5196–2504) were applied, and ultra-sensitive autoradiography film (Amersham) was used to detect the chemiluminescence signal. Primary antibodies used are H3K27me3 (1:1,000, Invitrogen Cat#MA5–11198) and H3 total (1:1,000, Abcam Cat#1791).
5-Azacytidine treatment, bisulfite sequencing and staining of chromatin marks
The human prostate epithelial cell line BPH-1 was cultured in the presence of 5 μM 5-azacitidine (Selleck, #S1782). At serial time points (days 0, 1, 4 and 5), cells were collected for DNA extraction, confocal microscopy, or flow cytometric analysis. DMSO-treated cells were used as control at each time point. To quantify 5-azacitidine-induced demethylation at the genomewide level, we used the whole genome bisulfite sequencing (WGBS). Briefly, DNA ws extracted from BPH-1 cells upon 5-azacitidine treatment, 1 μg genomic DNA was used to sonicate into 300–500 bp fragments, DNA was end-polished, A-tailed and ligated with pre-methylated adaters before bisulfite conversion using EZ DNA methylation kit (Zymo, #D5001), bisulfite-converted DNA was amplified and sample index was introduced during amplification. To quantify 5-azacytidine-induced demethylation at the CD1A-IFI16 locus, DNA extracted from BPH-1 cells treated with 5-azacitidine was subjected to bisulfite conversion using EZ DNA methylation kit (Zymo, #D5001), and bisulfite-converted DNA was used for PCR amplification, applying bisulfite-specific PCR primers covering the human CD1A-IFI16 locus (see Table S3). PCR products were purified by 1% agarose gel and cloned using the Zero blunt PCR cloning kit (ThermoFisher, #K270020). 10 individual bacterial clones were randomly picked for Sanger sequencing. Sequencing data were analyzed and shown using online tool QUMA (http://quma.cdb.riken.jp/)61. Nuclear accumulation of H3K27me3 was stained with H3K27me3 antibody (1:1000 dilution; CST#9733), in 5-azacytidine-treated cells. Images were acquired using a Zeiss LSM710 Lase Scanning Confocal and were quantified by quantitative image analysis of cells (ImageJ). Flow cytometry was also performed at serial time points on BD LSRFortessa machine to assess CD1d expression using human CD1d-APC antibody (1:100 dilution; BioLegend#350308, clone: 51.1).
EZH2 inhibitor treatment
Human prostate cancer cell lines (22Rv1, LNCaP and VCaP) were cultured in the presence of the small molecule EZH2 inhibitor GSK126 (Selleckchem, #S7061) at the indicated concentration (0, 5 or 10μM). After 6 days of treatment, protein and RNA were harvested, for quantitation of H3K27me3 and total H3, using Western blotting and expression of individual genes within the CD1A-IFI16 locus by real time qPCR.
Paired single-cell DNA methylation and RNA-seq
For these experiments, we used either single CTCs or WBCs individually picked from fresh blood specimens after CTC enrichment, and single cells from cultured prostate cell lines (either picked or FACS-sorted). These were subjected to paired single-cell DNA methylation and RNA-seq analysis to obtain the transcriptomes and DNA methylomes from the same single cells33,62. Briefly, single cells were first lysed in 5 μl DNA/RNA lysis buffer; 0.5 μl Magnetic MyOne Carboxylic Acid Beads (Invitrogen, Cat#65011) were then added to each single cell lysate to facilitate segregation of nucleus versus cytoplasm. After centrifugation and magnetic separation, the supernatant (containing cytoplasmic RNA) was transferred into a new tube for single-cell RNA-seq amplification using the SMART-seq2 protocol63, while the pellet (aggregated beads with the intact nucleus) was resuspended in DNA methylation lysis buffer and subjected to single-cell whole genome methylation sequencing using the scBS-seq protocol64. Single nuclei sorted from the frozen primary prostate tumor sections were also subjected to the scBS-seq procedure.
MNase native ChIP-seq
Purified nuclei from frozen tissue sections were subjected to MNase native ChIP-seq following the ULI NChIP procedure, as published elsewhere65. Briefly, nuclei were suspended in Nuclear Isolation Buffer (Sigma) supplemented with 1% TritonX 100, 1% Deoxycholate and 1X complete protease inhibitor. Chromatin was digested by MNase enzyme (NEB, 1:10 diluted) at 21°C for 7.5 min, and further diluted in Complete Immunoprecipitation Buffer, with 1X complete protease inhibitor. 2 μl ChIP-grade H3K27me3 (Active motif, Cat#39155) or H3K9me3 (Abcam, Cat#ab8898) antibody was incubated with the digested chromatin overnight at 4°C. DNA was then purified using protease K digestion followed by phenol-chloroform extraction. ChIP-seq sequencing libraries were prepared using NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (NEB, Cat#E7645L).
Cut and Run Assay
H3K27me3 and H3K9me3 Cut and Run assays were performed with cultured prostate cell lines (LNCaP, 22Rv1, BPH-1, HPrEC and Myc-CaP), using the CUT&RUN Assay kit (CST, Cat#86652S). Briefly, 100,000 freshly cultured prostate cells were collected and incubated with Concanavalin A Magnetic Beads. 2 μl ChIP-grade H3K27me3 (Active motif, Cat#39155) or H3K9me3 (Abcam, Cat#ab8898) or IgG (CST, Cat#66362S) antibody was added to the cell: bead suspension and incubated overnight at 4°C. 1.5 μl pAG-MNase enzyme was then added to the tube, which was rotated for 1 h at 4°C, followed by activation of pAG-MNase using 3 μl cold Calcium Chloride. The activation reaction was stopped and DNA was further diluted and collected for phenol-chloroform extraction. Cut and Run sequencing libraries were constructed using NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (NEB, Cat#E7645L).
Next generation sequencing
All the single-cell RNA-seq, single-cell DNA methylation, MNase ChIP-seq, Cut and Run samples and WGBS samples were molecularly barcoded, pooled together and sequenced on a HiSeq X sequencer to obtain 150 bp pair-ended reads (Novogene).
RNA extraction, reverse transcription and quantitative PCR (qPCR)
RNA extracted from cultured prostate cells was prepared using the RNeasy Mini kit (QIAGEN) with DNase I digestion on the column. To extract RNA from mouse tumor tissues, these were first dissected to remove connective tissue and fat, and washed extensively with 1X PBS to remove excessive blood or necrotic tissues. Tumors were then homogenized in RLT RNA lysis buffer using a Dounce homogenizer, and passed through a QIAshredder column (QIAGEN). RNA from normal prostate of FVB mice were prepared following a similar method. RNA from tissue homogenate was extracted using the RNeasy Mini kit (QIAGEN) with DNase I digestion on the column. cDNA was synthesized from 50–200 ng RNA using SuperScript III One-Step qRT-PCR kit (Invitrogen). qPCR was performed using the primers listed in Table S3.
CD1d expression measurement by flow cytometry
Cell surface protein expression of CD1d in human and mouse prostate cells was assessed by flow cytometry. Cells were first trypsinized, and 500,000 cells were used for staining with antibody against CD1d at 4°C for 20 min, followed by washing and quantitation using a BD LSRFortessa machine, and data were analyzed using FlowJo software (v10.4; https://www.flowjo.com/). Antibodies used were as follows: for human prostate cell lines, APC conjugated anti-human CD1d (BD#563505, clone: CD1d42) and APC-conjugated isotype control (BD#555751); for Myc-CaP cells, anti-mouse CD1d (Bio X Cell #BE0179, clone 20H2) and the isotype control (Bio X Cell #BE0088), and secondary antibody anti-rat IgG conjugated with APC (Invitrogen #A10540).
Plasmid construction
A lentiviral murine Cd1d1 expression construct (pLenti-Cd1d1-mGFP, Cat#MR226027L4) and its matched control construct (pLenti-C-mGFP, Cat#PS100093) were obtained from Origene. Murine Ifi204 expression vector (pLenti-Ifi204-Myc-DDK-Puro, Cat#MR222527L3), together with its control vector (pLenti-C-Myc-DDK-Puro, Cat#PS100092) were also purchased from Origene, and the puromycin selection cassette of these two Origene plasmids were replaced by blasticidin from lentiCRISPRv2-blast plasmid (Addgene#98293) using NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning kit (NEB, Cat#E5520S). For the LLC-1 experiment, the murine Cd1d1 was cloned into the receiving vector N174-MCS (Addgene#81061) with the restriction enzymes EcoR1 and Mlu1, using the FastDigest protocol of Thermo Scientific. All final construct sequences were confirmed by Sanger sequencing. Plasmids generated in this study are available upon written request.
Lentiviral transduction
Early passage 293T cells were transfected with Cd1d1 or Ifi204 lentiviral constructs, together with pMD2.G (Addgene#12259) and psPAX2 (Addgene#12260) packaging plasmids using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen). 48–72 h after transfection, culture medium (containing lentiviral particles) was collected, filtered and concentrated using LentiX concentrator (Clontech). Concentrated virus was added to the Myc-CaP cells in presence of polybrene (Santa Cruz, 8 μg/ml as final concentration) overnight. FACS was used to select GFP positive cells as marker of Cd1d1 construct transduction in the Myc-CaP cells. The LLC-1 cells transduced with the Cd1d1 cloned in the the N174-MCS vector were selected using G418 (Sigma Aldrich #G8168) at 400 μg/mL for 4–6 days. To obtain stable Ifi204 overexpression, 10 μg/ml blasticidin (InvivoGen) was added to the medium for 5–7 days selection.
Tumor immune infiltration assayed by flow cytometry
流式细胞术测定肿瘤免疫浸润
Mouse tumors generated by intraprostatic injection of control or Cd1d1-expressing Myc-CaP cells were dissected and washed to remove blood, fat and connective tissues. Tumor tissues were further mashed and digested in 5 ml digestion buffer (RPMI1640, 2.5 mg/ml collagenase D, 0.1 mg/ml DNase I) at 37°C for 30 min. Tissue digestion was stopped by adding another 5 ml RPMI1640 with 2% FBS, and then filtered through 70 μm strainers. The tissue cell suspension was obtained in the same way for tumors generated by subcutaneous injection of control or Ifi204 expressing Myc-CaP cells. To stain for NKT cell infiltration in prostate tumors with control or Cd1d1 expression, the single-cell suspension was first blocked with rat anti-mouse CD16/CD32 blocking reagent (BD#553142, Clone: 2.4G2) at 4°C for 30 min, followed by mouse NKT surface antibody cocktail staining at 4°C for another 30 min. The mouse NKT surface antibodies used in this study were: BV510-viability dye (BD#564406), APC-α-GalCer-mCD1d Tetramer (TetramerShop#MCD1d-001), BV711-CD69 (BioLegend#104537, clone: H1.2F3), PerCP-Cy5.5-TCRβ (BioLegend#109228, clone: H57–597), BV605-CD3e (BioLegend#100351, clone: 145–2C11) and BUV395-NK1.1 (BD#564144, clone: PK136). Cells obtained from mouse tumors with control or Ifi204 expression were split into two fractions, with the first fraction stained using a panel of mouse T cell surface antibody cocktails: BV510-viability dye (BD#564406), PerCP-Cy5.5-TCRβ (Biolegend#109228, clone: H57–597), BV711-CD8 (Biolegend#100759, clone: 53–6.7), BV650-CD4 (Biolegend#100546, clone: RM4–5), FITC-CD44 (Biolegend#103006, clone: IM7), PE-Cy7-PD-1 (Biolegend#109110, clone: RMP1–30), BV421-TIM3 (BD#747626, clone: 5D12), APC-TIGIT (Biolegend#156106, clone: 4D4/mTIGIT) and BV785-LAG3 (Biolegend#125219, clone:C9B7W). The second fraction was used to stain for surface and intracellular cytokines by first activating cells with Cell Stimulation Cocktail (eBioscience#00–4970-93) together with Protein Transport Inhibitor Cocktail (eBioscience#00–4980) in 37°C cell culture incubator for 4 h. The cells were then stained for surface antigens before fixation, and subsequently processed for intracellular cytokine staining using BD Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD#554714). Antibody cocktails used for surface and intracellular cytokine staining were: BV510-viability dye (BD#564406), PerCP-Cy5.5-TCRβ (Biolegend#109228, clone: H57–597), FITC-CD44 (Biolegend#103006, clone: IM7), PE-TNFα (Biolegend#506306, clone: MP6-XT22), BV650-CD4 (Biolegend#100546, clone: RM4–5), BV711-CD8 (Biolegend#100759, clone: 53–6.7) and BV605-IFNγ (Biolegend#505840, clone: XMG1.2). All flow cytometry was done on the BD LSRFortessa machine, and data were analyzed using FlowJo software (v10.4; https://www.flowjo.com/).
解剖和洗涤由前列腺内注射对照或表达 Cd1d1 的 Myc-CaP 细胞产生的小鼠肿瘤以去除血液、脂肪和结缔组织。将肿瘤组织进一步捣碎，并在 5 ml 消化缓冲液（RPMI1640、2.5 mg/ml 胶原酶 D、0.1 mg/ml DNase I）中在 37°C 下消化 30 分钟。通过再加入5ml RPMI1640和2%FBS来停止组织消化，然后通过70μm过滤器过滤。对于皮下注射对照或表达 Ifi204 的 Myc-CaP 细胞产生的肿瘤，以相同的方式获得组织细胞悬液。为了对照或Cd1d1表达的前列腺肿瘤中的NKT细胞浸润进行染色，首先用大鼠抗小鼠CD16 / CD32封闭试剂（BD#553142，克隆：2.4G2）在4°C下封闭单细胞悬浮液30分钟，然后在4°C下再对小鼠NKT表面抗体混合物染色30分钟。本研究中使用的小鼠NKT表面抗体为：BV510活力染料（BD#564406）、APC-α-GalCer-mCD1d四聚体（TetramerShop#MCD1d-001）、BV711-CD69（BioLegend#104537，克隆：H1.2F3）、PerCP-Cy5.5-TCRβ（BioLegend#109228，克隆：H57-597）、BV605-CD3e（BioLegend#100351，克隆：145-2C11）和BUV395-NK1.1（BD#564144，克隆：PK136）。将具有对照或 Ifi204 表达的小鼠肿瘤获得的细胞分成两部分，第一部分使用一组小鼠 T 细胞表面抗体混合物进行染色：BV510 活力染料 （BD#564406）、PerCP-Cy5.5-TCRβ （Biolegend#109228，克隆：H57–597）、BV711-CD8 （Biolegend#100759，克隆：53–6。7）、BV650-CD4（Biolegend#100546，克隆：RM4–5）、FITC-CD44（Biolegend#103006，克隆：IM7）、PE-Cy7-PD-1（Biolegend#109110，克隆：RMP1–30）、BV421-TIM3（BD#747626，克隆：5D12）、APC-TIGIT（Biolegend#156106，克隆：4D4/mTIGIT）和BV785-LAG3（Biolegend#125219，克隆：C9B7W）。第二部分用于表面和细胞内细胞因子染色，方法是首先在 37°C 细胞培养箱中用细胞刺激混合物 （eBioscience#00–4970-93） 和蛋白质转运抑制剂混合物 （eBioscience#00–4980） 激活细胞 4 小时。然后在固定前对细胞进行表面抗原染色，随后使用 BD 固定/透化溶液试剂盒 （BD#554714） 进行细胞内细胞因子染色。用于表面和细胞内细胞因子染色的抗体混合物有：BV510-活力染料（BD#564406）、PerCP-Cy5.5-TCRβ（Biolegend#109228，克隆：H57-597）、FITC-CD44（Biolegend#103006，克隆：IM7）、PE-TNFα（Biolegend#506306，克隆：MP6-XT22）、BV650-CD4（Biolegend#100546，克隆：RM4-5）、BV711-CD8（Biolegend#100759，克隆：53-6.7）和BV605-IFNγ（Biolegend#505840，克隆：XMG1.2）。所有流式细胞术均在BD LSRFortessa机器上完成，并使用FlowJo软件（v10.4;https://www.flowjo.com/）分析数据。
Multiplex Oxford Nanopore native sequencing
Blood samples from either healthy donors or patients with localized or metastatic prostate cancer were subjected to CTC-ichip enrichment (104-fold leukocyte depletion)26,27. The enriched CTCs (ranging from 0.1% to 1% purity, admixed with residual leukocytes) were subjected to high molecule weight (HMW) DNA extraction using the HMW DNA extraction kit (QIAGEN), and then prepared for Oxford Nanopore sequencing using the rapid barcoding kit (Nanopore#SQK-RBK004). For each sequencing run, 11 blood samples (either from healthy donors or cancer patients), together with 1 lambda DNA (unmethylated control), were uniquely barcoded and pooled together. Sequencing was performed using a Nanopore MinION device with R9.4 flowcell for 48 h, per manufacturer instructions.
Single-cell and bulk RNA-seq data analysis
Raw fastq reads generated from HiSeq X sequencer were first cleaned using TrimGalore (v0.4.3) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) to remove the adapter-polluted reads and reads with low sequencing quality. Cleaned reads were aligned to the human (hg19) or mouse (mm9) genome using Tophat (v2.1.1)66. PCR duplicates were further removed using samtools (v1.3.1)67, gene counts were computed using HTseq (v0.6.1)68, gene expression level (FPKM) was further calculated using cufflinks (v2.1.1)66. Gene expression matrix was subjected to R (v3.1.2) or Prism9 for graphics.
Single-cell and bulk DNA methylation sequencing data analysis
Raw fastq reads from both the single-cell and bulk DNA methylation sequencing were first trimmed using TrimGalore (v0.4.3) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore), and cleaned reads were aligned to the human hg19 or mouse mm9 genome (in silico bisulfite converted) using Bismark tool (v0.17.0)69. Samtools (v1.3.1)67 was used to remove PCR duplicates, and CpG methylation calls were extracted using the Bismark methylation extractor69. 0.1% lambda DNA was spiked in, prior to bisulfite treatment, for each sample to assess the bisulfite conversion efficiency. Only samples with more than 4 million unique CpG sites covered at least once and with a bisulfite conversion rate > 98% were used in this study.
TCGA methylation array data reanalysis
Prostate DNA methylation datasets from TCGA analyzed by Illumina Infinium Human Methylation 450 K BeadChip were downloaded from the National Cancer Institute’s GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov) for 502 tumor samples and 50 normal samples. CpG site-level methylation files (beta value, txt format) were first converted to hg19 coordinates using UCSC lift-over tool (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver) for the downstream analysis. The data were binned to a fixed set of 10 kb nonoverlapping genomic windows by computing the average fraction methylation within each bin in each sample. Bins were excluded if they lacked coverage (i.e., had no probes on the Illumina Infinium Human Methylation 450 K BeadChip array) or had a mean normal-tissue methylation level, averaged across all the normal samples, of <70%. For each sample, the global methylation level was calculated as the fraction of bins having methylation >50%. The methylation level at the CD1A-IFI16 locus for each sample was calculated as the fraction of bins in the range chr1:158,130,000–158,340,000 (hg19) having methylation >50%. The gene expression data and clinical information of TCGA PRAD samples, including Gleason score, tumor stage and others, were all downloaded from cbioportal (https://www.cbioportal.org/). Tumor purity was calculated using ABSOLUTE algorithm70. DNA Methylation 450 K BeadChip datasets for other cancer types were also downloaded from the National Cancer Institute’s GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov) and CpG site-level methylation files (beta value, txt format) were also converted to hg19 coordinates using UCSC lift-over tool (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver) for the downstream analysis.
Genomic element enrichment analysis
For analytical purposes, a promoter region was defined based on the relative position to a transcription start site (TSS): 1,500 bp upstream and 500 bp downstream. The annotations of TSS, exon, intron, intragenic regions, CpG islands (CGIs), repetitive elements and UCSC gap regions were all downloaded from UCSC genome table browser (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables)71. Enrichment analysis on different genomic elements was calculated using the Bioconductor package regioneR (v1.18.1) with overlapPermTest function72.
DNA copy number analysis inferred by single-cell DNA methylation sequencing data
Single-cell DNA methylation sequencing reads were first aligned to the genome using Bismark. Uniquely aligned reads were extracted into a bed file and subsequently submitted to Ginkgo online tool73, http://qb.cshl.edu/ginkgo) to infer the DNA copy number, using 5 Mb as the bin size. The processed integer copy number data from the Ginkgo website (SegCopy.tsv) was used to calculate the DNA Copy Number Variation (CNV) score. Given an assignment of a copy number to all the locations in a diploid genome, we define a CNV score for any given single cells as follows. Let ci be the copy number at the ith location of the genome. CNV score is then defined to be the average over all i in the genome of the absolute value of (ci-2).
DNA copy number analysis inferred by single-cell RNA-seq data
Single-cell RNA-seq reads were aligned to human genome using TopHat, and large-scale chromosomal copy number alterations were determined by InferCNV (https://github.com/broadinstitute/infercnv).
MNase ChIP-seq and Cut and Run data analysis
ChIP-seq and Cut and Run reads were first trimmed by Trim Galore (v0.4.3) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) and then mapped to the human or mouse genome using BWA men74. Duplicated reads were marked by sambamba75 and further removed using samtools67. MACS2 (v2.0.10)76 was used to call the peaks and deepTools77 were used to compute the ChIP-seq or Cut and Run signal around prostate PMDs.
Determination of Partially Methylated Domains (PMDs)
The human genome was first binned into 100 kb windows placed at 200 bp offsets. Windows that intersected CGIs or UCSC gap regions were discarded. For each source (i.e., single CTCs from patients with prostate cancer, single WBCs from healthy donors, single cells from normal prostate or prostate cancer cell lines or normal prostate tissues42，每个窗口的每源甲基化水平是通过取给定窗口内 CpG 位点甲基化水平的该来源的所有细胞的平均值来计算的。对于每个来源，绘制了 100 kb 窗口的每个来源甲基化水平的分布。正常细胞呈单峰分布，而前列腺癌细胞呈双峰分布。在每个前列腺癌患者或前列腺细胞系的双峰分布直方图中，将低甲基化测定的阈值设定在谷的最低点;如果分布是单峰分布，则阈值设置为 60%。甲基化水平低于阈值的窗口被定义为低甲基化窗口，重叠的低甲基化窗口被合并到每个来源的PMD中。然后将 250 kb 的最小长度阈值应用于每个源的 PMD。来自四名前列腺癌患者（GU114、GU216、GURa15 和 GU181）的所有单个 CTC 和来自四个前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、22Rv1 和 PC3）的所有单细胞的单源 PMD 的联合定义为总前列腺 PMD（总共 1,496 个）。对这些PMD进行染色质标记和基因组元件富集分析。为了鉴定在所分析的所有前列腺癌标本（即交叉点）中驻留在最一致的低甲基化 PMD 中的基因，我们对来自四名前列腺癌患者（GU114、GU216、GURa15 和 GU181）的所有 CTC 中所有 PMD 的所有 DNA 甲基化水平进行分位数归一化，以及来自四种前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、22Rv1 和 PC3）的所有单细胞，并且仅使用 PMD（注释为核心前列腺 PMD）及其平均分位数归一化 DNA这 8 个来源的甲基化水平小于 25% 以提取基因。
部分甲基化结构域 （PMD） 的测定 首先将人类基因组分箱到以 200 bp 偏移量放置的 100 kb 窗口中。与 CGI 或 UCSC 间隙区域相交的窗口将被丢弃。对于每个来源（即来自前列腺癌患者的单个 CTC、来自健康供体的单个 WBC、来自正常前列腺或前列腺癌细胞系或正常前列腺组织的单个细胞 42 ，每个窗口的每源甲基化水平是通过取来自该来源的所有细胞的平均值来计算给定窗口内 CpG 位点的甲基化水平。对于每个来源，绘制了 100 kb 窗口的每个来源甲基化水平的分布。正常细胞呈单峰分布，而前列腺癌细胞呈双峰分布。在每个前列腺癌患者或前列腺细胞系的双峰分布直方图中，将低甲基化测定的阈值设定在谷的最低点;如果分布是单峰分布，则阈值设置为 60%。甲基化水平低于阈值的窗口被定义为低甲基化窗口，重叠的低甲基化窗口被合并到每个来源的PMD中。然后将 250 kb 的最小长度阈值应用于每个源的 PMD。来自四名前列腺癌患者（GU114、GU216、GURa15 和 GU181）的所有单个 CTC 和来自四个前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、22Rv1 和 PC3）的所有单细胞的单源 PMD 的联合定义为总前列腺 PMD（总共 1,496 个）。对这些PMD进行染色质标记和基因组元件富集分析。鉴定存在于所有分析的前列腺癌标本中最一致的低甲基化 PMD 中的基因（即，交叉），我们对来自四名前列腺癌患者（GU114、GU216、GURa15 和 GU181）的所有 CTC 和来自四种前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、22Rv1 和 PC3）的所有单细胞中所有 PMD 的所有 DNA 甲基化水平进行分位数归一化水平的分位数归一化水平，并且仅使用这 8 个来源的平均分位数归一化 DNA 甲基化水平小于 25% 的 PMD（注释为核心前列腺 PMD）来提取基因。
保留甲基化岛 （PMI） 的测定
在鉴定了八个样本源中的每一个的 PMD [来自四个前列腺癌患者（GU114、GU216、GURa15 和 GU181）的 CTC）和来自四个前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、22Rv1 和 PC3）的单个细胞]后，我们使用以下标准定义了具有保留甲基化（样本源 PMI）的小分散岛（“间隙”）： （1）每个PMI的两侧都是每个给定来源中定义的PMD;（2） 每个 PMI 的长度应为 >30 kb 和 <3 Mb。 总前列腺 PMI 是通过对 8 个来源（总共 1,412 个）的样本源 PMI 进行联合来定义的，而核心前列腺 PMI（总共 44 个）是通过要求样本源的一致性来定义的：给定 PMI 的基因组位置在所有 8 个样本源中都是重叠的。
保留甲基化岛 （PMI） 的测定 在鉴定了八个样本源中的每一个的 PMD [来自四个前列腺癌患者（GU114、GU216、GURa15 和 GU181）的 CTC）和来自四个前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、22Rv1 和 PC3）的单个细胞]后，我们使用以下标准定义了具有保留甲基化（样本源 PMI）的小分散岛（“间隙”）： （1）每个PMI的两侧都是每个给定来源中定义的PMD;（2） 每个 PMI 的长度应为 >30 kb 和 <3 Mb。 总前列腺 PMI 是通过对 8 个来源（总共 1,412 个）的样本源 PMI 进行联合来定义的，而核心前列腺 PMI（总共 44 个）是通过要求样本源的一致性来定义的：给定 PMI 的基因组位置在所有 8 个样本源中重叠。
差异基因表达和超几何基因集富集分析（hGSEA）
TCGA前列腺正常组织和原发性肿瘤之间的差异基因表达确定如下：我们首先考虑了存在于低甲基化程度最高的PMD中的基因[如标题为“部分甲基化结构域（PMD）的确定”一节所述]。其中，归一化FPKM值第95个百分位数小于1的基因被丢弃。对其余每个基因进行双尾方差等于 t 检验。这些 t 检验的 p 值用于通过 Benjamini-Hochberg 方法生成每个基因的错误发现率 （FDR） 估计值。我们认为FDR估计值小于0.1的基因在正常前列腺和前列腺肿瘤样本之间有差异表达。进行 hGSEA 以使用 phyper R 函数确定基因集和通路富集，如其他地方报道26. All gene sets and pathways evaluated in this study were obtained from MSigDB (v7.2) from the Broad Institute. Differential gene expression and hGSEA for genes in PMIs was performed in the same way.
Heterogeneity assessment
Consistent with a previous publication26, means of correlation coefficients and jackknife estimates were used to assess the heterogeneity within and between subsets of samples.
Nanopore 数据分析
Nanopore MinION设备生成的纳米孔测序读长（格式：fast5）首先使用ONT Albacore软件（v2.3.1）（https://nanoporetech.com/community）转换为fastq文件。在 fast5 到 fastq 的转换过程中也执行了解复用。使用 Nanopolish 软件 （v0.10.2） （https://github.com/nanoporetech/nanopolish） 从 fast5 和 fastq 文件中提取 DNA 甲基化信息。纳米抛光输出文件（albacore_output.sorted.bam和methylation_calls.tsv）用于下游分析。每次纳米孔运行都加入lambda DNA，该DNA用作阴性对照，以评估纳米孔测序的保真度。为了估计每个纳米孔测序样品中 CTC 衍生的低甲基化信号，应用了严格的标准：（1） 每个纳米孔读数应足够长，以容纳至少 30 个 CpG 位点，并在纳米抛光后进行可靠的甲基化调用;（2） 与前列腺 PMD 对齐的纳米孔读数（使用单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序从 4 名前列腺癌患者和 4 名前列腺癌细胞系中分离的 CTC 中预先确定）对于转移性患者应不少于 300 个或局部患者不少于 400 个;（3）每次运行中加入λ DNA的甲基化水平应为<1%。应用这些标准后，微流控处理（白细胞耗尽）来自7名转移性前列腺癌患者和6名局限性前列腺癌患者的血液样本。由于对于转移性患者和局部患者，我们需要在前列腺 PMD 中进行不同数量的纳米孔读数，因此在转移队列中验证了 23 名年龄匹配的健康供体进行分析，并验证了 21 名局部队列
的分析。纳米孔测序检测稀有信号的计算机模拟
为了评估检测罕见循环肿瘤细胞中大低甲基化结构域的能力，我们使用来自正常甲基化非癌细胞系 （HUES64） 的纳米孔读数和来自癌细胞系 （HCT116） 的 1% 计算机加标读数进行了分析。我们通过使用 PRROC 量化读取分类的精确度和灵敏度，评估了根据其平均甲基化水平确定与预定义 HCT116 PMD 对齐的读段的正确细胞系的能力78.对每次读数的甲基化进行平均，仅考虑属于 PMD 内的 CpG 位点，而不包括 CpG 岛内的位点。
插图
插图是用 BioRender.com 创作的。
量化和统计分析
所有实验的统计分析在图例和方法详细信息中都有描述。使用R（版本3.1.2）和GraphPad Prism 9.0进行统计分析。
补充材料
1
表S1 单细胞CTC分析入组转移性前列腺癌患者和单核分析切除局限性前列腺癌患者的临床特征，相关图1.
缩写：ADT，雄激素剥夺疗法;近距离，近距离放射治疗;CRPC：去势抵抗性前列腺癌;RP，根治性前列腺切除术;EBRT，外照射放射治疗;sip-T，sipuleucel-T;PSA，血清前列腺特异性抗原。
5
表S5 CTC富集血液样本纳米孔测序分析登记的转移性前列腺癌患者临床特征，与以下方面有关图6.
缩写：ADT，雄激素剥夺疗法;PSA，血清前列腺特异性抗原;Ra223，镭-223;放疗，放射治疗;N/A，不适用。
6
Figure S1. Single-cell transcriptome and DNA copy number analysis of prostate CTCs, related to Figure 1.
(A-B) Boxplots showing sequencing quality parameters of single-cell DNA methylation samples (panel A) and single-cell RNA-seq samples (panel B).
（A-B）显示单细胞DNA甲基化样品（图A）和单细胞RNA-seq样品（图B）测序质量参数的箱线图。
(C) Heatmap showing marker gene expression of the single cells sequenced in this study. CTCs have high expression of epithelial and prostate lineage markers, and absent expression of leukocyte (WBC) markers. Single WBCs that persisted after processing through the microfluidic device are shown as negative controls, and single cells from prostate cancer cell lines are used as positive controls. Asterisks denote a small number of CTCs with potential contamination by WBCs, which were excluded from analysis.
（C） 显示本研究中测序的单细胞的标记基因表达的热图。CTC 具有高表达的上皮和前列腺谱系标志物，并且没有白细胞 （WBC） 标志物的表达。通过微流控装置处理后持续存在的单个白细胞显示为阴性对照，来自前列腺癌细胞系的单个细胞用作阳性对照。星号表示少量可能受到白细胞污染的 CTC，这些 CTC 被排除在分析之外。
（D） 显示单细胞 RNA-seq 无监督分层聚类的热图。定义了三个主要簇（树状图上）：白细胞;正常前列腺细胞系细胞（HPrEC和BPH-1）;和前列腺 CTC 以及四种前列腺癌细胞系（PC3、LNCaP、VCaP 和 22Rv1）。
（英-法）热图显示了从单细胞DNA甲基化测序数据（图E）和单细胞RNA-seq数据（图F）推断的匹配的CTC的DNA拷贝数。
7
图 S2.单个前列腺 CTC 的 DNA 甲基化分析，与 图1.
（A） 单个前列腺 CTC 和来自前列腺癌细胞系（22Rv1、LNCaP、PC3 和 VCaP）、未转化前列腺上皮细胞系（HPrEC 和 BPH-1）、微流控处理后残留白细胞和正常前列腺组织的单细胞启动子甲基化的 PCA 分析。所有前列腺肿瘤细胞都与未转化的前列腺细胞和正常白细胞分开聚集。
（B） 直方图显示每个 100 kb 窗口内甲基化水平的分布，在整个基因组中至少覆盖 10 个 CpG，偏移量为 200bp，代表患者来源的 CTC（按患者分组：GU114、GU181、GU216、GURa15）、前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、PC3 和 22Rv1）、正常前列腺组织、未转化前列腺上皮细胞系（HPrEC 和 BPH-1）的单细胞数据的平均值， 全血（代表所有造血谱系）和白细胞（WBC）。每个癌症相关标本中的蓝色垂直线是该细胞类型中低甲基化评分的阈值（即，甲基化水平低于该阈值的每 100 kb 窗口定义为低甲基化）。
（C） 条形图显示患者来源的 CTC、前列腺癌细胞系和正常细胞系或组织中低甲基化的基因组部分。所有肿瘤样本的基因组有20-40%被归类为低甲基化，而正常样本有<2.5%。N.P.，前列腺正常。
（D） 描述前列腺 PMD 和 PMI 定义关键步骤的流程图（见方法）。
8
图 S3.核心 PMD 和核心 PMI 的染色质沉默标记和大小，与 图2.
（A） 显示前列腺癌细胞（22Rv1，红色）中 PMD 处 H3K27me3 标记差异富集的线图与未转化的前列腺上皮细胞系（BPH-1，绿色和 HPrEC，蓝色）（左图）。相比之下，癌细胞和正常细胞之间PMDs上H3K9me3的丰度没有显着差异（右图）。
（B） 与正常前列腺 HPrEC 和 BPH-1 细胞相比，量化 22Rv1 前列腺癌细胞中所有前列腺 PMD 中 H3K27me3 富集的箱图。未观察到 H3K9me3 的富集。通过单尾学生 t 检验评估的 P 值。
（C） 1 号染色体上 CD1A-IFI16 位点的 IGV 屏幕截图 （hg19），显示 22Rv1 前列腺癌细胞（红色）中的 DNA 低甲基化（黄色阴影），与 HPrEC 和 BPH-1 前列腺上皮细胞（蓝色和绿色）相比。与正常前列腺细胞相比，CD1A-IFI16 位点还显示前列腺癌细胞中 H3K27me3 染色质沉默标记的富集，但 H3K9me3 沉默标记的丰度差异不大。
(D) Inter- and intra-patient heterogeneity analysis of PMIs among prostate CTCs and single cells from prostate cancer cell lines. Mean Jaccard index is used to indicate the heterogeneity, with higher mean Jaccard index score indicating less heterogeneity among samples assayed. Error bar indicates mean with 95% CI.
（D） 前列腺 CTC 和前列腺癌细胞系单细胞之间 PMI 的患者间和患者内异质性分析。平均Jaccard指数用于表示异质性，平均Jaccard指数得分越高，表示测定样品之间的异质性越小。误差线表示平均值，置信区间为 95%。
（英-法）8 个样本源（4 个前列腺患者和 4 个前列腺癌细胞系）中 1 号染色体位点的总 PMI 和核心 PMI 的 IGV 表示 （hg19）。总 PMI（蓝色）是每个样本源中定义的所有 PMI 的并集，而核心 PMI（黑色）是所有 8 个样本源共享的 PMI（图 E）;来自单个样本源的单细胞成分（来自患者 GU181 的 22 个 CTC）的 PMI 表示，显示核心 PMI（黑色）在所有样本源和相邻的非核心 PMI（红色）之间共享，该患者中 >85% 的 CTC 共享，但不是跨不同的样本源（图 F）。
（G） 条形图显示，与其他 PMD 相比，核心 PMD 的平均 CpG 密度显著降低。 蓝线表示 40 个核心 PMD 的平均 CpG 密度。 直方图表示 40 个非核心 PMD 的 10,000 个随机抽样的平均 CpG 密度。 P 值是平均 CpG 密度小于 40 个核心 PMD 的平均 CpG 密度的非核心 PMD 随机抽样的分数。
（G） 条形图显示，与其他 PMD 相比，核心 PMD 的平均 CpG 密度显著降低。 蓝线表示 40 个核心 PMD 的平均 CpG 密度。 直方图表示 40 个非核心 PMD 的 10,000 个随机采样的平均 CpG 密度。 P 值是平均 CpG 密度小于 40 个核心 PMD 的平均 CpG 密度的非核心 PMD 随机抽样的分数。
（H） 显示整个前列腺癌基因组中总 PMD、总 PMI、核心 PMD 和核心 PMI 的平均长度的箱线图。
（H） 显示整个前列腺癌基因组中总 PMD、总 PMI、核心 PMD 和核心 PMI 的平均长度的箱线图。
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图 S4.前列腺肿瘤发生早期CD1A-IFI16位点的去甲基化，与以下因素有关
图4.
图 S4.前列腺肿瘤发生早期CD1A-IFI16位点的去甲基化，与图4有关。
（A） 热图显示从邻近正常组织、低级别局限性前列腺癌 （GS6）、高级别局限性前列腺癌 （GS8） 和转移性前列腺癌 （CTC） 中检索到的单细胞内的 DNA 拷贝数变异 （CNV）。单细胞DNA甲基化测序数据用于推断CNV。 用红色虚线标记的框表示chr8p基因座的染色体缺失，这是早期前列腺癌中最早和最一致观察到的CNV。
（B） 箱线图显示在前列腺肿瘤发生 （GS6） 的最早阶段之一的单个癌细胞内、整个基因组、所有 PMD 和 CD1A-IFI16 位点的低甲基化和 chr8p 缺失的一致性。在前列腺癌的更晚期阶段（GS8 和 CTC）中，当 CNV 和低甲基化明显并分布在整个基因组中时，相关性会丢失。P值，均通过Wilcoxon检验评估。
（C-D）来自局限性前列腺癌（GS6 和 GS8）、转移性前列腺癌 （CTC） 和前列腺癌细胞系的单个细胞内启动子甲基化（图 C）和 PMD 甲基化（图 D）的异质性，通过平均相关系数测量，并显示前列腺癌中 PMD 低甲基化的相对均匀性，与启动子高甲基化相比。误差线表示 95% CI 的平均值。
（E） 条形图显示前列腺癌进展期间 CpG 岛 （CGI） 甲基化逐渐增加。误差线表示 SD 的平均值，P 值通过双尾 Student's t 检验评估。
（F） 定量前列腺肿瘤发生过程中 DNA 拷贝数改变，正常前列腺显示无 CNV，CNV 从 GS6 逐渐增加到 GS8 和 CTC。 误差线表示 95% CI 的几何平均值。
（G） 散点图显示 GS6 和 GS8 肿瘤以及前列腺 CTC 中 DNA 拷贝数改变与 DNA 甲基化变化之间的相关性。每个点表示一个核心 PMD。X 轴表示 DNA 拷贝数改变与相应区域 DNA 甲基化变化之间的关系 （rho）（左为负相关，右为正相关），y 轴表示 FDR，虚线表示 FDR 为 0.1。
（H） 核心 PMD（红色）与非核心 PMD（品红色）的渐进性去甲基化定量作为正常前列腺组织 （n=4）、原发性前列腺肿瘤 （n=5）（源自 Yu 等人，2013 年）和转移性前列腺肿瘤 （n=100）（源自 Zhao 等人，2020 年）进化的函数，显示核心 PMD 处 DNA 甲基化的损失更快。相比之下，散布在核心PMD之间的核心PMI（蓝色）在癌症进展过程中显示出DNA甲基化的保存。通过重新分析两个已发表的数据集来计算甲基化水平。误差线表示 SEM 的平均值。 使用纵向线性混合效应模型对 DNA 甲基化曲线进行统计分析，通过该模型测试肿瘤进展（正常组织、原发性前列腺肿瘤和转移性前列腺肿瘤）x 甲基化结构域。
（I） 显示正常前列腺和前列腺肿瘤 （TCGA） 中 E2F 靶通路和 DNA 修复通路的平均表达水平的箱线图，其基因位于核心 PMI 内。通过 Wilcoxon 检验评估的 P 值。
（J） 与正常前列腺组织 （TCGA） 相比，驻留在 PMI 内并属于 E2F 靶标和 DNA 修复途径的基因的热图表示，显示原发性前列腺癌中的保留表达。
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图 S5.前列腺癌和其他癌症中 CD1A-IFI16 位点的 DNA 甲基化分析，与
图4.
图 S5.前列腺癌和其他癌症中 CD1A-IFI16 位点的 DNA 甲基化分析，与图 4 相关。
（A-C）DNA甲基化变化随格里森评分的变化，在手术切除的局限性前列腺癌标本的显微解剖单核（A）中，在来自两个独立的前列腺肿瘤公共数据集的样本中（正常前列腺组织和原发性前列腺肿瘤源自Yu等人，2013，以及转移性前列腺肿瘤源自Zhao等人，2020）（B）和格里森注释的TCGA前列腺肿瘤标本（C）.线图显示 CD1A-IFI16 位点的 DNA 甲基化明显丢失（绿线），与全基因组 DNA 甲基化（橙线）形成鲜明对比。值得注意的是，（A）和（B）数据来自WGBS，（C）数据来自Infinium Human Methylation 450K BeadChip。误差线表示 SEM 的平均值。 使用纵向线性混合效应模型对 DNA 甲基化曲线进行统计分析，通过该模型测试肿瘤进展（或格里森评分）x 甲基化结构域。
（D） 箱线图显示代表不同等级前列腺癌的单细胞（正常、GS 6、GS 8、CTC）没有显着的甲基化变化，这是 CD1A-IFI16 位点的 DNA 拷贝数变异的函数。ns，不显著;*P<0.05，通过Wilcoxon检验评估。
(E) Line graphs showing earlier demethylation at the CD1A-IFI16 locus, compared with other core PMDs, during colon cancer and thyroid cancer progression. Error bar denotes mean with SD. P-value, assessed by two-tailed Student’s t test.
（E） 折线图显示，在结肠癌和甲状腺癌进展期间，与其他核心 PMD 相比，CD1A-IFI16 位点的早期去甲基化。误差线表示 SD 的平均值。 P 值，通过双尾学生 t 检验评估。
(F) IGV screenshot (hg19) showing DNA methylation at a region of chromosome 1 encompassing the CD1A-IFI16 locus, across 33 different cancer types (TCGA). 23 (denoted in red) show hypomethylation (<80%) of the CD1A-IFI16 locus. Abbreviations for cancer types: ACC, Adrenocortical Carcinoma; BLCA, Bladder Urothelial Carcinoma; BRCA, Breast Invasive Carcinoma; CESC, Cervical Squamous Cell Carcinoma and Endocervical Adenocarcinoma; CHOL, Cholangiocarcinoma; COAD, Colon Adenocarcinoma; DLBC, Lymphoid Neoplasm Diffuse Large B; ESCA, Esophageal Carcinoma; GBM, Glioblastoma Multiforme; HNSC, Head Neck Squamous Cell Carcinoma; KICH, Kidney Chromophobe; KIRC, Kidney Renal Clear Cell Carcinoma; KIRP, Kidney Renal Papillary Cell Carcinoma; LAML, Acute Myeloid Leukemia; LGG, Brain Lower Grade Glioma; LIHC, Liver Hepatocellular Carcinoma; LUAD, Lung Adenocarcinoma; LUSC, Lung Squamous Cell Carcinoma; MESO, Mesothelioma; OV, Ovarian Serous Cystadenocarcinoma; PAAD, Pancreatic Adenocarcinoma; PCPG, Pheochromocytoma and Paraganglioma; PRAD, Prostate Adenocarcinoma; READ, Rectum Adenocarcinoma; SARC, Sarcoma; SKCM, Skin Cutaneous Melanoma; STAD, Stomach Adenocarcinoma; TGCT, Testicular Germ Cell Tumors; THCA, Thyroid Carcinoma; THYM, Thymoma; UCEC, Uterine Corpus Endometroid Carcinoma; UCS, Uterine Carcinosarcoma; UVM, Uveal Melanoma.
（F） IGV 屏幕截图 （hg19） 显示 1 号染色体中包含 CD1A-IFI16 位点的区域的 DNA 甲基化，跨越 33 种不同的癌症类型 （TCGA）。23（用红色表示）显示CD1A-IFI16位点的低甲基化（<80%）。癌症类型的缩写：ACC，肾上腺皮质癌;BLCA，膀胱尿路上皮癌;BRCA，乳腺浸润性癌;CESC，宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌;CHOL，胆管癌;COAD，结肠腺癌;DLBC，淋巴样肿瘤弥漫性大B;ESCA，食管癌;GBM，多形性胶质母细胞瘤;HNSC，头颈鳞状细胞癌;KICH，肾嗜色症;KIRC，肾透明细胞癌;KIRP，肾状细胞癌;LAML，急性髓系白血病;LGG，脑低级别胶质瘤;LIHC，肝细胞癌;LUAD，肺腺癌;LUSC，肺鳞状细胞癌;中胚层，间皮瘤;OV，卵巢浆液性囊腺癌;PAAD，胰腺癌;PCPG、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤;PRAD，前列腺腺癌;READ，直肠腺癌;SARC，肉瘤;SKCM，皮肤黑色素瘤;STAD，胃腺癌;TGCT，睾丸生殖细胞肿瘤;THCA，甲状腺癌;THYM，胸腺瘤;UCEC，子宫体子宫内膜癌;UCS，子宫癌肉瘤;UVM，葡萄膜黑色素瘤。
(G) Plot showing methylation levels across 33 different cancer types at the CD1A-IFI16 locus (right), compared with genome-wide methylation (left). The 23 cancers with hypomethylation (<80%) at the CD1A-IFI16 locus are colored in red. Abbreviations defined in (F).
（G） 显示 CD1A-IFI16 位点（右）33 种不同癌症类型的甲基化水平，与全基因组甲基化（左）相比。CD1A-IFI16位点低甲基化（<80%）的23种癌症为红色。（F）中定义的缩写。
(H) Scatter plots showing correlation between DNA hypomethylation at the CD1A-IFI16 locus and reduced expression of resident genes across 33 different cancer types (TCGA). Statistically significant (FDR<0.1) correlations between hypomethylation and reduced RNA expression are shown with green line (19 tumor types); anti-correlations shown with red line (4 tumor types); tumor types which do not reach statistical significance with yellow line (10 tumor types). Abbreviations defined in (F).
（H） 散点图显示 CD1A-IFI16 位点的 DNA 低甲基化与 33 种不同癌症类型 （TCGA） 的驻留基因表达降低之间的相关性。低甲基化与RNA表达降低之间的统计学显着性（FDR<0.1）相关性用绿线显示（19种肿瘤类型）;用红线显示的反相关性（4 种肿瘤类型）;未达到黄线统计学意义的肿瘤类型（10 种肿瘤类型）。（F）中定义的缩写。
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Figure S6. Chromatin silencing marks and transcriptional changes at the CD1A-IFI16 locus, related to Figure 4.
(A) Boxplots quantifying increased H3K27me3 marks, but unchanged H3K9me3, in prostate cancer cells compared with normal cells, at the CD1A-IFI16 locus, using Cut and Run assays. Two prostate cancer cell lines (LNCaP and 22Rv1) are compared with the two non-transformed prostate epithelial cell lines (HPrEC and BPH-1). P-value is assessed by one-tailed Student’s t test.
（A） 使用切割和运行测定法定量前列腺癌细胞中与正常细胞相比，在 CD1A-IFI16 位点增加的 H3K27me3 标记，但 H3K9me3 不变的箱图。将两种前列腺癌细胞系（LNCaP 和 22Rv1）与两种未转化的前列腺上皮细胞系（HPrEC 和 BPH-1）进行比较。P 值通过单尾 Student's t 检验进行评估。
（B） 与两种未转化的上皮前列腺细胞系（HPrEC 和 BPH-1）相比，两种前列腺癌细胞系（LNCaP 和 22Rv1）中干扰素诱导基因 CD1A-IFI16 位点（IFI16、PYHIN1 和 AIM2）表达降低的图。误差线表示 SD 的平均值。 P 值由双尾学生 t 检验评估。
（C） 与两种前列腺癌细胞系（LNCaP 和 22Rv1）相比，两种前列腺上皮细胞系（BPH-1 和 HPrEC）中 CD1d 表达的流式细胞术定量分析显示肿瘤细胞中 CD1d 表达降低。将细胞与 APC 偶联的抗人 CD1d 或 APC 偶联的同型对照 IgG（以灰色显示）一起孵育。
（D） IGV 屏幕截图 （hg19） 显示 H3K27me3 ChIP-seq 信号在 CD1A-IFI16 位点富集，早在 GS 6 早期前列腺肿瘤发生期间。H3K27me3 ChIP-seq 用于两个正常前列腺组织（灰色轨道）、两个 GS 6 肿瘤组织（红色轨道）和四个 GS 8 肿瘤组织（绿色轨道）。
（英-法）箱线图显示了从正常前列腺上皮到局限性前列腺癌阶段（GS 6、GS 8）期间染色质沉默标记 H3K27me3 的定量富集。早在GS 6（图E;图D所示的代表性IGV轨迹（hg19））中，H3K27me3的增加就很明显，而所有PMD直到GS 8（图F）才显示出H3K27me3沉积的统计学显着增加。P 值均通过单尾 Student's t 检验评估。
（G） 显示 CD1A-E 脂质抗原呈递基因家族所有成员和四分之三干扰素诱导基因表达降低的图，均共位于原发性前列腺肿瘤与正常前列腺肿瘤内的 CD1A-IFI16 位点（肿瘤纯度为 >0.5 的 TCGA 前列腺数据由 ABSOLUTE 算法推断）。误差线表示 SEM 的平均值。 通过双尾学生 t 检验评估的 P 值。
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图 S7.CD1A-IFI16 位点低甲基化相关沉默的功能概括，与 图4.
（A） CD1A-IFI16 位点大量 DNA 甲基化谱的 IGV 屏幕截图 （hg19）（由散列的红色框描绘），显示人前列腺上皮细胞 BPH-1 在用 5-氮杂胞苷治疗 4-5 天后 DNA 去甲基化，与 DMSO 对照组相比和治疗后第 1 天。
（B） Lollipop 图显示 CD1A-IFI16 位点内的区域（12 个 CpG 位点超过 395 bp），使用亚硫酸氢盐 PCR 与 BPH-1 细胞在 5-氮杂胞肽处理后连续时间点的 Sanger 测序。甲基化 CpG（黑色圆圈），未甲基化 CpG（开放圆圈），每个面板下方标明平均 DNA 甲基化分数。
€ BPH-1 细胞的代表性共聚焦显微镜图像显示，在用 5-氮杂胞苷处理 5 天后，H3K27me3 染色质沉默标记的核丰度增加（与 DMSO 对照相比）。DNA含量用DAPI（蓝色）标记。红色荧光表示H3K27me3。左下角显示了一个放大的代表性核。棒 50 μM。
（D） BPH-1 细胞的代表性共聚焦显微镜图像显示，在用 5-氮杂胞苷处理 5 天后，H3K9me3 染色质沉默标记的核丰度增加（与 DMSO 对照相比）。DNA含量用DAPI（蓝色）标记。红色荧光表示H3K9me3。左下角显示了一个放大的代表性核。Bar 50 μ€（E） 单细胞核内平均 H3K9me3 相关荧光强度的共聚焦显微成像定量（使用 ImageJ 软件定量，参见方法）。误差线表示 SEM 的平均值。 P 值由两个尾 Student's t 检验评估。
（F-G）诱导在三种人前列腺癌细胞系（22Rv1、LNCaP 和 VCaP）中驻留在 CD1A-IFI16 位点的基因，这些细胞系在用 EZH2 抑制剂 GSK126 治疗六天（5μM 和 10μM 剂量）后携带 PMD 低甲基化和 H3K27me3 沉积。GSK126 暴露导致 H3K27 三甲基化显著减少（蛋白质印迹，图 F），同时 CD1-IFI16 基因簇内所有基因的表达增加（定量实时荧光定量 PCR，图 G）。未观察到非PMD驻留对照基因（PP1A，HPRT和β-肌动蛋白）的表达变化。 通过Tukey的多重比较测试评估P值，其中GSK126处理条件与其对照组（蓝条）进行了比较。N.s. 不重要;*P<0.05**P<0.01;P<0.001;P<0.0001。
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图 S8.脂质抗原呈递基因 Cd1d1 或干扰素诱导基因 Ifi204 的再表达抑制免疫感受态小鼠前列腺癌模型中的肿瘤发生，与 图5.
（A-B）IGV 屏幕截图 （mm9） 显示小鼠 Myc-CaP 前列腺癌细胞中 DNA 低甲基化（黄色阴影）和抑制性组蛋白标记 H3K27me3 和 H3K9me3 的占据，位于与人 CD1A-IFI16 同源的两个小鼠位点：Cd1d1 和 Cd1d2 基因聚集在小鼠 3 号染色体上（图 A），干扰素诱导基因 Ifi204、Aim 2、Pyhin1 和 Mnda 聚集在小鼠 1 号染色体上（图 B).H3K9me3、H3K27me3 和 IgG（对照组）具有两个生物学重复。DNA 甲基化来源于 12 个单个 Myc-CaP 细胞的单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序。
（C） Myc-CaP 细胞中慢病毒介导的异位 Cd1d1 过表达 （OE） 的流式细胞术分析，显示编码蛋白的细胞表面定位，与空载体转染对照和 IgG 染色对照相比。
（D） 共聚焦显微图像显示 Myc-CaP 细胞中异位表达后 CD1d 的细胞表面定位。绿色荧光表示CD1d表达（白色箭头），Myc-CaP细胞用mCherry标记。条形，20μM。
（E）体内前列腺原位肿瘤发生试验，显示与亲本对照相比，具有异位Cd1d1表达的Myc-CaP癌细胞的清除速度相对较快。显示了第 9 天的代表性小鼠图像。误差线表示 SEM 的平均值。 P 值，通过双尾学生 t 检验评估。
（F） 显示 NKT 细胞特异性 RNA 标志物（Cd40lg 和 Icos）和泛白细胞标志物（Ptprc、CD45）的定量 （qRT-PCR） 基因表达差异图，显示 Cd1d1 表达恢复的 Myc-CaP 细胞产生的肿瘤 （0E） 与模拟转染对照。P 值通过双尾学生 t 检验评估。
（G） qRT-PCR定量显示慢病毒转导后LLC-1细胞中Cd1d1表达的表达。差异表达的幅度（140 倍）反映了亲本 LLC-1 细胞中几乎完全没有 Cd1d1 RNA 表达。通过学生的 t 检验评估的 P 值。
（H） 在慢病毒介导的异位表达后，LLC-1 细胞中 Cd1d 蛋白表达的流式细胞术定量分析，与模拟转导对照和 IgG 染色对照相比。Cd1d1 的细胞表面表达与转导的 Myc-CaP 细胞相当（图 C）。
（I） 体外细胞增殖试验显示，与亲本对照组相比，Cd1d1 过表达 （OE） 的 LLC-1 细胞之间没有差异。误差线表示 SD 的平均值;ns，不显著，通过双尾学生 t 检验评估。
（J） 使用生物发光 IVIS 成像对萤光素酶标记的 LLC-1 细胞皮下接种过表达 Cd1d1 或模拟转导对照的荧光素酶标记的 LLC-1 细胞后，对等基因 C57BL/6 小鼠的肿瘤形成进行定量。通过学生的 t 检验评估的 P 值。每组 N= 8。
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图 S9.皮下 Myc-CaP 衍生肿瘤中免疫浸润的流式细胞术分析，与 图5.
（A） 流式细胞术分析显示，CD3eNK1.1 双阳性细胞（总 NKT 细胞，非 CD1d 限制性细胞）在免疫感受态同基因小鼠中来源的肿瘤中，由 Cd1d1 过表达 （OE） 或模拟转导对照的 Myc-CaP 细胞对肿瘤浸润没有显着差异。右图中的定量分析。ns，不显著;P 值通过双尾学生 t 检验评估。++
（B-C）流式细胞术分析显示，与模拟转导对照组相比，CD1d限制性NKT细胞（由α-GalCer CD1d四聚体标记;图B）和活化的NKT细胞（以CD69表达标记;图C）在源自Cd1d1过表达（OE）的Myc-CaP细胞的肿瘤中富集。右上角所示的阳性细胞定量（百分比）。
（D） 在一个代表性肿瘤样本中对浸润 T 细胞的不同细胞表面标志物进行评分的门控策略。
（E） 亲本对照中表达 CD4 或 CD8 T 细胞的 CD44 或 CD8 T 细胞与表达 Ifi204 的肿瘤的百分比没有差异。ns，不显著，通过双尾 Student's t 检验评估。++
（F-G）与模拟转导对照组相比，FACS图显示，在从Myc-CaP衍生的肿瘤中恢复的CD8 T细胞中，PD-1细胞表面表达下调（图F）和TNFα上调（图G），Ifi204过表达（OE）。+
（香港）与表达 Ifi204 的肿瘤相比，对照组 CD8 T 细胞中 LAG3（图 H）、TIGIT（图 I）、TIM3（图 J）和 IFNγ（图 K）的表达没有差异。误差线表示 SD 的平均值。 ns，不显著，由双尾学生 t 检验评估。+
确认
我们感谢 L. Libby 的技术支持;J. Fung 提供流式细胞术协助。我们感谢 R. Manguso、D. Sen 和 Haber/Maheswaran 实验室的所有实验室成员的讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院（2RO1CA129933 to D.A.H， U01EB012493 to M.T.， D.A.H.， S.M.， U01CA268933 to M.T.， R01CA259007 to D.T.M.， 5P41EB002503 to M.T.）、霍华德休斯医学研究所（D.A.H.）、ESSCO 乳腺癌研究基金（到 S.M.）、前列腺癌基金会（到 D.T.M.， R.J.L. 和 J.A.E.）、由 Svanberg 家族创立的 Cygnus Montanus 基金会（至 D.T.M.）、乳腺癌研究基金会（至 D.A.H.）、国家癌症研究基金会（至 D.A.H.）和马克斯·普朗克研究所（至 A.M.）
脚注
发布者免责声明： 这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供了这份早期版本的手稿。在以最终形式出版之前，手稿将对最终校样进行文案编辑、排版和审查。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，所有适用于期刊的法律免责声明都与此相关。
利益申报
马萨诸塞州总医院（MGH）已申请有关CTC-iChip技术和CTC检测特征的专利。M.T.、S.M. 和 D.A.H. 是联合创始人，并拥有 Tell-Bio 的股权，这与这项工作无关。麻省总医院和麻省总医院（MGB）根据其利益冲突政策对这些作者的利益进行了审查和管理。所有其他作者都声明没有竞争利益。
包容性和多样性 包容性和多样性
我们支持包容、多样化和公平的研究行为。
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引用 引用
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