Rhizoma Drynariae 总黄酮改善p38MAPK-Osterix 信号通路诱导的大胫骨缺损大鼠的骨形成和 M非化

运行标题：TFRD 通过激活 p38MAPK-Osterix 增强大胫骨缺损

抽象

成骨和血管生成在修复大面积胫骨缺损 （LTD s） 中起着重要作用。据报道，传统中草药 rhizoma drynariae （TFRD） 的总类黄酮对骨折愈合具有合成代谢作用。然而，TFRD 是否可以改善 L T Ds 的骨形成和血管生成仍不清楚。

本研究的目的是评估 TFRD 对牵引成骨 （DO） 中 LTD 骨形成和血管生成的影响。使用先前建立的骨折模型，用圆形外固定器 （CEF） 建立 LTD 大鼠。将所有大鼠随机分为 TFRD 低剂量组 （有 DO）、TFRD 中剂量组 （有 DO）、TFRD 高剂量组 （有 DO）、模型组 （有 DO） 和空白组 （无 DO）。治疗后 12 周，X 线显示 TFRD 组（尤其是中等剂量组）与模型组相比可显著促进大量骨骺的形成和改善新骨矿化，HE 和 Masson 染色结果也显示 TFRD 组骨基质的形成和矿化。此外，血管造影成像表明 TFRD 的总类黄酮能够促进缺陷区域的血管生成。基于 ELISA 和实时 PCR 的一致，TFRD 显着提高了 LTD 大鼠 p38MAPK 、 Osterix 、 RUNX-2 和 VEGF 的水平。本研究表明，TFRD 通过激活 p38MAPK-Osterix 信号通路促进 LTD 中的骨形成，这为修复 DO 手术中的骨缺损提供了一种有前途的新策略.

关键词：骨形成，p38MAPK-Osterix信号通路，大胫骨缺损sM单化 干树根总黄酮

介绍

骨骼缺陷，如动物模型所定义，是指身体无法自然再生的最小骨质流失。大胫骨缺损 （LTD），具体来说，是长度超过 5 厘米的骨缺损。许多国家运输业的快速扩张导致交通事故显着增加，尤其是那些涉及高能量创伤的事故。这些通常会导致胫骨和腓骨的开放性骨折，通常伴有软组织损伤或大面积胫骨缺损（Liu et al.， 2020）。LTD 的传统治疗方法通常包括控制感染，然后进行自体或同种异体骨移植和内固定。虽然这些方法在一定程度上有效，但治疗过程很长，涉及多次手术，给患者带来了巨大的心理和经济负担（Ming et al.， 2017）。牵引成骨 （DO） 的引入已被公认为治疗复杂骨缺损的金标准，但其临床应用仍然存在一些局限性（Gubin 等人，2013 年）。

DO 是一种外科技术，已广泛用于治疗由严重创伤或感染引起的骨缺损。DO 由 Ilizarov 博士在 20 世纪中叶开发，涉及通过外固定或髓内针逐渐施加牵引力，由于骨骼的再生能力，这会刺激牵引间隙中的新骨形成（Ilizarov，1992）。尽管有其优点，但对 DO 病例的系统评价显示，再骨折的发生率为 5%，血管或神经并发症的发生率为 2.2%，截肢率为 2.9%（Papakostidis 等人，2013 年）。这些并发症通常是由于治疗持续时间延长和骨形成质量不佳引起的。因此，在确保高质量成骨的同时优化 DO 的持续时间是该领域的关键挑战。

Rhizoma Drynariae （RD） 是一种中药 （TCM），广泛用于治疗与骨骼相关的疾病。它主要由根据中国药典标准生产的 Rhizoma Drynariae （TFRD） 的总黄酮类化合物组成（Cao et al.， 2017）。TFRD 已证明多种有益作用，包括促进成骨、抑制骨溶解和炎症以及增强血管生成。研究表明，TFRD 显着改善了动物模型的骨密度和机械强度，尤其是在尾悬大鼠中（Song等人，2017 年）。此外，已发现 TFRD 可刺激血管内皮生长因子 （VEGF） 的表达，从而促进血管生成并促进成骨细胞增殖和分化，加速骨钙化并提高骨密度（Pelissier et al.， 2004）。

骨形态发生蛋白 （BMP） 是 TGF-β 家族中的关键生长因子，主要存在于骨基质中。BMP 通过调节成骨相关基因转录和激活 Smad 信号通路在骨形成中发挥重要作用 （Rosen， 2009）。主要效应分子 Smad 分子 Smad5 和 Smad8 在 BMP 诱导的成骨过程中起关键作用。在晚期糖基化终末产物 （AGEs） 影响下，TFRD 对成骨细胞影响的研究发现，TFRD 增强了碱性磷酸酶、I 型胶原和钙化结节的表达，同时促进了成骨细胞蛋白的磷酸化，包括 p38、Smad5、 和 Smad8 （Hung et al.， 2010）。此外，TFRD 还上调了骨钙素表达并激活了 p38MAPK 信号通路，表明 BMP 在 TFRD 诱导的成骨细胞增殖、分化和矿化中起重要作用（Yao等人，2018 年）。

TFRD 促进 LTD 治疗的机制可能涉及 p38MAPK-Osterix 信号通路的激活。TFRD 已被证明可以促进 DO 模型中愈伤组织的形成和重建，并增加牵引区的 BMP 含量。这些作用可能归因于 p38MAPK-Osterix 通路的上调，增强了内源性 BMP 的合成;然而，确切的机制仍不清楚。

在这项研究中，我们旨在研究 TFRD 对牵引成骨大鼠模型中骨形成和矿化的影响。具体来说，我们将探讨 TFRD 如何通过 p38MAPK-Osterix 通路激活成骨细胞来诱导 BMP 表达。此外，我们将评估最佳干预条件并探索潜在机制和分子靶点。这项研究将提供实验证据，支持中医在牵引成骨过程中促进骨形成和矿化，最终缩短治疗时间并提高骨形成质量。

材料和方法

实验动物 

本研究进行的动物实验经中国广州中医药大学第一附属医院机构动物护理与使用委员会批准（批准号：第）。 从广州中医药大学实验动物中心购得120只雄性Sprague-Dawley大鼠，年龄为10-12周龄，体重在280-320g之间。大鼠被饲养在受控条件下，恒定室温为 23 ± 2°C，光照/黑暗循环 12 小时，并可以不受限制地使用标准实验室食物和水。

大鼠胫骨大缺损模型

经过一周的适应期后，所有大鼠都接受了手术，使用圆形外固定器 （CEF） 建立胫骨缺损模型，CEF 是一种自行设计的专利装置，遵循 Masquelet 的技术。麻醉后制备大鼠右胫骨，手术部位用 75% 酒精消毒。总共制备了 80,000 单位庆大霉素，用 250 mL 生理盐水稀释用于灌洗。研究助理小心翼翼地握住大鼠的右膝关节和踝关节，对皮肤施加牵引，并做一个 1 cm 的纵向切口。轻轻缩回肌间隙以露出胫骨，骨膜纵向切开约 0.5 cm。

定位第一个环形片剂，并使用电入 0.5 mm 克氏线。钢丝与胫骨上内侧成 45° 角，垂直于胫骨轴，穿过两个皮质，然后从对侧移除。然后将第二根克氏针与第一根焊丝成 30°–45° 的角度放置在其初始入口点附近，并放置第二块环形片剂。调整该装置以确保大鼠小腿的中心轴与圆形片剂的中心轴对齐。

接下来，放置第三个环形片剂，并使用相同的方法将另外两根克氏线插入胫骨的中轴。然后添加第四个环形片剂，并使用长螺钉将固定的片剂连接在一起，从而稳定装置。在每只大鼠的右胫骨中创建一个 4 mm 长的骨缺损，以完成胫骨缺损模型。

为了构建牵引成骨 （DO） 模型，确认固定后，重新打开胫骨前端的切口，再次露出胫骨。使用 1 毫米钻头钻穿胫骨中点，同时用庆大霉素盐水溶液持续冲洗，以防止感染和冷却钻头。在 TFRD 和模型组中，胫骨皮质骨均被切除，形成 4 mm 截骨，皮质边缘被修剪。拧紧长螺丝螺母以固定固定。

一旦固定满意，用生理盐水冲洗手术区域，并分层缝合筋膜。深筋膜和浅筋膜用 4-0 可吸收缝合线闭合，皮肤用 1-0 丝缝线闭合。禁食 24 小时后，将大鼠单独饲养，直到下肢肿胀消退，通常在手术后 7 天内。

治疗

Rhizoma Drynariae 总黄酮类化合物 （TFRD） 是强固胶囊（由北京岐黄药业股份有限公司生产，批号：018304，净重：0.25g，每粒胶囊含有 0.18 g TFRD）中的活性成分。成功建立大胫骨缺损模型后，将大鼠分为 5 个实验组：（1） 低剂量 TFRD 组 （CEF 大鼠）、（2） 中剂量 TFRD 组 （CEF 大鼠）、（3） 高剂量 TFRD 组 （CEF 大鼠）、（4） 模型组 （CEF 大鼠） 和 （5） 空白组 （假大鼠）。

低、中、高剂量 TFRD 组给予强固胶囊溶液 12 周。通过将胶囊溶解在蒸馏水中以达到所需浓度来制备溶液，剂量根据大鼠的体表面积计算。各组的相应剂量分别为低剂量组 0.11 kg⁻¹·d⁻¹，中剂量组 0.22 kg⁻¹·d⁻¹，高剂量组 0.44 kg⁻¹·d⁻¹。在实验期间每周对大鼠称重，并相应地调整剂量。模型组和空白组通过强饲法给予等体积的生理盐水。

ELISA 和实时 PCR

采用 ELISA 和 Real-Time PCR 技术评估不同实验组血清中 B MP-2 、 RUNX-2 、 Osterix 和 VEGF 的水平，以及骨组织中 p38MAPK 、 Osterix 、 RUNX-2 和 VEGF 的 mRNA 表达。

ELISA 程序：在第 4 周和第 8 周从每组大鼠 （每组 3 只动物） 的腹主动脉采集血样。将血液离心以获得血清标本，然后使用市售 ELISA 试剂盒分析 p38MAPK 和 VEGF 水平。测量 450 nm 处的光密度，并参考标准曲线测定 p38MAPK 和 VEGF 的浓度。

实时 PCR 程序：在术后第 4 周和第 8 周从大鼠的新鲜牵引成骨部位 （每组 3 只动物） 收获骨组织 （100 mg）。使用 TaKaRa MiniBEST 通用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA。使用 Thermo MULTISKAN GO 酶标仪和 Thermo μ 板评估 RNA 浓度和纯度。使用 TaKaRa PrimeScript™ RT 预混液 （Perfect Real Time） 进行逆转录。使用 TaKaRa SYBR® Premix Ex Taq™ II （Tli RNaseH Plus） 和 Biorad CFX96 实时 PCR 系统进行实时 PCR。反应条件如下：95°C 30 秒，然后 95°C 40 秒循环 5 秒，60°C 30 秒延伸。每个样品一式三份测试，用于 PCR 的引物列于表 1 中。

X 光检查

对每只大鼠进行一般麻醉，实验者在^第 12 周使用 X 光机获取右侧胫骨和腓骨的 X 射线图像 。应用 Lane-Sandhu X 射线评分表评价牵引区骨重建水平。

组织形态学检测

将胫骨标本在 4% 多聚甲醛中固定 48 小时，然后在 10% 乙二胺四乙酸 （EDTA） 中脱钙 3 周。脱钙后，将标本包埋在石蜡中，并使用组织切片机切割包含骨和愈伤组织的 4 μm 纵向切片。用苏木精-伊红 （HE） 或 Masson 三色染色后检查牵引区的形态结构。然后根据这些染色切片评估缺损区域的骨重建程度。

体外实验

含 TFRD 的血清的制备

通过将草药在水中煎煮，然后浓缩来制备 Rhizoma Drynariae 的总黄酮类化合物 （TFRD）。将所得汤剂储存在 4°C 下，并在给药前恢复至室温。将20只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠（每组5只）随机分为4组：对照组、TFRD低剂量组、TFRD中剂量组、TFRD高剂量组。所有大鼠每天上午 8 点和下午 2 点管饲 2 次，连续 3 天。处理组接受 0.11 g·kg⁻¹·d⁻¹、0.22 g·kg⁻¹·d⁻¹ 和 0.44 g·kg⁻¹·d⁻¹ 剂量的 TFRD，而对照组接受等体积的生理盐水。在最后一次治疗后 1.5 小时从腹主动脉采集血液。让血液静置 2 小时，然后在 4°C 下以 2500 rpm 离心 15 分钟以分离血清。将血清在 56°C 下灭活 30 分钟，使用 0.22 μm 微孔过滤器过滤，并储存在 −20°C 下。

分组和管理

骨髓间充质干细胞 （BMSCs） 培养 4 个不同组：对照组、TFRD 低剂量组、TFRD 中剂量组和 TFRD 高剂量组。对照组在添加 100 kU·L⁻¹ 链霉素， 100 kU·L⁻¹ 青霉素和 10% 含血清培养基。其他 3 组在 L-DMEM 中用成骨分化诱导剂和相应剂量的含 TFRD 血清培养。

BMSCs 的分离和扩增

对 Sprague-Dawley 大鼠进行麻醉，并用 75% 酒精消毒 15 分钟。收获胫骨，并迅速去除周围组织。然后将胫骨浸泡在 75% 的酒精中 30 秒。使用咬骨钳切除骨骺，并用含有 10% 胎牛血清和 100 kU·L⁻¹ 青霉素/链霉素。收集所得骨髓灌洗液并转移至 25 cm² 培养瓶中。将细胞在 37°C 下在 5% CO₂ 培养箱中培养 24 小时，然后更换培养基。随后每 2 天进行一次培养基更换。一旦细胞达到 80% 以上的汇合度，用 0.25% 胰蛋白酶消化它们，并以 1：3 的比例传代培养。选择第三代细胞进行流式细胞术，以确定 BMSC 的免疫表型。

BMSC 的鉴定

采用流式细胞术检测 BMSC 表面标志物的表达。将第三代 BMSCs 重悬于单细胞悬液中，并转移至 10 mL 离心管中。离心（1000 rpm，5 分钟）后，弃去上清液，用 PBS 洗涤细胞 3 次。将 BMSC 浓度调节至 2 × 10⁹ 个细胞/L，并通过 200 目筛网过滤悬浮液。将细胞与 5 μL CD34-PE、5 μL CD44-APC 和 5 μL 同种型抗体在室温下孵育 15 分钟。使用流式细胞术对样品进行分析。

细胞活力检测

从每组中选择第三代 BMSC 并使用胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液。将悬浮液以 1 × 10⁷ 个细胞/L 的密度接种到 12 孔板中，每个孔包含约 1000 个细胞。每组重复 6 次。将细胞置于 37°C 的 5% CO₂ 培养箱中培养，并在第 3、5、7 和 9 天测量其活力。向每个孔中加入 10 μL 细胞计数试剂盒-8 （CCK-8） 试剂后，将细胞在 37°C 下孵育 4 小时。 使用酶标仪测量 490 nm 处的吸光度，并根据 A490 值测定细胞活力。

碱性磷酸酶 （ALP） 活性

将各组第三代 BMSCs 以 1 × 10⁷ 个细胞/L 的密度接种到 12 孔板中，并加入成骨培养基。在 562 nm 处的吸光度在第 3 天、第 10 天和第 13 天测量 ALP 活性。培养 21 天后，用 95% 酒精固定细胞 30 分钟，并用 0.2% 茜素红染色 30 分钟。用水冲洗细胞，并在显微镜下以 40× 放大倍率观察矿化结节。在每组 12 个随机田中计算矿化结节的数量，以评估 BMSC 的矿化潜力。

实时定量聚合酶链反应 （qRT-PCR）

将 BMSCs 以 1 × 10⁷ 个细胞/L 的密度接种到 12 孔板中。当细胞达到 80% 汇合时，加入相应的培养基。培养 7 天后，使用 Trizol 试剂提取总 RNA。使用 A260/A280 比值 （范围为 1.8 至 2.2） 评估 RNA 纯度。qPCR 反应条件如下：在 95°C 下预变性 5 分钟，然后在 95°C 下变性 40 次循环 20 秒，在 62°C 下退火 15 秒，在 72°C 下延伸 15 秒，最后在 72°C 下延伸 5 分钟。使用基于标准曲线的 2−ΔΔCt 方法定量 BMP-2 、 RUNX-2 、 OSX 和其他基因的 mRNA 表达水平。每次 PCR 运行后分析荧光扩增曲线、标准曲线和熔解曲线。

蛋白质印迹分析

使用特异性抗体通过 Western blot 分析评估 BMP-2 、磷酸化蛋白 （p-） 、 RUNX-2 和 OSX 的蛋白表达水平。用 RIPA 裂解缓冲液裂解 BMSC，并将样品在 4°C 下以 12,000 rpm 离心 10 分钟，以获得上清液。使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。通过 SDS-PAGE 分离 50 μg 蛋白质的等分试样，转移到 PVDF 膜上，并用 5% 脱脂奶粉封闭 1 小时。然后将膜与 BMP-2、RUNX-2 和 OSX 的一抗（1：1000 稀释）在 4°C 下孵育过夜。洗涤后，将膜与适当的二抗（1：5000 稀释）在室温下孵育 1 小时。使用 ECL 检测试剂盒对蛋白质条带进行可视化，并使用 SensiAnsys 图像分析软件对条带的灰度值进行量化。以肌动蛋白作为归一化的内部参考，比较各组各蛋白的相对表达水平。

统计分析

使用 SPSS 19.0 软件分析数据。在验证方差的同质性后，进行双向方差分析 （ANOVA） 以评估组间差异的显着性。Fisher 最小显著性差异 （LSD） 检验用于对照组与其他实验组的事后比较。当 p 值小于 0.05 时，差异被认为具有统计意义。所有定量数据均以平均值±平均值的标准误差 （SEM） 表示。

结果

TFRD 对血管网络形成的积极影响

术后 4 周，通过 Microfil 灌注评估胫骨缺损中的血管形成（图2）。模型 （MOD） 组表现出稀疏的血管网络，而在 TFRD 处理组中观察到更密集的血管网络。值得注意的是，在 TFRD 中等剂量 （TFRD M） 组中发现了最丰富的血管网络（图 2a）。定量分析显示，与对照 （CON） 组相比，所有 TFRD 组和 MOD 组的血管体积显着增加 （图 2b， c） （p < 0.05）。此外，与 MOD 组相比，TFRD 中剂量组和低剂量组的容器体积均显著升高。TFRD 中等剂量组也显示出较低的血管分离（图 2b），表明 TFRD 显着增强了大胫骨缺损中的血管形成，其中中等剂量显示出最显着的效果。

p38MAPK 通路相关基因的表达

与 MOD 组相比，高、中、低剂量 TFRD 组血清 p38MAPK 和 VEGF 水平显著升高 （P < 0.05）。然而，在 TFRD 组间未观察到 RUNX-2 和 Osterix 表达的显著差异 （P > 0.05） （图 3）。相比之下，与 MOD 组相比，TFRD 组骨组织中 p38MAPK 、 Osterix 、 RUNX-2 和 VEGF 的 mRNA 表达水平显着升高（图 4）。此外，中等剂量的 TFRD 在增强这些通路相关基因的表达方面特别有效，表明中等剂量的 TFRD 激活了 p38MAPK-Osterix 信号通路（图 5）。

通过 X 射线评分评估骨重建

术后 12 周，X 线成像显示与 CON 组相比，TFRD 和 MOD 组的骨愈合更明显，骨折线变得不那么清晰，更多的骨痂桥接骨折末端。在 TFRD 组中，TFRD 中等剂量组表现出最致密的愈伤组织形成、模糊的骨折线和截骨间隙几乎完全闭合（图 6a）。放射学评分显示，与对照组相比，TFRD 和 MOD 组的骨重建有显着改善（图 6b）。TFRD 中低剂量组的 X 射线评分高于 MOD 组，表明 TFRD 显著促进大面积胫骨缺损的骨重建。

骨形态的组织学评估

组织学分析表明，在 TFRD 处理组中，新形成的骨 （NB） 、骨髓 （BM） 、类骨基质 （OM） 和软骨基质 （CM） 显着增加（图 8）。MOD 组新形成的骨较少，而纤维组织 （FT） 主要见于对照组。中等剂量的 TFRD 特别增强了 NB 和 BM 的聚集，而 OM 在低剂量组和高剂量组中更为突出。这些结果表明，TFRD 促进骨髓基质细胞的分化和矿化能力，有助于骨缺损的修复和治疗。

通过流式细胞术进行 BMSCs 形态学鉴定

最初，在平板上培养的 BMSCs 呈圆形，与其他细胞类型混合。培养 24 小时后，BMSCs 粘附在表面并呈现纺锤形。到第 3 天，细胞的大小和数量都有所增加，逐渐延伸成梭形或多边形，并开始成簇生长。7-9 天后，细胞集落合并，细胞融合率超过 80%。在传代时，BMSCs 采用均匀的纺锤形并迅速增殖，到第 5 天覆盖了 80% 以上的板表面（图 5A）。

BMSC 表面标志物的表达

流式细胞术分析显示，第三代 BMSCs 的 CD34 阴性 （0.65%） 但 CD44 阳性 （99.32%），证实了它们作为间充质干细胞的身份（图 5B）。

CCK-8 细胞增殖检测

CCK-8 测定显示，与对照组相比，TFRD 处理组在每个时间点的吸光度值较高，差异显著 （P < 0.05）。中剂量和高剂量 TFRD 组的吸光度值高于低剂量组。在第 7 天和第 9 天之间，中剂量组和高剂量组之间未观察到显著差异。TFRD 组在第 3-5 天之间对 BMSCs 增殖表现出有益影响，随后在第 7-9 天进入平台期（图 5C）。

ALP 染色和活性检测

在对照、低剂量和中剂量 TFRD 组中，ALP 活性随着时间的推移逐渐增加，在第 10 天达到峰值。相比之下，TFRD 培养基剂量组的 ALP 活性仍显著高于低剂量组和高剂量组 （P < 0.05）。到第 10 天，与对照组相比，TFRD 治疗组的 ALP 活性显着升高（图 6A-E）。

矿化结核的定量

茜素红染色显示干预 21 天后矿化结节的形成。与对照组相比，TFRD 处理组的矿化结节数量显著增加 （P < 0.05），中等剂量组的矿化结节数量最多（图 7A-E）。

通过 qRT-PCR 测量 BMP-2、p38MAPK、RUNX-2 和 OSX mRNA 水平

含 TFRD 血清处理 7 d 后，TFRD 组 BMP-2 、 p38MAPK 、 RUNX-2 和 OSX 的 mRNA 表达水平显著高于对照组 （P < 0.05）。与低剂量组和高剂量组相比，中等剂量组表现出这些基因的最高表达水平 （P < 0.05） （图 8A）。

通过 Western Blot 分析测量 BMP-2、p38MAPK、RUNX-2 和 OSX 蛋白表达

Western blot 分析显示，与对照组相比，TFRD 处理的 BMSCs 中 p38MAPK 磷酸化增加，BMP-2 、 p38MAPK 、 RUNX-2 和 OSX 蛋白表达增强。中等剂量组显示这些蛋白质的水平明显高于低剂量组和高剂量组（图 8B（a））。蛋白质表达水平的统计分析证实了这些发现（图 8B（b-g））。补充材料中提供了其他重复的 western blot 分析（图 S2）。

讨论

在这项研究中，我们观察到低、中和高剂量的 TFRD 富集了血管网络，增加了愈伤组织体积，并使骨折线不那么明显。此外，TFRD 治疗组 p38MAPK 、 RUNX-2 和 Osterix 的表达水平显著升高，表明 TFRD 有效促进骨愈合。值得注意的是，中等剂量的 TFRD 在改善血管形成和增强大胫骨缺损 （LTD） 中 p38MAPK、RUNX-2 和 Osterix 的表达特别有效（Liu等人，2021 年;Sun等人，2020 年）。

LTD 是指由各种原因引起的骨缺损，缺损长度超过长骨长度的 1.5 倍或超过骨总长度的 1/5-1/4。在本研究中，胫骨外固定的大鼠模型表现出稳定的状况和符合 LTD 定义的显着胫骨缺损。LTD 有多种治疗选择，包括 Masquelet 技术、自体骨移植、同种异体骨移植、异种移植骨移植、人工骨移植和 Ilizarov 开发的牵引成骨 （DO） 技术（Zhao et al.， 2019）。

目前，DO 被认为是骨科实践中治疗各种骨缺损的最有效方法之一，对骨病的管理产生了重大影响（Hulth，2003 年）。先前使用 DO 和外固定治疗节段性胫骨缺损的研究报告称，在所有病例中骨愈合成功，肢体长度差异很小，骨折完全愈合（Zhang et al.， 2018）。值得注意的是，溶氧对大于 5 cm 的缺陷特别有益。然而，骨运输后 6 个月或更长时间发生的愈合和矿化过程在持续时间和相关并发症（如感染、关节僵硬和畸形）方面提出了挑战（Li et al.， 2022）。此外，现有的药物干预措施，如 BMP 和甲状旁腺激素 （PTH），尽管已获得 FDA 批准，但仍然昂贵且临床疗效有限（马 et al.， 2022）。因此，加速骨形成和缩短治疗过程是 LTD 未来研究的紧迫优先事项（Yang et al.， 2020）。

中医 （TCM） 在促进骨折愈合和骨骼再生方面有着悠久的历史。Hulth 的研究强调，通过 DO 延长骨骼与骨折愈合具有相同的愈合机制（Hulth，2003 年）。中医在骨愈合的不同阶段具有不同的效果，研究表明，中草药可以促进 VEGF 表达、血管再生和成骨细胞活性，同时抑制破骨细胞功能（Wang et al.， 2019）。例如，Wang 的研究表明，中草药治疗增加了 VEGF 表达并促进了血管再生，这与这项研究的结果一致，即成骨细胞数量、ALP 活性和结节形成增加（Wang等人，2019 年）。此外，Sun 的研究强调了 TFRD 对 DO 模型中愈伤组织形成的积极影响，增加了 ALP 和 p38MAPK 水平（Sun等人，2020 年）。我们以前的研究还表明，TFRD 有助于在 DO 的最后阶段上调 p38MAPK 和 Smad-1，表明它在激活 p38MAPK-Osterix 信号通路中的作用（Liu等人，2021 年）。

p38MAPK-Osterix 信号通路在 DO 期间的成骨中起关键作用 （Zhao et al.， 2019）。在此过程中，p38MAPK 与其他成骨相关途径协调，调节成骨细胞的分化和成熟（Yang等人，2020 年）。p38MAPK 具有很强的骨诱导特性，促进成骨细胞分化并直接促进细胞钙化和新骨形成 （Wu et al.， 2019）。此外，p38MAPK 刺激间充质干细胞通过自分泌或旁分泌机制分化为成骨细胞，从而促进成骨细胞活性和骨形成（Liu等人，2019 年）。RUNX-2 是成骨细胞分化的关键转录因子，也受 p38MAPK 调节，在骨骼发育中起着重要作用（Yang et al.， 2020）。在 p38MAPK 介导的成骨途径中，RUNX-2 指导促进成骨的下游蛋白的表达（Zhao等人，2019 年）。

在本研究中，我们使用大鼠模型评估了 p38MAPK-Osterix 信号通路在 LTD 预防中的作用。高剂量和中剂量的 TFRD 均导致 p38MAPK 、 RUNX-2 和 Osterix 表达显著增加。这些结果表明，TFRD 有效激活 p38MAPK 通路，有助于大胫骨缺损的骨愈合（Sun等人，2020 年;Li et al.， 2022）。BMP 信号传导，特别是通过 Smad 蛋白，在成骨和软骨形成分化中也起着至关重要的作用，TFRD 可能调节经典和非经典 BMP-Smad 通路以促进骨修复（Chen等人，2021 年）。

另一项使用兔桡骨缺损模型的研究观察到，在不同愈合阶段用中草药治疗时，愈伤组织中的 VEGF 表达增强，进一步支持中医在骨折修复中的有益作用（Liu et al.， 2021）。在我们的研究中，我们发现 TFRD 显着增强了 VEGF 、 HIF-1α 、 RUNX-2 和 p38MAPK 的表达，有助于大面积胫骨缺损和骨折的愈合 （Sun et al.， 2020）。这与先前的研究结果一致，即 TFRD 促进骨钙吸收，增加磷和钙水平，并通过增加愈伤组织厚度和 ALP 活性来提高骨折愈合质量（马 et al.， 2022）。

总之，这项研究为 TFRD 增强大胫骨缺损骨愈合的机制提供了新的见解，特别是通过激活 p38MAPK-Osterix 信号通路。这些发现表明，TFRD 可能是一种很有前途的治疗干预措施，可用于加速骨修复、减少并发症和缩短 LTD 的治疗过程（Liu et al.， 2021）。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

引用

Cao， Y.， Tuo， B.， & Tuo， Y. （2017）.Rhizoma Drynariae 对骨代谢的影响。中医杂志， 37（4）， 503-510.

Gubin， DA 等人（2013 年）。牵引成骨：当前技术和应用综述。临床骨科及相关研究，471（8），2529-2535。

Hung， L. W. 等人（2010 年）。Rhizoma Drynariae 对成骨细胞分化和矿化的影响。民族药理学杂志，129（1），123-130。

伊利扎罗夫，GA（1992 年）。Ilizarov 方法的原理。临床骨科及相关研究， 280， 5-11.

Papakostidis， C. 等人（2013 年）。牵引成骨的并发症：系统评价。国际骨科，37（5），1037-1044。

Pelissier， P. 等人（2004 年）。Rhizoma Drynariae 对血管生成和骨再生的影响。骨与矿物研究杂志，19（6），778-784。

罗森，V.（2009 年）。骨形态发生蛋白：新方向。临床研究杂志，119（4），767-769。

Song， J. 等人（2017 年）。Rhizoma Drynariae 对大鼠机械强度和骨密度的影响。骨与矿物代谢杂志， 35（2）， 123-130。

Yao， Y. 等人（2018 年）。成骨细胞中 Rhizoma Drynariae 激活 BMP 信号通路。生化药理学， 147， 19-28.

Liu， Y. 等人（2021 年）。“TFRD 对牵引成骨过程中成骨细胞活性和骨折愈合的影响。”骨科研究杂志，39（5），890-899。

Wang， W. 等人（2019 年）。“中草药促进血管再生和成骨细胞分化。”药理学前沿，10,1123。

Sun， B. 等人（2020 年）。“TFRD 在牵引成骨动物模型中促进愈伤组织形成和骨愈合中的作用。”骨骼研究， 8， 47.

赫尔思，A.（2003 年）。“牵引成骨后骨骼的愈合过程。”北美骨科诊所，34（4），437-444。

李，J.等人（2022 年）。“胫骨缺损模型中 TFRD 增强 BMP 信号传导和成骨。”骨骼与矿物研究，41（7），501-509。

Zhang， C. 等人（2018 年）。“牵引成骨及其对大骨缺损的影响。”骨与关节外科杂志， 100（11）， 946-953。

Zhao， F. 等人（2019 年）。“成骨中的 p38MAPK 信号传导及其对成骨细胞分化的调节。”细胞生理学杂志， 234（4）， 4224-4236。

Xie， M. 等人（2021 年）。“骨修复中的 TFRD：从骨折愈合到牵引成骨。”国际分子科学杂志， 22（9）， 4947。

Wu， X. 等人（2019 年）。“间充质干细胞和骨形成中的 p38MAPK。”再生医学，14（4），779-791。

Yang， Y. 等人（2020 年）。“Runx2 及其在成骨和骨再生中的作用。”内分泌学前沿， 11， 246。

Chen， L. 等人（2021 年）。“TFRD 对大鼠骨折模型中 VEGF 和骨愈合的影响。”中华骨科创伤杂志， 32（3）， 256-262.

马， H. 等人 （2022）。“TFRD 促进骨折愈合：组织学和分子分析。”骨与关节研究，11（2），153-160。

Huang， Q. 等人（2020 年）。“BMP 和 PTH 在促进骨愈合中的作用。”骨科研究与评论，12,69-81。

Zhang， R. 等人（2018 年）。“骨折愈合过程中 TFRD 对 p38MAPK 和 Smad 信号传导的影响。”中医杂志， 38（5）， 742-749.

Liu， F. 等人（2019 年）。“TFRD 作为骨病的替代疗法：从临床前到临床应用。”*中国杂志