第2章
研究干细胞的技术和方法
干细胞培养——最佳条件和技术：
•
重点关注当前优化干细胞培养的程序和方法。
•
研究的细胞类型：
•
胚胎干,
•
造血，
•
脂肪衍生谱系。
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2.1
胚胎干细胞培养
•
在实验室中培养细胞称为细胞培养。
•
在自然体内环境之外的受控条件下进行细胞的体外生长和操作。
•
该术语与组织培养可互换使用。
•
组织培养实验方案包括：
•
真核动物细胞，
•
植物细胞，
•
菌类，
•
细菌。
3
•
干细胞是从植入前阶段的胚胎产生的；
•
转移到装有培养基的培养皿中。
•
细胞分裂并散布在培养皿表面。
•
培养皿涂有小鼠胚胎皮肤细胞；该细胞涂层称为饲养层。
•
提供附着表面；
•
将营养物质释放到培养基中。
4
2.1.1 胚胎干细胞的维持
•
ESC 源自内细胞团 (ICM)。
•
利用胚胎癌细胞作为模型系统的细胞培养技术
•
针对从囊胚 ICM 中分离和培养 ESC 进行了优化。
•
已成功应用于多种物种，包括小鼠、灵长类动物和人类。
5
6
A从卵裂期胚胎的活检卵裂球中衍生出 hESC。
显微照片显示使用倒置显微镜连接的显微操作器进行胚胎活检的逐步过程（A-D）以及衍生过程中初始生长和 hESC 集落的外观（E-L）。所有照片均使用安装在显微镜上的数码相机和霍夫曼光学器件在 200 倍总放大倍率下拍摄。
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•
胚胎干细胞（ESC）在再生医学和细胞治疗方面具有巨大潜力
•
干细胞直接移植存在免疫排斥和肿瘤等多种局限性。
•
无细胞方法可能为再生医学和衰老干预提供替代治疗策略。
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•
维持全能性的 ES 细胞培养要求：
•
细胞保持未分化状态。
•
细胞保持其正常的能力和分化范围。
•
这些细胞保留了正常的核型，这是种系传播的先决条件。
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•
维持干细胞状态：
•
抑制分化，
•
用有丝分裂失活的饲养细胞培养，
•
或存在白血病抑制因子（LIF）的情况下。
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图2.1 mESC-CM的制备和优化。无血清和无饲养层 CM 的制备和优化实验策略。 (A) 正常 mESC 培养条件和 (B) 无血清和无饲养层 mESC-CM 培养条件。 C：不含FBS和MEF的对照培养基； CM：不含FBS和MEF的条件培养基。
(胎牛血清，FBS)； MEF：小鼠胚胎成纤维细胞
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图 2.2 mESC 的明场图像。 (A) 正常条件和 (B) 无血清和饲养层条件下的 mESC。黄色箭头表示正常的饲养细胞 (MEF) ŵ ^ ĐƵůƚƵƌĞ ĐŽŶĚŝƚŝŽŶƐ͘ ^ĐĂůĞ ďĂƌƐ с ϭϬϬ ʅŵ͘
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• 培养的人类多能干细胞：
•
正常核型，
•
高水平的端粒酶活性，
•
干细胞的细胞表面标记
•
体外4~5个月后仍保持形成滋养层和所有三个胚胎胚层的衍生物的发育潜力：肠道
•
上皮；
•
软骨、骨、平滑肌和横纹肌；
•
神经上皮、胚胎神经节和复层鳞状上皮。
•
可用于人类发育生物学、药物发现和移植医学。
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14
图 2.3 H9 细胞系的衍生。 (A) 培养 8 天后附着于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的内细胞团衍生细胞，LSYVW FIJSVI JMVWX HMWWSGMEXMSR 7GEPI FEV ΦQ B) H9 集落。比例尺，ΦQC，GIPPW 7GEPI FEV ΦQ D) 分化的 H9 细胞，在没有小鼠胚胎成纤维细胞的情况下培养 5 天，但在存在 SJ LYQER 0-* RK QP 7MKQE 7GEPI FEV ΦQ
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图 2.4 培养中的早期传代、未分化人胚胎干细胞集落。它们生长在人类包皮成纤维细胞的饲养层上。
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(A) 正常条件和 (B) 无血清和无饲养细胞条件下的 mESC 图 2.5 在无饲养细胞的无血清条件下培养的未分化小鼠胚胎干细胞集落。
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图 2.6 在无饲养细胞的无血清条件下培养的小鼠胚胎干细胞集落。集落边缘周围的细胞自发分化成不同的细胞类型。
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2.1.2 人类ESC的饲养层依赖性培养
•
饲养层依赖性干细胞培养系统：
•
用于维持需要与“饲养细胞”共培养的干细胞；
•
例如成纤维细胞，以支持这些干细胞的多能性和增殖潜力。
•
预先制备成纤维细胞接种板。
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•
饲养细胞通过代谢渗漏调节培养基，并为培养中的干细胞提供许多其他必需的蛋白质；
•
最常见的是生长因子和细胞外基质蛋白。
•
为细胞附着和增殖提供支持基质。
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•
小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)：
•
辐照或用丝裂霉素 C 处理：
•
这种“失活”作用通过丝裂霉素 C 抑制细胞周期；
•
以防止 MEF 过度增长并在竞争中击败增长较慢的 PSC。
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•
使用人类包皮成纤维细胞（HFF）的比例较小，
•
不含异种物质的替代品，
•
更适合临床应用。
无论饲养层来自小鼠还是人类，它们都在涂有 0.1% 即用型明胶的平板上培养。
22
•
饲喂器提供了一种更稳健的方法，因为通过生长因子补充培养基将导致因子的添加更加脉动，并且将更多地依赖于细致的关注。
•
相反，要提供足够的喂食器，就需要在每次传代时对其进行设置和灭活。
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图 2.7 建议使用小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 作为干细胞培养的饲养细胞。
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2.1.3 维持hES细胞的饲养细胞分泌的因子
•
成纤维细胞释放到培养基中的外源因子使 ESC 保持多能状态，并允许这些细胞进行未分化的自我更新和增殖。
•
维持 hES 细胞的饲养细胞分泌的因子
•
基本 FGF、noggin、激活素 A 和 TGF-ɴϭ ŚĂǀĞ ďĞĞŶ ĚĞĨŝŝŶĞĚ 作为 hES 细胞培养所需的关键确定因子。
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图 2.8 维持人类胚胎干细胞多能性的途径。
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2.1.4 无饲养层干细胞培养
•
使得在无饲养系统中培养多能干细胞成为可能，
•
通过利用细胞外基质代替饲养细胞。
•
无饲养层培养体系在促进多能细胞生长和抑制自发细胞分化之间取得了平衡
•
通过必需氨基酸、盐、其他营养元素和生长因子的微调培养基配方。
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图 2.9 为了减少饲养细胞培养条件和质量的变异性，在没有饲养层的情况下使用饲养细胞条件培养基都取得了进展，通常使用纤连蛋白或基质胶（Engelbreth-Holm 分泌的一种凝胶状蛋白质混合物） -Swarm (EHS) 小鼠肉瘤细胞，由 BD Biosciences 销售）的坚实支持。
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•
饲喂器提供了一种更稳健的方法，因为通过生长因子补充培养基将导致因子的添加更加脉动，并且将更多地依赖于细致的关注。
•
相反，要提供足够的喂食器，就需要在每次传代时对其进行设置和灭活。
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2.1.5 选择合适的培养系统
•
对于馈线依赖系统（MEF）：
•
干细胞的附着方式
•
将营养物质释放到培养基中以促进细胞增殖。
•
缺点：
•
劳动强度更大，
•
有传播风险
•
产生干细胞和成纤维细胞的混合培养物。
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• 无饲养层培养条件的优点：
•
更容易使用，
•
更具可重复性，
•
适合更大的规模。
•
避免干细胞和成纤维细胞的混合培养。
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干细胞类型
来源
文化体系
无血清
多能性
诱导多能干细胞
诱导多能干细胞
产后组织
具有 MEF 或 HFF 的馈线相关系统；或细胞外基质
Yes
ESCs
人胚胎干细胞
囊胚期胚胎 mESC
饲养依赖系统，或明胶
No
多能
成人
干细胞
MSCs
产后组织
无馈线系统
No
CSCs
肿瘤
Yes
表1为不同细胞选择最佳培养体系。
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2.1.6 造血干细胞培养
•
造血干细胞（HSC）：
•
使用特定的水溶性细胞因子进行 HSC 扩增和离体培养的早期研究。
•
它们支持 HSC 的增殖和活力。
•
特定的、明确的因素和途径（例如 Notch 信号传导）代表了 HSC 存活的更具确定性的过程。
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图3.0 造血干细胞（HSC）在间充质细胞上的共培养
34
•
骨髓和外周血干细胞（PBSC）培养成功。
•
利用脐带血（CB）细胞作为模型系统将重点关注用于培养这种细胞类型的过程和方法。
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HSC 增殖的 Notch 调节
•
结果表明，分化能力和细胞活力主要取决于细胞间相互作用。
•
相邻细胞之间的物理和化学连接被认为提供了关键的信号传导线索，
•
两者都用于定义效力和细胞分裂能力。
•
人们发现Notch信号级联在它们的传播中发挥着重要作用。
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图 3.1 Notch 信号通路示意图。 A.细胞水平的Notch信号传导。 B. 转录水平的Notch信号传导。
37
•
在哺乳动物中发现了四种 Notch 同源物 (1-4) 和五种相应的配体（Jagged 1 和 2 以及 Delta 1-3）。
•
Notch 的胞外结构域与相邻细胞上的五个配体之一之间的相互作用激活受体蛋白水解，驱动胞内结构域进入细胞核，与转录因子 CSL (CBF1/Z W:ʃ) 直接相互作用，转录因子 CSL (CBF1/Z W:ʃ) 从转录抑制子转变为转录激活子。 CSL 随后激活 HES1 和 HES5 阻遏蛋白，从而抑制驱动 B 细胞和骨髓细胞终末分化所必需的基因表达。
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HSC 增殖的其他驱动因素
•
HSC 与基质细胞和生长因子/细胞因子的共培养已被证明可导致 CD34+ 细胞扩增 40 倍。
•
前列腺素 E2 (PGE2) 也被证明可以促进 HSC 的形成
•
推测通过Wnt途径，
•
ĂĐƚŝǀĂƚŝŶŐ ɴ-连环蛋白表达。
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图 3.2 Wnt 通路图。
40
•
铜（Cu）可能在HSPCs增殖和分化的调节中发挥作用，
•
较高水平会导致细胞衰老
•
分化成成熟的谱系。
•
添加铜螯合剂四亚乙基五胺 (TEPA) 以及细胞因子 TPO、IL-6、SCF 和 Flt3 配体，培养 7 周后，CD34+ 细胞增加了 160 倍。
41
•
先驱研究人员已经操纵 Notch 信号通路来离体培养 HSC。
•
Irwin Bernstein 选择通过引入工程配体 Jagged1 和 Delta1 来激活 HSC 中的内源性 Notch 信号传导。
•
这些配体的存在激活了内源性受体并驱动了小鼠 HSC 干细胞祖细胞的扩增。
•
研究人员将这些研究扩展到人类 HSPC，将配体的递送与纤连蛋白片段和各种细胞因子（包括 Flt3 配体、IL-3、IL-6、SCF 和 TPO）结合起来。
•
这导致 CD34+ HSPC 的数量增加了 200 倍以上。
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2.1.7 脂肪干细胞培养
•
脂肪干细胞（ASC）：
•
被称为多能脂肪干细胞（MADS），
•
分化成多种谱系；
•
可以从脂肪组织中分离出来，不会对患者造成严重风险。
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图 3.3 从白色脂肪组织 (WAT) 中分离人多能脂肪干细胞 (hMADS)、培养并分化为终末谱系的示意图。
44
•
ASC 表现出间充质干细胞 (MSC) 的特征和特性。
•
更容易收获。
•
提供充足的 MSC 和 ASC 供应，并且可以在常规操作过程中收获大量细胞，且发病率较低。
•
成功分离纯化MADS；
•
由于已建立的标记表达模式；
•
允许有效的流式细胞术表征和纯化。
45
•
已经在外科领域利用 hMADS 进行了许多临床试验，在整形、口腔和心脏手术中取得了可喜的结果。
•
成功收获和分离
•
体外细胞培养条件的优化。
•
脂肪抽吸物，
•
最常见的是常规和专业整容手术的一次性副产品，
•
hMADS 使用最广泛的来源。
46
•
从脂肪抽吸物中分离 hMADS：
•
选择 CD44、CD105 和 CD271 (LNGFR) 阳性且 CD45 阴性的细胞。
•
使用与特异性抗体缀合的磁珠来精确分离 hMADS。
47
•
Miltenyi Biotec 提供了 CD271 MicroBead 试剂盒，可通过流式细胞术有效分离 CD271+ 细胞。
•
产生原发性 hMADS 的纯群体；
•
随后可以扩展并定向分化成许多成熟的谱系。
48
图3.4
49
•
一种在无血清培养基中以浮球形式培养 hMADS 的方法。
•
3D 细胞培养系统允许直接铺板细胞。
•
球体形成效率~0.8%，。
•
细胞表达 hMADS 的经典标记，可以扩增数代，并保留其分化能力。
50
图 3.5 接种后 7 天的 hMADS 细胞球形态。
51
S
概括
1. 胚胎干细胞培养
Ø 成功培养鼠类和人类 ES 细胞存在许多共同点。
基本 FGF、头蛋白、激活素 A 和 TGF-β 被定义为 hES 细胞培养所需的关键确定因子。
概括活体生物体的三维特性，为培养细胞的茁壮成长提供了更像体内的环境。
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人类 ES 细胞倾向于以集落形式生长，并且可以通过机械或酶消化来解离。
Ŝ 饲养细胞通常用作 ES 细胞培养的单层细胞。也可以使用合成基质。
▪ 3D 支架为 ES 细胞培养提供了比单层细胞更接近体内的环境。
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2. 造血干细胞培养
Ř Notch 信号级联在 HSC 传播中发挥着重要作用。
ř 在 HSC 中，Notch 通过转录因子 CSL 激活 HES 阻遏物表达，抑制驱动 B 细胞和骨髓细胞终末分化所必需的基因表达。
HSC 与基质细胞共培养可提高 CD34+ 细胞的扩增效率。 ▪ 铜螯合剂可提高 HSC 中 CD34+ 细胞的扩增效率。
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3. 脂肪干细胞培养
Ř ASC 表现出 MSC 固有的许多特征和特性。
ř 可以收获大量 ASC，而不会给患者带来风险。
Ś 已经在外科领域利用 hMADS 进行了许多临床试验，在整形、口腔和心脏手术中取得了可喜的结果。
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K
关键术语
•
小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 饲养细胞——一种用作
支持系统并“喂养”胚胎干细胞，以便
使它们保持多能状态。
•
Matrigel——一种由 EngelbrethHolm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物，由 BD Biosciences 销售。
•
集落——在细胞培养物中生长的干细胞团块。
•
胶原酶——一种分解肽的酶
胶原。
•
Ultra-Web — 一种合成聚酰胺基质，可概括发育中胚胎中发现的基底膜/细胞外基质 3D 地理。
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•
支架——细胞培养的三维基质。
•
Notch 蛋白——跨膜蛋白家族，具有重复的细胞外 EGF 结构域和参与胚胎发生的 Notch（或 DSL）结构域。
•
脂肪干细胞——从脂肪组织中分离出的多能干细胞。
•
脂肪抽吸物——常规和专业整容手术的一次性副产品，也是最广泛使用的 hMADS 来源
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R
检视问题
濄浊濗濸渎濶滢泺濵濸瀇濻濸瀇泺渎渎瀈濸濶瀈濿瀇瀈滢濸濶瀂瀁濷泺瀇泺瀂瀁渎瀂瀃瀇泺瀀泺瀍濸濷濵瀌濚濴泺濿濠濴滢瀇泺瀁濴瀁濷濠濴滢瀇泺瀁泞泻濴瀁渎澿瀊濻泺濶濻濴濿濿瀂瀊濸濷濹瀂滢瀇濻濸渎瀈濶濶濸渎渎濹瀈濿泺渎瀂濿濴瀇泺瀂瀁濴瀁濷瀃滢瀂瀃濴溅濴瀇泺瀂瀁瀂濹濸瀀濵滢瀌瀂瀁泺濶渎瀇濸瀀濶濸濿濿渎浊濅浊濡濴瀀濸濹瀂瀈滢濶滢瀈濶泺濴濿濹濴濶瀇瀂滢渎滢濸瀄瀈泺滢濸濷濹瀂滢濻瀈瀀濴瀁濸瀀濵滢瀌瀂瀁泺濶
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58
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59