Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。1

在單價和二價中檢測到DNA片段

輝瑞/BioNTech 和 Moderna modRNA COVID-19 疫苗

來自加拿大安大略省：探索性劑量反應

與嚴重不良事件的關係。

David J. Speicher1， Jessica Rose2， L. Maria Gutschi3， David Wiseman4，

凱文·麥克南5

1加拿大安大略省圭爾夫市圭爾夫大學病理生物學系

2加拿大安大略省獨立研究員 ORCID 0000-0002-9091-4425

3藥房顧問，加拿大安大略省渥太華

4Synechion， Inc.，美國德克薩斯州達拉斯 ORCID 0000-0002-8367-6158

5Medicinal Genomics，美國馬薩諸塞州貝弗利 ORCID 0000-0002-3908-1122

通訊作者： David J. Speicher 博士

圭爾夫大學

50 Stone Rd E， 圭爾夫， ON， N1G 2W1

speicher@uoguelph.ca

ORCID 0000-0002-1745-3263

關鍵字：COVID-19， 疫苗， DNA污染， 雜質， 殘留DNA， modRNA，

mRNA、不良事件

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。2

抽象

背景：用於生成核苷修飾的體外轉錄 （IVT） 反應

SARS-CoV-2 疫苗的 RNA （modRNA） 目前依賴於 RNA 聚合酶

從DNA樣本轉錄。生產用於原始輝瑞的modRNA

隨機臨床試驗 （RCT） 使用 PCR 生成的DNA範本（過程 1）。自

產生數十億劑疫苗，並將該DNA克隆到細菌質粒載體中

用於線性化前在大腸桿菌中擴增（過程 2），擴大大小

以及潛在殘留DNA的複雜性以及

流程 1 範本。Moderna 似乎使用了類似的基於質粒的工藝

臨床試驗和試驗后使用的疫苗。最近，DNA 測序研究已經

在 Pfizer-BioNTech 和 Moderna 中發現了該質粒 DNA 的顯著水準

modRNA 疫苗。這些研究調查了有限數量的批次，仍然存在問題

關於國際上觀察到的殘留DNA的差異。

方法：使用先前發表的引物和探針序列，定量

聚合酶鏈反應 （qPCR） 和 Qubit螢光測定在

另外 27 個 mRNA 樣品瓶，從加拿大獲得，從 12 個獨特批次（5 個批次

Moderna 兒童/成人單價，1 批 Moderna 成人二價 BA.4/5,1 批 Moderna

兒童/成人二價 BA.1,1 批 Moderna XBB.1.5 一價，3 批輝瑞成人

單價和 1 批輝瑞成人二價 BA.4/5）。疫苗不良事件

查詢 Reporting System （VAERS） 資料庫以獲取

每個測試批次報告的不良事件 （AE）。之前

研究的輝瑞 COVID-19 疫苗小瓶通過牛津納米孔測序進行檢查

確定DNA片段的大小分佈。此示例還用於

確定殘留的 DNA 是否包裝在脂質納米顆粒 （LNP） 中，從而

對 DNaseI 耐葯，或者如果 DNA 位於 LNP 之外並且 DNaseI 不穩定。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。3

結果：質粒起點的定量迴圈 （Cq） 值（1：10 稀釋）

複製 （ORI） 和刺突序列的範圍為 18.44 - 24.87 和 18.03 - 23.83 和

輝瑞，以及 Moderna 分別為 22.52 – 24.53 和 25.24 – 30.10。這些值

對應於 0.28 – 4.27 ng/劑量和 0.22 - 2.43 ng/劑量（輝瑞）和 0.01 -0.34

ng/劑量和 0.25 – 0.78 ng/劑量 （Moderna），ori 和spike 分別通過以下方式測量

qPCR，以及 1,896 – 3,720 ng/劑和 3,270 – 5,100 ng/劑，通過 Qubit 測量

輝瑞和Moderna的螢光測定法，恭敬。SV40 啟動子-增強子-ori 為

僅在 Cq 評分範圍為 16.64 – 22.59 的輝瑞樣品瓶中檢測到。在探索性

分析，我們發現了劑量反應關係的初步證據

每劑DNA和嚴重不良事件 （SAE） 的頻率。這種關係是

輝瑞和莫德納產品不同。尺寸分佈分析發現mean和

最大DNA片段長度分別為214個鹼基對 （bp） 和3.5 kb。這

質粒 DNA 可能位於 LNP 內部，並受到核酸酶的保護。

結論：這些數據表明存在數十億到數千億個

這些疫苗中每劑的DNA分子。使用螢光測定法，所有疫苗都超過

FDA 和 WHO 設定的殘留 DNA 指南為 10 ng/劑量，乘以 188 – 509 倍。

然而，所有疫苗中的 qPCR 殘留 DNA 含量均低於這些指南

強調解釋時方法清晰度和一致性的重要性

定量指南。殘差的劑量反應效應的初步證據

用 qPCR 和 SAE 測量的 DNA 需要確認和進一步調查。我們

研究結果擴展了對疫苗安全性的現有擔憂，並引發了對

在引入高效轉染之前構思的指南的相關性

LNP 的由於存在幾個明顯的限制，我們敦促在法醫下複製我們的工作

條件，並修訂指南以考慮高效的DNA轉染

和累積劑量。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。4

介紹

為了生產大量通用的修飾 RNA （modRNA） 疫苗，輝瑞公司

變更了用於生產材料的製造工藝（過程 1）

隨機臨床試驗 （RCT） 到與已經存在的過程（過程 2）相似的過程

由 Moderna 使用。將 SARS-CoV-2 刺突序列克隆到質粒中

包含活躍於大葉草的細菌複製起點（通常稱為 ori）

大腸桿菌。該質粒（輝瑞和莫德納為 7,824 個鹼基對 （bp） 和 6,777 bp，

）還包含一個氨基糖苷磷酸轉移酶基因 （Neo/Kan），該基因

允許在含有卡那黴素的肉湯中進行經濟高效的細菌複製和加倍

質粒拷貝數在 37C 下每 30 分鐘一次。然後收穫大腸桿菌細胞

和裂解。提取DNA並使用限制性內切酶 Eam1104I 線性化。這

然後線性 DNA 作為 T7 RNA 聚合酶體外轉錄 （IVT） 的範本

在 N1-甲基 - 假尿苷存在下。IVT 后，DNA 被水解，使

它在最終藥品中的普遍性。從 European Medicines 洩露的檔

Agency （EMA） 的 DNA 中引用的 DNA 中被引用的

通過此過程製備的modRNA產物可能會有很大差異。

McKernan 等人對這些疫苗進行了下一代 RNA 測序，並且

出乎意料的是，發現了DNA來源於DNA的證據

製造業。McKernan 等人隨後開發了一種定量聚合酶鏈反應

（qPCR） 方法處理靶向共用序列的引物的DNA污染

在輝瑞和莫德納疫苗中。此外，McKernan等人發現了 SV40

輝瑞疫苗中的啟動子-增強子-ori 和 SV40 polyA 信號序列。自

調查這些發現對其他批次疫苗的普遍性，我們獲得了 24

未開封的過期樣品瓶（8 瓶 Pfizer 和 16 瓶 Moderna）和 3 瓶過期殘留物

已在安大略省、加拿大分發的Moderna XBB.1.5 COVID-19 疫苗和

通過 Qubit螢光測定法和 qPCR 靶向刺突、質粒 ori 和

SV40 啟動子-增強子-原。然後，我們查詢了疫苗不良事件報告

任何不良事件 （AE） 的系統 （VAERS），包括相關的嚴重 AE （SAE）

與這些地段。我們還擴展了早期工作（McKernan 等人）的觀察結果。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。5

通過研究DNA片段的大小分佈以及

疫苗來確定殘留的DNA是否包裝在 LNP 中。

出於本研究的目的，我們使用了術語“殘留DNA”、“DNA品質”（或

類似），而不是“雜質”或“污染”作為這些監管術語的討論

超出了本文的範圍。

方法

測試 COVID-19 疫苗

過期的未開封的 Pfizer-BioNTech BNT162b2 （n=8） 和 Moderna Spikevax 樣品瓶

mRNA-1273 （n=16） 購自加拿大安大略省的多家藥房（圖

1）. 還有三瓶同批次 Moderna XBB.1.5 疫苗的過期殘留物

獲得。總共調查了 27 個 mRNA 樣品瓶中的 12 個批次：5 個批次的 Moderna

兒童/成人單價，1 批 Moderna 成人二價 BA.4/5,1 批 Moderna 兒童/成人

二價 Wuhan-BA.1,1 批 Moderna XBB.1.5 單價，3 批輝瑞成人

單價和 1 批輝瑞成人二價 Wuhan-BA.4/5 疫苗。未開封的

無菌注射瓶前列地爾 66 mcg/mL 與罌粟鹼 21.7mg/mL 聯合使用

酚妥拉明 1 mg/mL （TriMix） 用作陰性對照。未開封的

樣品瓶未被篡改，因為它們具有完整的翻蓋塑膠蓋，印有批號和

有效期。小瓶已儲存在 +2-8C 的專用疫苗裝置中

藥店，並在帶有冷凍凝膠包和

在5小時內放入測試實驗室冰箱中。只有一個Moderna樣品瓶沒有

列印的有效期，但帶有需要藥劑師掃描的二維碼。這

Moderna XBB.1.5 小瓶同樣由藥房儲存。從

冰箱，加熱 ~20 分鐘，由藥劑師給患者給葯

超過 ~30 分鐘。將殘留的小瓶放入冷凍的絕緣容器中

凝膠包裝並在 12 小時內運送到測試實驗室冰箱。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。6

圖 1.來自加拿大安大略省的 COVID-19 疫苗小瓶：（A） 輝瑞/BioNTech

BNT162b2 成人單價和二價;Moderna Spikevax mRNA-1273 （B） 成人

單價 XBB.1.5，（C） 兒童/成人單價，（D） 兒童/成人二價 Wuhan-BA.1

134 和 （E） 兒童/成人二價 Wuhan-BA.1 和成人 Wuhan-bi價 BA.4/5。

Spike、ori 和 SV40 啟動子-增強子-ori DNA 的 qPCR 分析

通過定量 PCR （qPCR） 檢測每個樣品瓶是否存在質粒衍生物

SARS-CoV-2 刺突、ori 和 SV40 啟動子-增強子-ori DNA。刺突和質粒

使用 PCR 引物對 Moderna 共用的序列進行一式兩份的檢測

和 Pfizer 表達質粒（表 1）。單重SV40增強子測定

旨在擴增 Pfizer 載體特有的核靶向序列。簡而言之，

qPCR 分析使用每個樣品瓶中的 1 μL 直接添加到 17.8 μL 預混液中。qPCR 檢測

試劑盒來自 Medicinal Genomics（Part# 420201， Beverly， USA），其中

含有 8.8 μL 反應物的預混液，由 3.8 μL 聚合酶組成，0.8 μL

反應緩衝液和 1.0 μL 引物-探針混合物，以及 12.2 μL ddH0。引物探針

使用 12.5 μL 100 μM ori 探針、12.5 μL 100 μM 加標探針、25 混合

μL 100 μM 加標正向引物，25 μL 100 μM 加標反向引物，25 μL 100

μM ori 正向引物、25 μL 100 μM ori 反向引物和 75 μL ddH0。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。7

Spike 和 ori qPCR 檢測使用合成的 gDNA 對照（gBlock、整合的 DNA

Technologies（IDT，美國聖地牙哥）生成 10 倍序列

稀釋衍生的校準曲線。SV40 增強子 gBlock 初始合成失敗，並且

無法生成標準曲線。

表 1.靶向 spike、ori 和 SV40 啟動子的引物和探針序列。

在 QuantStudio 3（ThermoFisher Scientific，Waltham，USA）上進行迴圈，其中

在 95°C 下初始變性 3 分鐘，然後在 95°C 下迴圈 35 次，持續 10 秒

和 65°C 下 30 秒。使用 QuantStudio 計算 Cq 轉換為 ng/μL

軟體 v2.7.0 （ThermoFisher Scientific）。擴增子品質，用 New

使用英格蘭 BioLabs DNA 計算機和長度（ori 為 105 bp，spike 為 114 bp）

通過調整 DNA 的長度來估計存在的 DNA 總納克 （ng）

質粒（輝瑞為 7,824 bp，Moderna 為 6,777 bp）。每劑拷貝數

根據每次肌肉注射疫苗的體積進行調整（輝瑞和

Moderna 為 500 μL）。對三個 Pfizer 批次進行連續稀釋，結果顯示

殘留DNA濃度最高。研究 LNP 對 PCR 的抑製作用，因為

直接進行 qPCR，無需任何處理或提取。

Qubit螢光定量

AccuGreenHS 螢光試劑（AccuGreen #99820 和 DNA 定量

緩衝液 #99979）和標準品購自 Biotium（美國三藩市）

Qubit分析（ThermoFisher Scientific）。螢光試劑（190 μL 原液製成

來自 995 μL HS 緩衝液和 5 μL 200X AccuGreen 染料）用 10 μL 的

疫苗。將這些樣品加熱至 95°C 反應 8 分鐘，然後加熱至 4°C 反應 5 分鐘，以

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。8

破壞 LNP 並使螢光染料能夠訪問DNA。讀取樣本

按照製造商在Qubit3.0螢光儀上的說明進行操作。Qubit 螢光測定法

和 qPCR 數據進行比較。

疫苗不良事件報告系統 （VAERS） 數據

使用 Language and Environment for Statistical 對 VAERS 資料庫進行分析

R 中的計算包，以及包括 2020 年 12 月 17 日至

2023 年 10 月 6 日 VAERS 數據以三個單獨的逗號提供下載

分隔值 （CSV） 資料檔表示：i） 每個報告的一般數據;ii） 的

報告的 AE 或「癥狀」 以及 iii） 疫苗數據，包括疫苗製造商和批次

數。分配一個 VAERS ID 號是為了在報告時保持機密性

提交。要評估與特定疫苗相關的 AE，有必要將這三者合併

使用 VAERS ID 作為連結變數的數據檔。對於這項研究，由於我們是

對 COVID-19 商品感興趣，僅對 COVID-19 疫苗類型 （COVID19-1） 感興趣

（單價）和 COVID19-2 （二價））。包括其他相關變數

VAERS ID*、疫苗批次 （VAX_LOT）、疫苗製造商 （VAX_MANU）、

住院 （HOSPITAL） 和死亡 （DIED）。數據按疫苗批次和

計算 AE 和 SAE 報告的總數。SAE 報告包括死亡、

住院、急診室就診、殘疾報告、出生缺陷和生活

威脅報告和單個 MedDRA 編碼的 AE（例如每批次的總死亡人數）為

也算了。

VAERS 的各種局限性得到了廣泛認可，例如 FDA 和

包括漏報、誤報、自發報告和無法推斷

因果律。儘管如此，為了探索

殘留DNA含量和SAE中，我們使用SAE報告數量與

AE 總數（“SAE 報告比率”= SRR）作為可能的毒理學指標

影響。我們使用批次報告的AE總數作為

給藥劑量，因為這個分母很難估計。這個原則是用的

由 CDC 在不成比例信號分析 （DSA） 中使用

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。9

比例報告比率 （PRR）Evans 等人設計的PRR是一種有用的

具有已知局限性的藥物警戒工具。

必須注意的是，儘管 VAERS 是一個位於美國的資料庫，但它接受來自

世界各地。向外部製造商報告的某些類別的 AE

美國，必須向 VAERS 資料庫報告。傾向性差異

對製造商或醫療機構實施的漏報和強制報告

美國境內外的專業人士可能會對

SRR。因此，對於我們的探索性劑量反應分析，我們只使用了 VAERS

來自美國以外的數據，以減少這種混淆。此外，我們還注意到

通過下載的 VAERS 版本獲得的數據存在一些差異

數據集，以及使用 VAERS WONDER 基於 Web 的前端介面獲得的數據

（https://wonder.cdc.gov/controller/datarequest/D8）。我們使用下載的版本作為

它比 Web 版本提供了更多的細節。然後將 SRR 與水準作圖

的DNA檢測，以確定殘留DNA水準與

嚴重不良事件的報告頻率。

如果任何批次中有多個樣品瓶，則每個樣品瓶中殘留DNA的平均品質

使用了該批次的劑量。任何給定批次的SRR值僅在1

或在全球範圍內發現了更多的 AE，這表明該批次實際上已經

部署。曲線繪製在對數軸上，並使用

linear函數。

Oxford Nanopore 測序

在使用先前測序的疫苗（輝瑞兒童

mono價 Lot# FL8095），使用

Oxford Nanopore Flongle （R.10.4.1， Oxford Nanopore Technologies （ONT）， 紐約，

USA） 和 Oxford Nanopore Ligation 測序試劑盒 （SQK-LSK114） 根據

製造商的說明。讀取被映射到 NCBI OR134577.1，其中 Burrow-

具有最大精確匹配的 Wheeler Aligner （BWA-MEM）。ONT 測序讀長

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。10

長度是無限的，但DNA分離程式可能會偏倚分子的長度

在 ONT 連接反應中捕獲。對單分子讀數進行計數和分檔

根據它們與 BWA-MEM 的映射讀取長度。

疫苗的核酸酶敏感性

使用相同的小瓶（輝瑞 Lot# FL8095）評估疫苗的 DNasel 敏感性

通過確定DNA污染是否包裝在 LNP 中，從而耐受

DNaseI 或 DNA 位於 LNP 之外並且 DNaseI 不穩定。

通過用 2.5 μL 的

DNaseI-XT（2 單位/μL，NEB#M0570S，New England BioLabs Inc，美國伊普斯威奇），2.5 μL

Grim Reefer 10X 緩衝液 （Medicinal Genomics #420123-125） 並在 37°C 下孵育

30 分鐘。對於對照，使用 2.5 μL ddH0 代替 DNaseI-XT。這

使用 2.5 μL MGC 裂解緩衝液（藥用

基因組學 #420001）。在 DNaseI 化學殺滅步驟之後，qPCR 可擴增的內部

加標對照 DNA 以驗證 DNaseI-XT 是否已完全滅活

（藥物基因組學 #420123-125）。

在 DNaseI 滅活對照中加標后，54 μL SenSATIVAx 磁珠

（藥物基因組學）用於從 DNaseI-XT 測定中純化 DNA，並使用

DNaseI-XT 陰性對照樣品。將磁珠移液管混合 10 次

將樣品與樣品一起，在室溫下孵育 5 分鐘，磁分離

並用 70% v/v 乙醇洗滌兩次。除去乙醇，珠子乾燥

在室溫下放置 2 分鐘。用 30 μL ddH0 和 1 μL 的

通過 qPCR 檢測 18.8 μL 反應中洗脫液的加標和 ori。額外的

將 DNaseI 滅活對照引物和探針（0.5 μL CY5 中）加入到檢測中，用於

總共 19.3 μL 反應。

結果

使用 8 對數級連續稀釋標準曲線校準樣品 Cq 值，並使用

為刺突和 ori 擴增子生成的 R 值分別為 0.998 和 0.999。聚合酶鏈反應

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。11

Spike 和 Ori 的效率分別為 99.8% 和 94.7%（圖 2）。在所有盤子上，

陰性對照和無範本 （ddH0） 對照 （NTC） 一式三份和

發現為陰性。

圖 2.稀釋 10 倍的 Spike （紅色） 和 ori （藍色） 校準曲線，通過

qPCR。

對於單個樣品瓶，在類似時間擴增的 Pfizer 上的 qPCR 針對 spike、ori 和 SV40

增強子 - 啟動子 - ori （Cq 1.48 ± 0.32）（圖 3）。除了輝瑞批次：FX4343 外，

輝瑞的樣品瓶間差異較小（加標 Cq 16.91 ± 0.52;原 Cq 16.91 ± 1.07;

SV40 啟動子-增強子-ori Cq 15.46 ± 2.02）和 Moderna（加標 Cq 20.35 ± 0.65;原

Cq 25.34 ± 1.47）（值基於未稀釋的小瓶內容物）（表 2，圖 4）

但是，對於除批次 AS0467D 之外的所有Moderna樣品瓶，ori始終擴增 Cq 5-6

晚於斯派克。在所有輝瑞小瓶中均檢測到 SV40 啟動子-增強子-ori，但在

沒有 Moderna 樣品瓶。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。12

圖 3.刺突（紅色）、ori（藍色）和 SV40 增強子啟動子的擴增曲線

ori（綠色）在單瓶輝瑞（批號：Fx4343a）中，來自同一兩個不同的孔

286 PCR 運行。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。13

圖 4.所有 Pfizer （A） 和 Moderna （B） 樣品瓶的擴增曲線顯示加標（紅色）

和 ori（藍色）對輝瑞的單個小瓶進行類似的擴增。在Moderna中，樣品瓶間

290 變異性是一致的，但加標比 ori （Cq~6） 更早擴增。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。14

表 2.疫苗瓶的詳細資訊、確定的不良事件 （AE） 以及 SARS-CoV-2 刺突的 qPCR 檢測結果，ori，

以及所有測試的 Pfizer-BioNTech 和 Moderna 樣品瓶上的 SV40 啟動子-增強子-ori。Pfizer 和 Moderna 的計算

分別基於 0.30 mL 和 0.50 mL 的成人劑量。Moderna 也適用於

6-12 歲，劑量 0.25 mL，使所得總 ng/劑量為成人劑量的一半。總 ng/劑量

針對擴增子的長度（105 bp ORI、114 bp 加標）進行調整，僅代表 7,824 bp 輝瑞和

296 6,777 bp Moderna 質粒。

疫苗資訊 VAERS 數據 Spike Ori SV40

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Total

Copies/dose Cq

輝瑞-BioNTech 成人單價 FM7380 02/2022 29 15 18.03 2.43 2.07E+10 18.57 3.92 1.86E+11 17.19 輝瑞-BioNTech 成人一價 FN7934a 08 /2022 42 21 18.47 1.79 1.53E+10 18.19 18.19 77 3.43 1.62E+11 16.64 輝瑞-BioNTech 成人一價 FN7934b 02/2022 18.19 2.18 1.86E+10 18.44 4.27 3.96E+10 16.96 輝瑞-BioNTech 成人一價 FX4343a 08/2022 1 0 23.53 0.27 2.30E+09 24.71 0.32 2.94E+09 20.64 輝瑞-BioNTech 成人一價 FX4343b 07/2022 23.83 0.22 1.86E+09 24.87 0.28 2.64E+0922.59 輝瑞-BioNTech 成人二價 GK0932a 09/2022 3 0 20.46 2.25 1.92E+10 21.01 3.81 3.54E+10 18.53 輝瑞-BioNTech 成人二價 GK0932b 09/2022 20.53 20.09 60 2.05 1.75E+10 21.22 3.32 3.08E+10 18.91 輝瑞-BioNTech 成人二價 GK0932c 09/2022 20.66 1.97 1.68E+10 21.21 3.33 3.09E+10 18.6 Moderna 兒童/成人 一價 020E21A 無說明 5 1 23.66 0.35 3.02E+09 29.47 0.02 1.87E+08 負 Moderna 兒童/成人 一價 020J21A 30/032022 7 5 23.21 0.48 4.12E+0930.10 0.01 1.23E+08 負 Moderna 兒童/成人 單價 033M21Aa 22/06/2022 2 1 23.04 0.54 4.65E+09 29.46 0.02 1.88E+08 負 Moderna 兒童/成人 單價 033M21Ab 30/07/2022 22. 81 0.64 5.44E+09 29.38 0.02 1.99E+08 負 莫德納 兒童/成人 單價 033M21Ac 30/03/2022 23.59 0.37 3.18E+09 29.87 0.02 1.43E+08 負 莫德納 兒童/成人 單價 033M21Ad 30/07/2022 23.26 0.47 3.98E+09 29.39 0.02 1.97E+08 負 莫德納 兒童/成人 單價 055K21A 30/07/2022 222.94 0.58 4.98E+09 29.58 0.02 1.74E+08 負 Moderna 兒童/成人 單價 062H21Aa 30/07/2022 9 3 22.52 0.78 6.69E+09 29.21 0.02 2.23E+08 負 Moderna 兒童/成人 單價 062H21Ab 28/05/2022 22.76 0.66 5.64E+09 29.37 0.02 2.00E+08 負 Moderna 成人二價 BA.4/5 AT0709Ba 30/07/2023 0 0 23.68 0.35 2.99E+09 29.30 0.02 2.09E+08 負數 Moderna 成人二價 BA.4/5 AT0709Bb 30/07/2023 23.56 0.38 3.24E+09 29.25 0.02 2.16E+08 負片 Moderna 成蟲 二價 BA.4/5 AT0709Bc 30/07/2023 23.63 0.36 3.09E+09 29.09 29. 34 0.02 2.04E+08 負莫德納成人二價 BA.4/5 AT0709Bd 30/07/2023 23.80 0.32 2.74E+09 29.44 0.02 1.91E+08 負莫德納 兒童/成人二價 BA.1 AS0467Da 02/04/2023 0 0 0 23.20 0.49 4.17E+09 25.24 0.34 3.20E+09 負性 莫德納 兒童/成人二價 BA.1 AS0467Db 02/04/2023 24.16 0.25 2.14E+09 26.08 0.20 1.82E+09 負性兒童/成人 二價 BA.1 AS0467Dc 02/04/2023 23.75 0.33 2.0 85E+09 25.74 0.25 2.28E+09 負 Moderna 成人單價 XBB.1.5 020G23Aa 29/04/2024 0 0 0 24.42 0.73 6.26E+09 29.42 0.03 3.18E+08 負 Moderna 成人 一價 XBB.1.5 020G23Ab 29/04/2024 24.46 0.71 6.11E+09 29.87 0.03 2.33E+08 負 Moderna 成人單價 XBB.1.5 020G23Ac 29/04/2024 24.53 0.68 5.84E+09 29.74 0.03 2.55E+08 負

*批號末尾的小寫字母表示同一批次的不同樣品瓶。SV40 啟動子-增強子-ori

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。15

Moderna 和 3 個 Pfizer 批次中的 DNA 含量均未超過 1 ng/劑

刺突或質粒 ori.將這三個小瓶中的疫苗連續稀釋 10 倍以進行評估

qPCR 中的 LNP 抑制（圖 5）。我們觀察到預期的 ~3.3 Cq 回應

1：10 稀釋度（1：10、1：100、1：1000）表明存在一些 LNP 抑製作用

可能會影響這些稀釋度的DNA定量（圖 6）。因此，數據

從 1：10 稀釋液中用於進一步分析。這種稀釋，以及事實

一些劑量被設計為在使用前稀釋，在我們的

計算。

圖 5.加標（紅色）和 ori（藍色）的殘留DNA含量與總DNA含量的比較

向 VAERS 報告的不良事件數量（橙色）。FDA 和 WHO 監管

殘留DNA的指導值為10 ng/劑量，用紅色虛線表示。樣品瓶是

按質粒 ori 的 DNA 載量降序排序。末尾的小寫字母

批號表示同一批次的不同樣品瓶。AE 總數

每批次測定 312 個樣品瓶，並針對同一批次中的每個樣品瓶進行重現。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。16

圖 6.來自三個批次的連續稀釋液（10 倍）的 qPCR 擴增曲線

315 個包含最高 DNA 載樣量（輝瑞批次：A，FN7934a;B，FN7934b;C， FM7380）。

批次間殘留 DNA 的量差異很大（0.28 - 4.27 ng/劑

輝瑞 ori，輝瑞加標 0.22 - 2.43 ng/劑，Moderna ori 0.01 - 0.34 ng/劑，0.25-

Moderna spike 為 0.78 ng/劑）。基於螢光計

疫苗的測量（例如 Qubit）顯示 2,567 ± 618 ng/劑（範圍：1,896

輝瑞為 3,720 ng/劑），輝瑞為 4,280 ± 593 ng/劑（範圍：3,270 至 5,100 ng/劑）

對於Moderna，表明高比例的DNA低於qPCR的大小範圍

擴增子。

我們將Qubit螢光測定法獲得的殘留DNA值與獲得的殘留DNA值作圖

通過 qPCR（圖 7）。對於 Pfizer 產品，ori 和 spike 估計值的趨勢線

兩者都有一個正斜率。Moderna 產品的圖表與

輝瑞產品在任一軸上的值幾乎沒有重疊，斜率要淺得多。

儘管 Moderna 圖的詳細視圖表明 ori 的斜率為負

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。17

值，則此趨勢線可能會受到三個異常值的影響。這些值是

從 Moderna BA.1-Wuhan 二價疫苗的小瓶中獲得。

圖 7.加標（紅色）和 ori 的殘留 DNA 濃度的圖形比較

（藍色）通過 qPCR 測定，單個樣品瓶中的總殘留 DNA 濃度為

由 Qubit 確定。在圖 A 中，輝瑞和 Moderna 數據都繪製在同一塊土地上

規模。Moderna 數據包含在一個紅色框中，並帶有

338 在面板 B 中放大比例，以顯示細節。

除了Moderna批次 AS0709D、AS0467D和020G23A外，還發現了 VAERS 報告

對於本研究中檢查的所有批次（圖 5）。在檢查的 12 件拍品中，具有

全球向 VAERS 提交的報告數量最多的是 FM7380 和 FN7934，其中

分別為29份和42份報告。在批次 FM7380 的情況下，報告了 15 人 （52%）

SAE，而對於批次 FN7934,1 人死亡，2 人報告殘疾，

18 例報告因 21 例 （50%） SAE 住院。有 9、7、5、3、2 和 2

為批次 062H21A、020J21A、020E21A、GK0932、033M21A 和 055K21A 提交的報告，

分別。在這些批次中，5/7 （71%） 涉及Moderna批次020J21A報告

住院治療，Moderna 批次 1E20A 有 5/21 的死亡報告。總計

全球有 100 份針對這些批次向 VAERS 提交的 AE 報告;其中 48 個 （48%）

是SAE。這些 AE （n=92） 和 SAE （n=44） 報告中的大多數來自外部

美國的比例相似。在這 92 個 AE 中，70 個 （76%） 可被確定為

源自加拿大，另有 5 名 （5.4%） 無法確定來源。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。18

在探索性分析中，我們通過繪製構建了劑量 - 反應曲線（圖 8）

輝瑞公司發現的刺突（紅色）和質粒原點（藍色）的DNA品質（上圖）和

Moderna（下圖）樣品瓶與 SAE 報告比率 （SRR） 的對比。ori 和 spike

輝瑞產品的曲線彼此相似，並顯示陽性劑量反應

關係。Moderna 地塊的相應曲線向左移動 1

達到兩個數量級。但是，ori 和 spike 曲線在位置和

坡。

圖 8.比較殘留濃度的探索性劑量反應分析

通過 qPCR 測量輝瑞 （A） 中發現的刺突（紅色）和質粒原點（藍色）的 DNA，以及

根據 SRR 繪製的 Moderna （B） 批次（SAE 報告/所有不利批次的總數）

事件報告給 VAERS）。殘餘

每劑量的DNA質量繪製在對數刻度上。1：10 稀釋液的數據為

使用過 367 個。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。19

使用螢光法估計的殘留DNA的相應圖（圖 9）得到

Pfizer 和 Moderna 產品的曲線均具有負斜率。

圖 9.比較殘留濃度的探索性劑量反應分析

通過 Qubit 螢光法測量輝瑞（藍色）和 Moderna（紅色）疫苗批次的 DNA

根據 SRR（SAE 報告/報告的所有不良事件的總數）繪製

到 VAERS）。繪製每劑量的殘留DNA品質

對數刻度為 376。

McKernan 等人描述的輝瑞兒童單價葯（批次 FL8095）是

使用 Oxford Nanopore （ONT） 測序以評估

將讀數映射到 NCBI 中質粒的參考序列（圖 8）。這

在 865 個讀數中檢測到的最長讀數為 3.5 kb，讀數映射到大多數質粒

骨幹（圖 9）。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。20

圖 10.Oxford Nanopore （ONT） 讀長分佈從 866 個讀數映射到

385 載體序列 （NCBI OR134577.1）。平均值 = 214 bp。最大值 = 3.5 kb。

圖 11.最長牛津納米孔 （ONT） 讀長與所示的載體區域對齊

藍。Ori 和 Spike 引物位置在最內層的圓圈上進行註釋。開放閱讀

框架 （ORF） 以金色和綠色箭頭進行註釋。卡那黴素耐葯基因

在疫苗的非常淺的測序調查中檢測到 390 例。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。21

使用 DNaseI-XT 評估輝瑞疫苗的核酸酶敏感性。這個DNA

核酸酶針對富含 RNA：DNA 雜交體的 IVT 反應進行了優化。這種處理表明

當加標到 LNP 中的 DNA 對照時，<1 Cq 偏移量從 15 的 Cq 降低

到無法檢測到。這表明

疫苗通過封裝在 LNP 中受到保護（圖 10、圖 11）。

圖 12.輝瑞疫苗的 DNase I-XT 處理顯示核酸酶耐葯

疫苗中的 398 個 DNA。

圖 13.DNaseI-XT 陽性對照表明消化測定消除了所有

在用於評估疫苗核酸酶的相同條件下在DNA中加標

402 靈敏度。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。22

討論

在調查的所有 27 個疫苗瓶中均檢測到殘留 DNA。來自同一樣品瓶的多個樣品瓶

批次對所有靶標產生了非常相似的上樣量，顯示出分析的可靠性、重現性、

以及批次內的一致性。這些數據涉及在加拿大分銷的疫苗瓶

與modRNA中DNA污染的幾項非同行評審報告一致

疫苗 （McKernan， Buckhaults， Konig）.

通過 qPCR 檢測，Moderna 的 DNA 濃度最低，但

量子比特。Moderna 樣品瓶之間的DNA水準最一致

建議採用更穩健和標準化的製造流程。在每瓶

Moderna 產品，除批次 AS0467D 外，ori 顯示的載荷低於尖峰

表明可以更有效地去除載體DNA。可能，同源修飾

RNA 可能會阻止雜交消化範本 DNA。

DNA 濃度最高的樣品瓶來自兩批 Pfizer 一價樣品

採用磷酸鹽緩沖鹽水 （PBS） 配方的紫色頂部樣品瓶，需要稀釋

在給葯前。2021 年 10 月 29 日，美國 FDA 授權將

配製成 Tris/蔗糖緩衝液;灰色頂單價成人疫苗和

適用於 6-11 歲兒童的橙色疫苗，此更改是為了增加

穩定性，以簡化儲存要求並提供即用型配方。

這些紫色頂部的輝瑞批次也與最高數量的AE相關

在所有測試批次中，VAERS 中報告的SAE s。作為實際劑量數

每個批次的給葯是未知的，我們使用 AE 的總數作為

作為要估計的SAE數量的分母的給藥劑量

毒理學/藥理作用。這使用了 CDC在其

不成比例信號分析 （DSA）。

我們對殘留DNA含量與SAE之間關係的探索性分析

向 VAERS 報告的報告是初步的，樣本量有限，但需要確認

通過檢查更多的批次和樣品瓶。正劑量-反應關係是

根據殘留DNA的qPCR估計對 Pfizer 批次進行觀察。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。23

在Moderna批次中觀察到 qPCR 數據和圖的不同關係

基於螢光法估計的 Pfizer 和 Moderna 批次的殘留 DNA。

這些觀察結果可能反映了兩種商品之間的差異，例如數量

DNA 的 DNA 片段的大小分佈，DNA 片段的組成和序列

脂質納米顆粒的質粒載體和組成。其他差異

這兩種產品以及每種產品的不同批次之間也可能有助於我們的

觀察。這些差異包括污染物水平的變化或

雜質。雜質的一個主要來源是片段化的 mRNA，其中許多

已經提出了毒理學機制，例如它對miRNA的影響

processes.dsRNA 是繼發於 T7 RNA 的另一種雜質

聚合酶啟動子。dsRNA 可以誘導促炎細胞因數，並且已被

假設會導致免疫炎症反應，例如心肌炎。

來自內毒素的細胞中的脂多糖可以結合 S1 和 S2 亞基

刺突蛋白，這可能導致增強的炎症反應。

更廣泛的抽樣可能會揭示事件類型（例如死亡）的更多細節，例如

以及與其他工作的比較，例如 Schmeling 等人報導的

報告了 AE 與各種疫苗批號的相關性。目前沒有

研究的疫苗批次被納入 Schmeling 研究，需要更多的工作來

瞭解這種DNA污染是否以及如何與AE相關。

雖然 SV40 增強子促進了細胞核定位，但 DNA 的基因組整合

COVID-19 modRNA 產品的片段尚未得到證明。然而

眾所周知，DNA 污染可能會觸發不必要的先天免疫

反應，並且可能是促血栓形成的，特別是對於具有高 GC 含量的片段。

dsDNA 也可能是包括中風在內的缺血性疾病的重要因素。而

高DNA污染與SAE之間似乎存在相關性

需要研究以擴大樣本量並闡明任何潛在的機制

在工作中。

Speicher DJ 等人，在加拿大的 COVID-19 疫苗中檢測到的 DNA 片段。24

需要強調的是，因為 qPCR 不能定量更小的分子

）的大小 （105-114 bp），qPCR 低估了每個擴增子中的總 DNA

疫苗。這解釋了我們在殘留DNA水準方面觀察到的巨大差異

通過 qPCR 與 Qubit 螢光法進行比較估計，特別是在輝瑞和

Moderna 產品。為Moderna產品獲得的值要大得多，這表明

小片段化殘留DNA的比例高於 Pfizer

產品。這與更徹底的核酸酶消化步驟一致。這說明瞭

FDA 推薦的DNA污染指南高度依賴於

用於定量DNA的方法。解釋高

螢光測量是DNA嗜螢光法的未知特異性

與含有高濃度 N1-methyl- 的樣品一起使用時的染料

假尿苷 modRNA。

這種螢光法評估與螢光法和紫外法一樣特別有趣

分光光度法用於定量輝瑞 COVID-19 疫苗中的 RNA，因為

在 EMA 檔中描述，而 qPCR 用於定量 DNA。這種選擇性的

使用不同的方法定量 RNA/DNA 比率會導致截然不同的結果

瞭解 EMA 實施的比率度量指南。

與 qPCR 定量相比，這種升高的螢光定量與

ONT 讀長分佈也表明DNA的一部分可能更小

比擴增子大小。而 ONT 測序儀可檢測短於 100 的分子

bp，ONT 文庫構建方法使用 0.7X Ampure DNA 純化