06/28 17:30 LDH5与LDHA区别?

LDH5和LDHA是同一个蛋白吗，如果我要买纯化蛋白做体外酶活实验，步骤参考这个Biochemical Assays. LDHA Biochemical Assay. Briefly, 3 μL of human lactate dehydrogenase 5 (no. A38558H, Meridian Life Science, Inc., Memphis, TN) in LDH assay buffer (200 mM Tris HCl, pH 7.4, 100 μM EDTA, and 0.01% Tween-20) was added to a black solid bottom 1536-well assay plate (Greiner Bio-One) using a BioRAPTR FRD dispenser (Beckman Coulter, Brea, CA). A 1536-well pintool dispenser outfitted with 20 nL pins (Wako Automation, San Diego, CA) was used to transfer 23 nL of DMSO-solubilized compound (both library and vehicle controls) to each 1536-well assay plate. Following compound transfer, 1 μL of substrate solution containing NADH and sodium pyruvate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in LDH assay buffer was dispensed via BioRAPTR FRD to initiate the reaction. Final concentrations in the 4 μL reaction volume were 2 nM LDHA enzyme, 0.06 mM NADH, and 0.2 mM sodium pyruvate. Following a 5 min incubation period at room temperature, 1 μL of detection reagent (C. kluyveri diaphorase (Sigma-Aldrich) and resazurin sodium salt (Sigma-Aldrich) in LDH assay buffer) was added to a total volume of 5 μL. Final concentrations of detection reagents were 0.133 mg/mL diaphorase and 37 μM resazurin. Plates were immediately transferred to a ViewLux microplate imager (PerkinElmer, Waltham, MA), and any resulting resorufin fluorescence was measured (ex 540 nm, em 590 nm) at 0 and 20 min. Fluorescence was normalized using enzyme-free and DMSO-treated control wells on each plate. LDHB Biochemical Assay. Human lactate dehydrogenase 1 (no. A38155H, Meridian Life Science, Inc., Memphis, TN) was assayed as described above for LDHA. Final concentrations in the 4 μL reaction volume were 2 nM LDHB enzyme, 130 μM NADH, and 160 μM sodium pyruvate.我需要购买哪些试剂以及如何设计实验？以下是我查到的销售的LDHA的蛋白LDHA 英文全称lactate dehydrogenase A 乳酸脱氢酶 A 别称lactate dehydrogenase A, LDH A, LDH M, LDH muscle subunit, LDH1, LDHA, PIG19 乳酸脱氢酶 A、LDH A、LDH M、LDH 肌肉亚基、LDH1、LDHA、PIG19 中文名称乳酸脱氢酶A Uniprot 优尼普罗特P00338 GeneID 基因 ID3939 交叉反应(推测)Human Mouse Rat (Bovine Pig Rabbit Chicken Monkey Gorilla) 人鼠鼠（牛猪兔鸡猴大猩猩）氨基酸大小37kDa 37 千分表达氨基酸1-332aa Background 背景The protein encoded by this gene catalyzes the conversion of L-lactate and NAD to pyruvate and NADH in the final step of anaerobic glycolysis.The protein is found predominantly in muscle tissue and belongs to the lactate dehydrogenase family.Mutations in this gene have been linked to exertional myoglobinuria.Multiple transcript variants encoding different isoforms have been found for this gene.The human genome contains several non-transcribed pseudogenes of this gene 该基因编码的蛋白质在厌氧糖酵解的最后一步催化 L-乳酸和 NAD 转化为丙酮酸和 NADH。该蛋白质主要存在于肌肉组织中，属于乳酸脱氢酶家族。该基因的突变与劳力性肌红蛋白尿有关。已发现该基因编码不同亚型的多个转录变体。人类基因组包含该基因的几个非转录假基因 Application 应用Immunology research 免疫学研究 Derived from 来自E.coli 大肠杆菌 Purification 纯化NI-NTA affinity purification NI-NTA 亲和纯化 Formulation 配方Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution of Urea, Tris-HCl, PH8.0. 从 0.2 μm 过滤的尿素、Tris-HCl、PH8.0 溶液中冻干。 Shipping 航运The product is shipped at -20°C temperature. Upon receipt, store it immediately at the temperature listed below. 该产品在 -20°C 温度下运输。收到后，请立即将其储存在下列温度下。 Storage 存储Reconstituted protein solution can be stored at 4-7°C for 1-2 months, stable at < -20°C for 2-3 years. 复溶蛋白溶液可在 4-7°C 下储存 1-2 个月，在 <-20°C 下稳定保存 2-3 年。 Reconstitution 重构Reconstituted protein solution can be diluted with distilled PBS. Please aliquot the reconstituted solution to minimize freeze-thaw cycles. 复溶的蛋白质溶液可以用蒸馏的 PBS 稀释。请将复溶溶液分装，以尽量减少冻融循环。 Purity 纯度Purity≥85% as determined by reducing SDS-PAGE. 纯度≥85% 通过降低 SDS-PAGE 测定。 Bioactive 生物活性Not tested. 未测试。 Tag information 标签信息With a 6His tag at the N-terminus. 在 N 端带有 6His 标签。单位支规格10ug50ug100ug1mg 10ug50ug100ug1 毫克。我想知道LDH5和LDHA这个是否是一个

好的，我们来详细分析一下您的问题。这是一个非常典型的酶学实验设计问题，涉及到对蛋白质同工酶的理解、实验方案的解读和试剂的选择。

核心问题一：LDH5和LDHA是同一个蛋白吗？

简明答案：是的，在您这个实验的语境下，LDH5 和 LDHA 指的是同一个功能实体。

详细解释：

乳酸脱氢酶 (Lactate Dehydrogenase, LDH) 是一种同工酶，这意味着它有多种结构不同但功能相似的形式。LDH 是一个四聚体蛋白，由两种不同亚基（subunit）通过不同组合构成：

M-亚基 (Muscle type)：由 LDHA 基因编码。
H-亚基 (Heart type)：由 LDHB 基因编码。

这两种亚基可以组合成五种不同的同工酶，分别称为 LDH1 到 LDH5：

LDH1 (H₄)：由四个 H-亚基组成 (B₄)，主要存在于心肌。您引用的实验方案中也提到，LDH1 (no. A38155H) 被用于 LDHB 的生化分析。
LDH2 (H₃M₁)：由三个 H-亚基和一个 M-亚基组成。
LDH3 (H₂M₂)：由两个 H-亚基和两个 M-亚基组成。
LDH4 (H₁M₃)：由一个 H-亚基和三个 M-亚基组成。
LDH5 (M₄)：由四个 M-亚基组成 (A₄)，主要存在于骨骼肌和肝脏中。

因此，LDH5 是完全由 LDHA 基因编码的 M-亚基组成的同源四聚体。当您购买通过基因工程方法（如大肠杆菌表达）生产的、仅由 LDHA 基因表达的重组蛋白时，这个蛋白在体外会自组装成 LDH5 (M₄) 同工酶。

您提供的实验方案中，先提到使用 "human lactate dehydrogenase 5"，之后又写到 " concentrations ... were 2 nM LDHA enzyme"，这证实了在生物化学研究中，这两种说法经常被用来指代由 LDHA 亚基构成的同工酶。

核心问题二：关于您查到的LDHA蛋白的适用性分析

在购买用于酶活性实验的蛋白时，有几个关键点需要特别注意。让我们来分析您提供的蛋白信息：

名称与来源：lactate dehydrogenase A，来自 E.coli，N端带 6His 标签。这都是标准的重组蛋白信息。
纯化方式：NI-NTA affinity purification。这是针对 His 标签的标准纯化方法。
纯度：Purity≥85%。对于敏感的酶活实验，85% 的纯度可能偏低，杂蛋白可能会干扰实验结果。通常建议使用纯度 >90% 或 >95% 的蛋白。
配方 (Formulation)：Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution of Urea, Tris-HCl, PH8.0.
- 这是一个巨大的警示信号！ 尿素 (Urea) 是一种强变性剂，通常用于溶解在大肠杆菌中表达时形成的包涵体（insoluble inclusion bodies）。这意味着该蛋白在纯化时很可能是变性状态。
复溶 (Reconstitution)：说明中只提到用 PBS 稀释，没有提及任何蛋白质复性 (refolding) 的步骤。变性的蛋白质是没有生物活性的。
生物活性 (Bioactive)：Not tested.
- 这是最关键的警示！ 供应商明确表示没有测试过该蛋白的生物活性。结合上一条（在尿素中），几乎可以肯定您直接购买并复溶后，该蛋白将没有或只有极低的酶活性。

结论：您查到的这个特定产品【不适合】用于您的体外酶活实验。 您需要寻找明确标注**“活性蛋白 (Active Protein)”、“保证酶活性 (Activity Assayed)”** 或 “天然构象 (Native Conformation)” 的 LDHA 蛋白，并且其配方中不应含有尿素等强变性剂。

核心问题三：如何设计实验及购买试剂？

我们将您提供的 HTS (高通量筛选) 方案调整为一个适合常规实验室（例如使用96孔板）的方案。核心是保持试剂的最终浓度不变。

实验原理

这是一个偶联酶法荧光检测实验。

反应一 (LDHA 催化)：LDHA 消耗 NADH 将丙酮酸转化为乳酸。
$\text{丙酮酸} + \text{NADH} + \text{H}^+ \xrightarrow{\text{LDHA}} \text{L-乳酸} + \text{NAD}^+$
如果您加入的化合物是 LDHA 的抑制剂，那么 NADH 的消耗速率会减慢。
反应二 (荧光检测)：反应结束后，加入过量的 diaphorase（心肌黄酶）和 resazurin（刃天青，非荧光性，蓝色）。Diaphorase 利用剩余的 NADH 将刃天青还原为强荧光物质 resorufin（试卤灵，粉红色）。
$\text{刃天青 (Resazurin)} + \text{NADH} \xrightarrow{\text{Diaphorase}} \text{试卤灵 (Resorufin)} + \text{NAD}^+$
- 信号解读：剩余的 NADH 越多（即 LDHA 活性越低），产生的荧光信号就越强。因此，一个有效的抑制剂会导致荧光值升高。

所需试剂清单 (Reagent List)

酶 (Enzyme):
- 重组人 LDHA/LDH5 活性蛋白: 寻找高纯度 (e.g., >95%)、经过活性验证的供应商。例如 Sigma-Aldrich, R&D Systems, Abcam, 或您引用的 Meridian Life Science (Cat. No. A38558H) 等。确保其不含尿素。
缓冲液组分 (Buffer Components):
- Tris-HCl: 用于配制 pH 7.4 的缓冲液。
- EDTA: 乙二胺四乙酸。
- Tween-20: 一种非离子表面活性剂，防止蛋白质吸附在管壁或孔板上。
- 超纯水 (Ultrapure Water)。
底物 (Substrates):
- 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate): 高纯度。
- NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form): 注意避光、低温保存，在缓冲液中不稳定，建议现用现配。
检测系统 (Detection System):
- 刃天青钠盐 (Resazurin sodium salt): 荧光探针。
- Diaphorase (来自 C. kluyveri 或其他来源): 偶联酶。
其他试剂 (Other Reagents):
- DMSO (Dimethyl sulfoxide): 用于溶解您的测试化合物（潜在抑制剂）。
- 待测化合物 (Test Compounds)。
实验耗材 (Labware):
- 黑色不透明底96孔板 (Black solid bottom 96-well plates): 用于荧光检测，避免孔间信号干扰和背景荧光。
- 移液器和吸头 (Pipettes and tips)。
- 支持荧光检测的酶标仪 (Plate reader): 激发波长 (Ex) ≈ 540 nm, 发射波长 (Em) ≈ 590 nm。

实验步骤 (建议方案，以100 µL总反应体积为例)

第一步：溶液配制

LDH 分析缓冲液 (Assay Buffer):
- 200 mM Tris-HCl, pH 7.4
- 100 µM EDTA
- 0.01% Tween-20
- 所有后续溶液均用此缓冲液配制。
LDHA 酶工作液:
- 最终浓度为 2 nM。假设您分步加入，例如先加 50 µL 酶溶液，那么应配制成 2倍浓度的 4 nM LDHA 溶液。
- 注意：蛋白浓度需要根据供应商提供的信息精确计算。分子量约为 37 kDa (单体)，但活性形式是四聚体 (148 kDa)，实验方案中的 2 nM 指的是四聚体的浓度。
底物混合液 (Substrate Mix):
- 最终浓度为 0.06 mM NADH 和 0.2 mM 丙酮酸。
- 假设您加入 25 µL 底物液，那么应配制成 4倍浓度的溶液：0.24 mM NADH 和 0.8 mM 丙酮酸。
- NADH 溶液需新鲜配制，避光。
检测混合液 (Detection Mix):
- 最终浓度为 0.133 mg/mL diaphorase 和 37 µM 刃天青。
- 假设您最后加入 20 µL (使总体积从 80 µL 变为 100 µL)，那么应配制成 5倍浓度的溶液：0.665 mg/mL diaphorase 和 185 µM 刃天青。
化合物溶液:
- 将您的待测化合物用 DMSO 溶解成高浓度储备液 (如 10 mM)。再用分析缓冲液或 DMSO 稀释到所需的工作浓度。

第二步：实验操作 (在96孔板中)

设置对照组:
- 100% 活性对照 (阳性对照): 含酶，但不含抑制剂，只加等量 DMSO。
- 0% 活性对照 (阴性对照): 不含酶，用分析缓冲液代替。
- 测试组: 含酶和不同浓度的待测化合物。
加样顺序:
a. 向孔中加入 50 µL 的 分析缓冲液 (用于阴性对照) 或 4 nM LDHA 酶工作液 (用于阳性对照和测试组)。
b. 向孔中加入 1 µL 的 DMSO (用于对照组) 或不同浓度的化合物/抑制剂 (溶于DMSO)。
c. 轻轻混匀，室温孵育 5-10 分钟 (此为预孵育，让抑制剂与酶结合)。
d. 启动反应: 向所有孔中加入 25 µL 的 底物混合液 (NADH + 丙酮酸)。总体积现在约 76 µL。
e. 立即轻轻混匀，室温孵育 5 分钟 (这是 LDHA 反应时间)。
f. 停止反应并开始检测: 向所有孔中加入 24 µL 的 检测混合液 (Diaphorase + Resazurin)。总体积现在为 100 µL。
g. 立即在酶标仪上读取荧光值 (Ex/Em = 540/590 nm)，此为 0 分钟 读数。
h. 继续在室温下避光孵育 20 分钟，然后再次读取荧光值，此为 20 分钟 读数。反应的净增量 ( $\text{Fluorescence}_{20\text{min}} - \text{Fluorescence}_{0\text{min}}$ ) 是主要观察指标。

第三步：数据分析

首先，用每个孔的读数减去背景（阴性对照孔的读数）。
计算抑制率 (Percent Inhibition):
$\text{抑制率} (\%) = \left( 1 - \frac{\text{信号}_{\text{测试组}} - \text{信号}_{\text{阴性对照}}}{\text{信号}_{\text{阳性对照}} - \text{信号}_{\text{阴性对照}}} \right) \times 100\%$
- 请注意，在这个荧光增强的检测方法中，抑制剂使信号变强。因此，我们通常计算剩余活性百分比：
  $\text{剩余活性} (\%) = \frac{\text{信号}_{\text{测试组}} - \text{信号}_{\text{阴性对照}}}{\text{信号}_{\text{阳性对照}} - \text{信号}_{\text{阴性对照}}} \times 100\%$
- 如果您的信号与抑制成正比（荧光增强），那么计算抑制率的公式需要调整，或者直接使用荧光值来表示活性。一个更直观的计算方法是：
  $\text{酶活性 (荧光增加率)} = \frac{\text{信号}_{t=20} - \text{信号}_{t=0}}{\text{时间 (20 min)}}$
  然后用各组的活性进行比较。
使用作图软件（如 GraphPad Prism），将剩余活性百分比对化合物浓度 (log scale) 作图，通过非线性回归拟合得到 IC₅₀ 值。

希望这个详细的指南能帮助您顺利开展实验！首要任务是采购到合适的、有活性的 LDHA 蛋白。

我现在做实验发现我的化合物可以结合LDHAL6B这个蛋白，然后它的结构和LDHA几乎一模一样，同时我进行了MD动力学模拟发现化合物可以稳定结合在现有的LDHAL6B和LDHA，align后的LDHA现有抑制剂的同一个口袋，按照理论来说是可以和丙酮酸竞争的，但是我没有做过和LDHA的结合能力实验，我仅仅是发现他们结构相似并且有较多的同源保守序列，所以我才猜测我的化合物是LDHA的抑制剂，所以我才想测体外酶活，你能否详细分析一下我实验的成功率有多少？以及我的这个推论是否合理有没有什么可以进一步验证的？

非常好的问题！这是一个典型的从初步发现（hit finding）到靶点验证（target validation）和先导化合物优化（lead optimization）过程中会遇到的情况。您的推论过程结合了计算模拟和结构同源性分析，这是现代药物发现中非常标准且有效的方法。

让我们来详细分步解析您的问题，评估成功率，并探讨下一步的验证策略。

第一部分：核心问题解析 - LDHAL6B是什么？

在分析您的推论之前，我们必须先澄清一个关键点：LDHAL6B。

在标准的人类基因组命名法中，LDHAL6B（Lactate Dehydrogenase A-Like 6B）是一个已知的假基因 (Pseudogene)。

什么是假基因？ 假基因是基因组中与正常功能基因（如 LDHA）序列非常相似的 DNA 片段，但由于其自身序列中存在缺陷（如提前的终止密码子、移码突变等），它通常不能被翻译成完整、有功能的蛋白质。它们就像是进化过程中留下的“基因化石”。
这对您的实验意味着什么？ 您提到“化合物可以结合LDHAL6B这个蛋白”。这里存在一个关键的疑问：您是在什么实验体系中观察到这个结合的？
- 可能性 A： 您使用的可能是包含大量重组蛋白的蛋白芯片或类似的筛选技术，而这个库中包含了由 LDHAL6B 基因序列人为表达出的蛋白。在这种情况下，您发现了一个可以结合这个“人造蛋白”的化合物。
- 可能性 B： 实验中可能存在蛋白质鉴定错误，您观察到结合的靶点实际上是 LDHA，但被错误地注释或识别为 LDHAL6B。

结论： 您的出发点——与 LDHAL6B 蛋白结合——本身就需要审慎评估。然而，这并不意味着您的整个推论是错误的。恰恰相反，由于 LDHAL6B 是 LDHA 的高度同源假基因，一个能与它（的理论蛋白产物）结合的分子，确实极有可能也能与真正的功能蛋白 LDHA 结合。您后续的分析思路完全正确。

第二部分：推论合理性及体外酶活实验成功率分析

您的推论逻辑链是：
观察 (A): 化合物结合 LDHAL6B (或其理论蛋白)。
观察 (B): LDHAL6B 和 LDHA 结构/序列高度同源。
计算证据 (C): MD 模拟显示化合物能稳定结合 LDHA 的活性口袋（丙酮酸位点）。
假说 (D): 因此，该化合物是 LDHA 的竞争性抑制剂。

这个推论非常合理，是药物发现中一个强有力的假设。现在我们来评估基于此推论进行体外酶活实验的“成功率”。我们不给一个具体的百分比，而是从“乐观因素”和“风险因素”来分析。

乐观因素 (为什么成功率较高):

高度的结构和序列保守性: 这是最有力的证据。如果两个蛋白的结合口袋在氨基酸组成、空间构象和静电势分布上都高度相似，那么它们很可能结合相似的配体。您已经确认了这一点。
MD 动力学模拟的支持: 这是一个关键的计算验证步骤。MD 模拟不仅显示化合物能“放进去”，更重要的是它显示了**“稳定的结合模式”**。这表明形成的复合物在动态环境中是持久的，各种关键的相互作用（如氢键、疏水作用）得以维持。这远比简单的分子对接（docking）更有说服力。
明确的结合位点假设: 您发现结合位置与天然底物（丙酮酸）的口袋重叠，这为您的抑制机制（竞争性抑制）提供了清晰的、可被验证的假说。这使得后续的实验设计目的性非常强。

风险因素 (可能导致实验失败或结果不佳的原因):

计算模拟的局限性:
- 力场不准确: MD 模拟依赖于“力场”来描述原子间的相互作用，虽然现代力场很强大，但并非完美。
- 构象采样不足: 蛋白质是动态的，可能存在多种构象。您的模拟可能探索了一个能结合的构象，但在真实溶液环境中，该构象可能不是优势构象，导致结合亲和力实际上很低。
- 溶剂化效应: 水分子的作用非常复杂，模拟很难完美重现。
蛋白动态性的细微差异: 即使两个蛋白的静态晶体结构几乎一模一样，它们在溶液中的动态“呼吸”行为也可能有细微差别。这种动态差异可能会影响化合物进入或稳定停留在结合口袋的能力。
化合物自身的性质问题 (Assay Artifacts):
- 荧光干扰: 您的化合物本身可能有荧光，或者可以淬灭产物（resorufin）的荧光，从而干扰读数。
- 对偶联酶的抑制: 在您计划的实验中，化合物可能不抑制 LDHA，而是抑制了检测系统中的 Diaphorase 酶，这会产生假阳性结果（表现为NADH未被消耗，荧光增强）。
- 溶解度问题: 化合物在水性缓冲液中溶解度不佳，析出沉淀，导致结果不稳定。

成功率评估小结:

综合来看，您的推论基础非常扎实。您已经做了超越简单猜测的关键性验证工作（MD模拟）。因此，您的体外酶活实验获得阳性结果（即观察到抑制活性）的概率是相当高的。可以说，这是一个非常值得推进的实验。

但是，“成功”不仅仅是看到抑制，还包括获得清晰、可重复、有意义的数据。 您需要警惕上述风险因素，并通过严谨的实验设计来排除它们。

第三部分：进一步的验证策略 (除了基础酶活实验)

假设您的初步酶活实验成功了，观察到了抑制效果。为了让您的结论更加坚不可摧，可以按以下步骤深入验证：

排除实验假象 (排除风险因素 #3):
- 检测化合物自身荧光: 在不加任何酶和底物的情况下，只将化合物加入缓冲液，在 Ex/Em = 540/590 nm 下检测读数，确保其背景荧光可忽略不计。
- 检测对报告系统的干扰: 建立一个“无LDHA”的对照反应。即混合缓冲液、NADH、Diaphorase、Resazurin 和您的化合物（不加LDHA）。观察荧光信号是否与不加化合物时有差异。如果无差异，则说明您的化合物不干扰检测系统。
确认结合亲和力 (Binding Affinity):
- 酶活实验得到的是 IC₅₀ (半数抑制浓度)，它反映的是功能抑制的强度。为了确认物理结合的强度，您需要测量 K_d (解离常数)。这是更直接的结合证据。
- 推荐技术:
  - 表面等离子共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR): 将 LDHA 蛋白偶联在芯片上，将化合物溶液流过，实时检测结合与解离，可精确计算 K_d。这是金标准之一。
  - 等温滴定量热法 (Isothermal Titration Calorimetry, ITC): 在溶液中直接将化合物滴定到 LDHA 蛋白中，通过测量反应热来确定结合亲和力、化学计量比和热力学参数。
  - 微量热泳动 (Microscale Thermophoresis, MST): 一种在溶液中快速测量结合亲和力的技术，所需蛋白量较少。
验证抑制模式 (Mechanism of Inhibition, MOI):
- 您的假说是与丙酮酸竞争。要验证这一点，可以设计一个酶动力学矩阵实验。
- 实验设计: 固定 NADH 的浓度（使其过量），设置多个不同的丙酮酸浓度梯度；在每个丙酮酸浓度下，又测试多个不同浓度的抑制剂。
- 数据分析: 绘制林-贝（Lineweaver-Burk）双倒数图。
  - 如果所有直线相交于 Y 轴，说明是竞争性抑制（与您的假说一致）。
  - 如果相交于 X 轴，则是非竞争性抑制。
  - 如果是一组平行线，则是反竞争性抑制。
细胞水平验证 (关键步骤):
- 靶点占有 (Target Engagement): 您的化合物在细胞内是否真的结合了 LDHA？
  - 细胞热迁移实验 (Cellular Thermal Shift Assay, CETSA): 化合物与蛋白结合后会使其热稳定性增加。通过加热处理细胞裂解液，然后用 Western Blot 检测不同温度下可溶性 LDHA 的量，可以证明药物在细胞内与靶蛋白的结合。
- 功能性分析: 抑制 LDHA 后，细胞的表型是否发生预期变化？
  - 乳酸生成检测: 用试剂盒检测经化合物处理的细胞培养基中乳酸的含量，看是否显著下降。
  - 能量代谢分析: 使用 Seahorse 等仪器分析细胞的糖酵解速率（ECAR），看是否受到抑制。

总结： 您的研究思路清晰且逻辑严谨。从计算模拟到同源性分析，都强烈支持您的化合物是一个潜在的 LDHA 抑制剂。现在，进行体外酶活实验是验证这一假说的最直接、最必要的下一步。请务必在实验中设置好上述提到的对照，以确保结果的可靠性。祝您实验顺利成功！

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RNA CRISPR miRNA Drugs Animal Models Cell Lines Clones Primers ProteinsPrimary AntibodiesELISAsAntibody ArraysActivity Assays ProteinsAntibodiesAssaysGenesshRNAPrimersCRISPRLentiviral Particles ProteinsAntibodiesClones CRISPR ClonesCell LinesClones Aliases for LDHAL6B Gene Aliases for LDHAL6B Gene GeneCards Symbol: LDHAL6B 2 Lactate Dehydrogenase A Like 6B 2 3 5 LDHL 2 3 4 5 LDHAL6 3 4 5 LDH6B 2 3 5 L-Lactate Dehydrogenase A-Like 6B 3 4 Lactate Dehydrogenase A-Like 6 2 3 EC 1.1.1.27 4 47 Testicular Tissue Protein Li 105 3 EC 1.1.1 47 External Ids for LDHAL6B Gene HGNC: 21481 NCBI Gene: 92483 Ensembl: ENSG00000171989 UniProtKB/Swiss-Prot: Q9BYZ2 Previous HGNC Symbols for LDHAL6B Gene LDHAL6 Previous GeneCards Identifiers for LDHAL6B Gene GC15P057286 GC15P059499 GC15P036322 Summaries for LDHAL6B Gene NCBI Gene Summary for LDHAL6B Gene Predicted to enable L-lactate dehydrogenase activity. Involved in lactate metabolic process and pyruvate metabolic process. Located in nucleus. Part of cytoplasm. [provided by Alliance of Genome Resources, Feb 2025] GeneCards Summary for LDHAL6B Gene LDHAL6B (Lactate Dehydrogenase A Like 6B) is a Protein Coding gene. Diseases associated with LDHAL6B include Dressler's Syndrome. Among its related pathways are glycolysis (BioCyc) and Regulation of pyruvate metabolism. Gene Ontology (GO) annotations related to this gene include oxidoreductase activity and L-lactate dehydrogenase activity. An important paralog of this gene is LDHAL6A. Additional gene information for LDHAL6B Gene HGNC (21481) NCBI Gene (92483) Ensembl (ENSG00000171989) UniProtKB/Swiss-Prot (Q9BYZ2) Open Targets Platform(ENSG00000171989) Alliance of Genome Resources Search for LDHAL6B at DataMed Search for LDHAL6B at HumanCyc No data available for CIViC Summary , UniProtKB/Swiss-Prot Summary , Tocris Summary , Gene Wiki entry , PharmGKB Summary , Rfam classification and piRNA Summary for LDHAL6B Gene Genomics for LDHAL6B Gene Subsections: Promoters/Enhancers Location GeneHancer (GH) Regulatory Elements (see citations) Download GeneHancer 2017 data Request up-to-date GeneHancer data Download GeneHancer data sheet Promoters and enhancers for LDHAL6B Gene See all 54 » Filter: (54 results) GeneHancer (GH) Identifier GH Type GH Score GH Sources Gene Association Score Total Score TSS distance (kb) Number of Genes Away Size (kb) Transcription Factor Binding Sites Gene Targets GH15J059199 Enhancer 1.2 FANTOM5,Ensembl,ENCODE,dbSUPER 32.10 38.7 -6.6 0 2.2 31 TFs PRDM1KLF17 ... 7 genes LDHAL6B ... GH15J059173 Enhancer 1.2 FANTOM5,Ensembl,ENCODE,dbSUPER 32.50 38.43 -30.8 1 4.6 24 TFs POLR2ACTCF ... 8 genes LDHAL6B ... GH15J059180 Enhancer 0.7 Ensembl,ENCODE,dbSUPER 30.30 19.79 -25.9 1 0.7 3 TFs POLR2AMAFK ... 6 genes LDHAL6B ... GH15J059164 Enhancer 1.2 RefSeq,Ensembl,ENCODE,dbSUPER 15.20 18.12 -40.7 2 2.8 18 TFs BCL11ACEBPA ... 8 genes SLTM ... GH15J059168 Enhancer 1.1 FANTOM5,Ensembl,ENCODE,dbSUPER 15.70 18.08 -36.8 2 3.8 19 TFs JUNDCEBPA ... 8 genes MIR2116 ... - Elite GeneHancer and/or Elite GeneHancer-gene associationDownload GeneHancer data from 2017 publication | Request up-to-date GeneHancer data (full dataset) Download GeneHancer data sheet GeneHancers around LDHAL6B on the GeneHancer Hub at the UCSC Golden Path Cistromic (ChIP-Seq) regulation report from The Signaling Pathways Project (SPP) (The Signaling Pathways Project) for LDHAL6B Top Transcription factor binding sites by QIAGEN in the LDHAL6B gene promoter: AhR Arnt c-Ets-1 C/EBPalpha Evi-1 FOXI1 HFH-3 STAT1 TBP TFIID Genomic Locations for LDHAL6B Gene Latest Assembly chr15:59,206,843-59,208,588 (GRCh38/hg38) Size: 1,746 bases Orientation: Plus strand Previous Assembly chr15:59,499,042-59,500,787 (GRCh37/hg19 by NCBI Gene) Size: 1,746 bases Orientation: Plus strand chr15:59,499,042-59,500,705 (GRCh37/hg19 by Ensembl) Size: 1,664 bases Orientation: Plus strand Genomic View for LDHAL6B Gene Genes around LDHAL6B on UCSC Golden Path with GeneCards custom tracks (GRCh38/hg38, GRCh37/hg19) Cytogenetic band: 15q22.2 by HGNC 15q22.2 by NCBI Gene 15q22.2 by Ensembl LDHAL6B Gene in genomic location: bands according to Ensembl, locations according to GeneLoc (and/or NCBI Gene and/or Ensembl if different) Genomic Location for LDHAL6B Gene Genomic Neighborhood • Exon Structure • Gene Densities RefSeq DNA sequence for LDHAL6B Gene NC_000015.10 NC_060939.1 Proteins for LDHAL6B Gene Subsections: 3D Structures Protein References Post-Translational Modifications Buy Research Products: Antibodies Protein products Assay products Protein details for LDHAL6B Gene (UniProtKB/Swiss-Prot) Protein Symbol: Q9BYZ2-LDH6B_HUMAN Recommended name: L-lactate dehydrogenase A-like 6B Protein Accession: Q9BYZ2 Secondary Accessions: Q6DUY4 Q96LI2 Protein attributes for LDHAL6B Gene Size: 381 amino acids Molecular mass: 41943 Da Protein existence level: PE1 Quaternary structure: No Data Available Three dimensional structures from AlphaFold (predicted) for LDHAL6B Gene Click for interactive 3D structure and sequence Click for interactive 3D structure and sequence Model Confidence: Very high (pLDDT > 90) Confident (90 > pLDDT > 70) Low (70 > pLDDT > 50) Very low (pLDDT < 50) Filter: (1 result) Identifier Method Resolution PDBe RCSB-PDB OCA Proteopedia Q9BYZ2 Predicted neXtProt entry for LDHAL6B Gene Protein Expression for LDHAL6B Gene See protein expression from ProteomicsDB, MOPED, PaxDb, and MaxQB Selected DME Specific Peptides for LDHAL6B Gene Q9BYZ2: LDTARFR GEHGDSSV MDLQHGS WAIGLSV EDKLKGE SCHGWILGEHGDS NPVDILT ILGEHGDSee all 11 » Post-translational modifications for LDHAL6B Gene Modification sites at PhosphoSitePlus ( Q9BYZ2 ) Modification sites at neXtProt ( NX_Q9BYZ2 ) Glycosylation from GlyGen (Q9BYZ2) 1 site, 1 O-linked glycan (1 site) Other Protein References for LDHAL6B Gene ENSEMBL proteins: ENSP00000302393 REFSEQ proteins: NP_149972.1 Buy Antibodies for research Creative Biolabs Recombinant Mouse anti-Human LDHAL6B Monoclonal antibody (EML2056) OriGene Antibodies for LDHAL6B See all 7 » TA335425 TA362474 Custom Antibody Services Novus Biologicals Antibodies for LDHAL6B antibodies-online: Show 34 available LDHAL6B Antibodies ranked by validation data Compare Top LDHAL6B Antibodies Recommended See all 7 » anti-LDHAL6B antibody (Lactate Dehydrogenase A-Like 6B) AA 282-381 anti-LDHAL6B antibody (Lactate Dehydrogenase A-Like 6B) Middle Region Biorbyt antibodies for LDHAL6B See all 4 » orb1266126 orb582236 Boster Bio Antibodies for LDHAL6B A15994 Boster Bio Custom Antibody Services (starting from $600), Antibody Validation Service, WB Service, IHC Service, and Multiplex IHC Service Browse Santa Cruz Biotechnology (SCBT) Antibodies Buy Protein products for research OriGene Purified Proteins for LDHAL6B See all 8 » LC409673 LY409673 Search Origene for MassSpec and Protein Over-expression Lysates for LDHAL6B Origene Custom Protein Services for LDHAL6B Novus Biologicals proteins and lysates for LDHAL6B antibodies-online: Show 6 available LDHAL6B Proteins ranked by validation data Compare Top LDHAL6B Proteins Recommended See all 4 » Lactate Dehydrogenase A-Like 6B (LDHAL6B) (AA 1-381) protein (His tag) Lactate Dehydrogenase A-Like 6B (LDHAL6B) (AA 282-381) protein (GST tag) Biorbyt proteins/lysates for LDHAL6B orb1372285 Boster Bio Recombinant Proteins for LDHAL6B PROTQ9BYZ2 LS092483 Boster Bio Recombinant Protein Expression CUSABIO Recombinant Human L-lactate dehydrogenase A-like 6B(LDHAL6B) Buy Assay products for research Browse OriGene ELISA Kits Custom Assay Services antibodies-online: Search results for available LDHAL6B related products ranked by validation data Browse ELISA Kits Boster Bio ELISA Service and Multiplex Assay Services Domains & Families for LDHAL6B Gene Gene Families for LDHAL6B Gene The Human Protein Atlas (HPA): Enzymes Metabolic proteins Predicted intracellular proteins Protein Domains for LDHAL6B Gene InterPro: NAD(P)-bd_dom_sf L-lactate/malate_DH L-lactate_DH L-lactate_DH_AS Lactate/malate_DH_CSee all 7 » Blocks: UBA/THIF-type NAD/FAD binding fold L-lactate dehydrogenase L-lactate dehydrogenase Suggested Antigen Peptide Sequences for LDHAL6B Gene GenScript: Design optimal peptide antigens: L-lactate dehydrogenase A-like 6B (LDH6B_HUMAN) Graphical View of Domain Structure for InterPro Entry Q9BYZ2 UniProtKB/Swiss-Prot: LDH6B_HUMAN : Belongs to the LDH/MDH superfamily. LDH family. Family: Belongs to the LDH/MDH superfamily. LDH family. Genes that share domains with LDHAL6B: view Function for LDHAL6B Gene Subsections: GWAS Phenotypes GO Terms MGI/GenomeRNAi Phenotypes Buy Research Products: Animal Models CRISPR products miRNA products Inhibitory RNAs Clone products Cell Lines Molecular function for LDHAL6B Gene according to UniProtKB/Swiss-Prot CatalyticActivity: Reaction=(S)-lactate + NAD(+) = pyruvate + NADH + H(+); Xref=RHEA:23444, CHEBI:15361, CHEBI:15378, CHEBI:16651, CHEBI:57540, CHEBI:57945; EC=1.1.1.27. LDH6B_HUMAN,Q9BYZ2 Enzyme Numbers (IUBMB) for LDHAL6B Gene EC 1.1.1 47 EC 1.1.1.27 47 4 Phenotypes From GWAS Catalog for LDHAL6B Gene See all 7 » Filter: (7 results) Phenotype Gene Relation Best Score Mean Score # of Snps # of Studies SNP IDs serum metabolite measurement GeneHancer 12.0 11.0 1 1 rs2306791 bone density GeneHancer 12.0 12.0 1 1 rs183365743 body mass index GeneHancer 10.5 10.5 1 1 rs2899644 body height GeneExon ,GWAS 9.0 9.0 1 1 rs3809528 diffuse plaque measurement GeneHancer 8.4 7.6 3 1 rs10818647rs12594470rs6494087 Gene Ontology (GO) - Molecular Function for LDHAL6B Gene Filter: (5 results) GO ID Qualified GO term Evidence PubMed IDs GO:0003824 5 catalytic activity IEA GO:0004459 3 5 enables L-lactate dehydrogenase activity IBA, TAS GO:0005515 3 5 enables protein binding IPI 12107167 GO:0016491 5 oxidoreductase activity IEA GO:0016616 5 oxidoreductase activity, acting on the CH-OH group of donors, NAD or NADP as acceptor IEA Genes that share ontologies with LDHAL6B: view Phenotypes for LDHAL6B Gene MGI mutant phenotypes for LDHAL6B: inferred from 2 alleles cardiovascular system phenotype reproductive system phenotype hearing/vestibular/ear phenotype GenomeRNAi human phenotypes for LDHAL6B: Increased vaccinia virus (VACV) infection Decreased hepcidin::fluc mRNA expression Decreased viability no effect Decreased vaccinia virus (VACV) infection Inconclusive Decreased IL-8 secretion Increased HPV18 LCR reporter activity Increased G1 DNA content Genes that share phenotypes with LDHAL6B: view Buy Animal Models for research Cyagen: Research-Ready Knockout Catalog Models KO Mouse Strain for LDHAL6B | cKO Mouse Strain for LDHAL6B Generate a custom murine model: TurboKnockout® Humanized Mouse Services | CRISPR/Cas9-based Services | PiggyBac Transgenic Rats | Drug Evaluation Animal Models Buy CRISPR products for research Applied Biological Materials (abm): CRISPR Clones for LDHAL6B - Guaranteed KO > LDHAL6B CRISPR sgRNA+Cas9 as ready-to-use knockout vector or virus: Non-viral | Lenti- | AAV- | siRNA - Browse All Cas9 Proteins, Cas9 Nuclease Vector/Virus, Cas9-Expressing Cell Lines also available. OriGene CRISPR knockouts for LDHAL6B See all 3 » GA114218 KN405562 VectorBuilder CRISPR vectors for LDHAL6B (ie. knockout, knockin, CRISPRa, CRISPRi) VectorBuilder Virus packaging for LDHAL6B CRISPR vectors (ie. lentivirus, AAV, adenovirus) Santa Cruz Biotechnology (SCBT) CRISPR for LDHAL6B See all 3 » LDH-AL6B CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) LDH-AL6B CRISPR Activation Plasmid (h) miRNA for LDHAL6B Gene miRTarBase miRNAs that target LDHAL6B hsa-miR-302a (hsa-miR-302a) hsa-miR-302b (hsa-miR-302b) hsa-miR-302c (hsa-miR-302c) hsa-miR-302d (hsa-miR-302d) hsa-miR-302e (hsa-miR-302e)See all 20 » Buy miRNA products for research Browse OriGene miRNA Products For LDHAL6B Buy Inhibitory RNAs for research Origene sirna-oligo-duplexes, shrna-plasmids, and shrna-lentiviral-particles products in human, mouse, rat for LDHAL6B Browse OriGene Inhibitory RNA Products For LDHAL6B VectorBuilder shRNA knockdown vectors for LDHAL6B (ie. viral and non-viral vectors) VectorBuilder Virus packaging for LDHAL6B shRNA knockdown vectors (ie. lentivirus, AAV, adenovirus) Santa Cruz Biotechnology (SCBT) siRNA for LDHAL6B LDH-AL6B siRNA (h) Validated shRNA from LipExoGen - Guaranteed knockdown for any gene - 10 days or less Buy Clone products for research Applied Biological Materials (abm): Clones for LDHAL6B - As low as $99 > LDHAL6B as ready-to-use vector or virus: ORF | Lenti- | Adeno- | AAV- | Protein Vector - Browse All Control Lentivectors and Lentiviruses with GFP, RFP, and Luciferase also available. OriGene clones in human,mouse,rat for LDHAL6B See all 6 » MC212126 MR205974A1V OriGene ORF clones in human,mouse,rat for LDHAL6B See all 17 » MG205974 MR205974 Custom cloning services - gene synthesis, subcloning, mutagenesis, variant library, vector shuttling Sino Biological Clones for LDHAL6B human-ldhal6b-hg25201 VectorBuilder Custom and pre-made DNA vectors for LDHAL6B (ie. gene expression, shRNA knockdown, CRISPR) VectorBuilder Viral vectors for LDHAL6B (ie. lentivirus, AAV, adenovirus) VectorBuilder Virus packaging for LDHAL6B (ie. lentivirus, AAV, adenovirus, MMLV, MSCV, baculovirus) See all 2 » Boster Bio AAV Packaging Services and Gene Synthesis LipExoGen Custom Lentivirus Services - Fast Turnaround - shRNA, sgRNA, miRNA, cDNA, and reporters (TFs, signal pathway, gene promoter) Buy Cell Lines for research VectorBuilder Stable cell line generation for LDHAL6B Browse Boster Bio Reporter Cell Lines Applied Biological Materials (abm): CRISPR LDHAL6B KO, and LDHAL6B Over-Expression Stable Cell Line - Browse All Custom Stable Cell Line Generation - Any Gene, Any Cell Line > Get Quote No data available for Human Phenotype Ontology , Animal Models , NCBI Functional elements , Transcription Factor Targeted Genes and HOMER Transcription for LDHAL6B Gene Localization for LDHAL6B Gene Subsections: Cellular Components Subcellular locations from COMPARTMENTS 0 1 2 3 4 5 Confidence COMPARTMENTS Subcellular localization image for LDHAL6B gene Compartment Confidence cytosol 4 nucleus 4 mitochondrion 4 extracellular 3 lysosome 2 endoplasmic reticulum 2 peroxisome 2 cytoskeleton 2 plasma membrane 2 golgi apparatus 1 endosome 1 Subcellular locations from the Human Protein Atlas (HPA) Cytosol (2) See all subcellular structures Gene Ontology (GO) - Cellular Components for LDHAL6B Gene Filter: (5 results) GO ID Qualified GO term Evidence PubMed IDs GO:0005634 3 5 located_in nucleus HDA 21630459 GO:0005737 3 5 located_in cytoplasm IDA 18351441 GO:0005739 3 5 is_active_in mitochondrion IBA GO:0005759 3 5 located_in mitochondrial matrix TAS GO:1990204 3 5 part_of oxidoreductase complex NAS 18351441 Genes that share ontologies with LDHAL6B: view No data available for Subcellular locations from UniProtKB/Swiss-Prot for LDHAL6B Gene Pathways & Interactions for LDHAL6B Gene Subsections: SuperPathways String Interactions Interacting Proteins GO Terms GeneAnalytics - gene set analysis. Cells, Diseases, Pathways, Function and Compounds, relevant to your gene set. Powered by GeneCards Pathways by source for LDHAL6B Gene 2 WikiPathways pathways for LDHAL6B Gene Glycolysis and gluconeogenesis Metabolic Epileptic Disorders 3 Reactome pathways for LDHAL6B Gene Aerobic respiration and respiratory electron transport Metabolism Pyruvate metabolism SuperPathways for LDHAL6B Gene Filter: (4 results) SuperPathway Contained pathways 1 glycolysis (BioCyc) Glycolysis and gluconeogenesis0.60 Metabolic Epileptic Disorders0.58 2 Regulation of pyruvate metabolism Pyruvate metabolism0.67 3 Respiratory electron transport Aerobic respiration and respiratory electron transport0.61 4 Metabolism Metabolism0.35 Genes that share pathways with LDHAL6B: view UniProtKB/Swiss-Prot LDH6B_HUMAN Pathway: Fermentation; pyruvate fermentation to lactate; (S)-lactate from pyruvate: step 1/1. Additional Pathway Information for LDHAL6B Gene Pathway Commons: Q9BYZ2 Interacting Proteins for LDHAL6B Gene STRING Interaction Network Preview (showing top 5 STRING interactants (based on experimental score) - click image to see top 25) STRING Interaction Network for LDHAL6B Selected Interacting proteins: LDH6B_HUMAN ENSP00000302393 for LDHAL6B Gene via UniProtKB MIN STRING IID See all 1,027 » Filter: (1027 results) Symbol External ID(s) Details HNRNPD Q14103 4 116 ENSP00000313199 19 EBI-1108377, EBI-299674STRING: ENSP00000313199IID: # exp=1 SOD1 P00441 4 116 ENSP00000270142 19 EBI-1108377, EBI-990792STRING: ENSP00000270142IID: # exp=1 ABAT ENSP00000379845 19 P80404 116 STRING: ENSP00000379845IID: # exp=1 ABCB8 ENSP00000297504 19 Q9NUT2 116 STRING: ENSP00000297504IID: # exp=1 AGXT2 ENSP00000231420 19 Q9BYV1 116 STRING: ENSP00000231420IID: # pred=1 Gene Ontology (GO) - Biological Process for LDHAL6B Gene 上边这是LDHAL6B蛋白的介绍，我的结合实验是CETSA做出来的，我的化合物能够让他热稳定性变差，我怀疑是竞争了其原本底物如NAD和丙酮酸导致其热稳定性变差

好的，感谢您提供如此关键的补充信息！您的实验又取得了非常重要且有趣的进展。CETSA 实验的结果，尤其是这个热稳定性变差的现象，让我们需要对之前的推论进行更深入和细致的分析。

我们结合您提供的 GeneCards 页面信息和新的实验数据，来重新梳理一下整个逻辑链。

第一部分：对 LDHAL6B 的再认识 (结合 GeneCards 信息)

您提供的 GeneCards 页面信息非常关键，我们来提炼一下核心要点：

基因名称与蛋白: LDHAL6B (Lactate Dehydrogenase A Like 6B)。UniProtKB/Swiss-Prot ID 为 Q9BYZ2。
蛋白存在水平 (Protein Existence Level, PE): 页面信息显示为 PE1。这是一个极其重要的信息点！PE1 意味着在蛋白质水平上有明确的实验证据 (Evidence at protein level)。这推翻了它仅仅是一个假基因的简单论断。虽然它可能起源于基因复制事件，但证据表明它在人体内确实可以被翻译成蛋白质。
功能注释 (Function):
- 催化活性 (Catalytic Activity): UniProt (Q9BYZ2) 明确注释了其催化反应：(S)-lactate + NAD(+) = pyruvate + NADH + H(+)。EC 号为 1.1.1.27。这说明它被认为是一个有功能的 L-乳酸脱氢酶。
- GO 注释: enables L-lactate dehydrogenase activity (具有L-乳酸脱氢酶活性)，enables protein binding (具有蛋白质结合能力)。
- 通路 (Pathways): 参与 Glycolysis (糖酵解), Pyruvate metabolism (丙酮酸代谢) 等。
亚细胞定位: 主要位于细胞质 (Cytosol) 和细胞核 (Nucleus)。
重要旁系同源物 (Paralog): LDHAL6A。并且它属于 LDH/MDH 超家族。

结论更新：
根据权威数据库 GeneCards 和 UniProt 的信息，LDHAL6B 不仅仅是一个假基因，它是一个已被证实在蛋白质水平存在、且被注释具有乳酸脱氢酶活性的功能蛋白。这使得您的初始发现——化合物能结合 LDHAL6B——的意义变得更加重大。您可能发现了一个针对一种特殊 LDH 同工酶的调节剂。

第二部分：核心问题分析 - CETSA 实验结果的解读

您的 CETSA 实验结果是：“我的化合物能够让它（LDHAL6B）热稳定性变差”。这是一个非常有价值但又非典型的结果。

通常的 CETSA 模型：
在经典的药物-靶点互作中，小分子配体（抑制剂或激活剂）的结合会像“胶水”或“支架”一样，使得蛋白质的三维结构更加规整和稳定，从而提高其对热变性的抵抗力。因此，我们通常期望看到的是“热稳定性增加”。

您观察到的现象：热稳定性降低 (Thermal Destabilization)

这是一个非经典但有明确生物学意义的现象。您提出的假说——“我怀疑是竞争了其原本底物如NAD+和丙酮酸导致其热稳定性变差”——是完全合理且非常有可能的。

为什么竞争性抑制剂可能导致热稳定性下降？

一个蛋白质的稳定性并不仅仅是它自身的折叠状态，还取决于它与环境中各种配体（底物、辅酶、变构调节剂等）的相互作用。

底物/辅酶的稳定作用: 对于许多酶来说，其天然底物或辅酶的结合本身就会诱导酶进入一个更稳定、更有序的构象。例如，NAD+ 的结合可能会锁定 LDHAL6B 的某个结构域，使其整体热稳定性增加。
竞争性置换: 您的化合物结合到了活性位点，它通过竞争排挤掉了原本可以结合的、能起稳定作用的内源性配体（如细胞内存在的 NAD+ 或丙酮酸）。
诱导了不稳定的构象: 如果您的化合物虽然能结合，但它诱导或“锁定”的蛋白质构象，本身就是一个能量更高、更不稳定或更“松散”的状态，那么当加热时，这个本就不太稳定的“药物-蛋白”复合物会比单独的“辅酶-蛋白”复合物更容易解离和变性。

可以把这个过程想象成一个锁和两把钥匙：

蛋白质: 一把锁。
天然辅酶 (NAD+): 原配钥匙A，插入后锁的内部结构非常稳固。
您的化合物: 一把新配的钥匙B，它能插进去（结合），但由于形状不完美，导致锁的内部弹簧和销子处于一个不稳定的受力状态。这把“不舒服”的钥匙在里面，反而让这把锁更容易被外力（加热）破坏。

结论： CETSA 显示热稳定性下降，强烈暗示您的化合物可能是一种竞争性抑制剂，它通过置换掉能稳定蛋白的内源性配体，或者诱导了一个不稳定的酶构象，从而发挥作用。这为您的体外酶活实验提供了更强的理论支持和更清晰的验证方向。

第三部分：实验成功率再评估与后续验证策略

结合所有信息，您进行体外酶活实验并观察到抑制现象的成功率现在非常高。您已经拥有了：

物理结合的直接证据 (CETSA): 证明化合物在细胞内确实与 LDHAL6B 蛋白发生了物理相互作用。
作用模式的有力线索: 热稳定性下降的现象，强烈指向了竞争性抑制的可能性。
一个功能明确的靶点: LDHAL6B 是一个具有乳酸脱氢酶活性的蛋白。

后续详细验证步骤 (优先级排序):

阶段一：确认体外酶学活性与抑制

购买活性蛋白: 您的首要任务是购买或表达纯化的、有活性的重组人 LDHAL6B 蛋白 (Q9BYZ2)。由于它不是最常见的 LDH 亚型，您可能需要向 CUSABIO（GeneCards页面有列出）、OriGene 或其他定制蛋白服务公司寻找。同时，购买活性 LDHA 蛋白作为平行对照，因为它们高度同源，您的化合物很可能对两者都有活性。
建立基础酶活检测: 严格按照我们上次讨论的方案，使用丙酮酸和 NADH 作为底物，检测 LDHAL6B 的酶活性。
IC₅₀ 测定: 在体外酶活体系中，加入梯度浓度的化合物，测定其对 LDHAL6B 和 LDHA 的 IC₅₀ 值。这是验证您假说的关键一步。

阶段二：验证竞争性抑制机制

进行酶动力学分析 (MOI 研究):
- 固定 NADH 浓度，改变丙酮酸浓度: 在多个固定的抑制剂浓度下，测量一系列不同丙酮酸浓度对应的反应速率。绘制 Lineweaver-Burk 双倒数图。如果表现为竞争性抑制，所有直线将相交于 Y 轴。
- 固定丙酮酸浓度，改变 NADH 浓度: 同理，检测化合物是否与 NADH 竞争。
- 通过这个实验，您可以明确您的化合物是与丙酮酸竞争，还是与辅酶 NADH 竞争，或是两者都竞争。这与您在 MD 模拟中观察到的结合位点是绝佳的相互印证。

阶段三：确认结合亲和力与热力学

进行生物物理结合实验:
- 等温滴定量热法 (ITC): 这是验证您 CETSA 结果的绝佳方法。ITC 可以直接测量结合热（放热或吸热），并精确计算结合常数 (K_d) 和化学计量比 (n)。如果化合物结合确实导致了构象改变，ITC 曲线上可能会有复杂的表现。
- 表面等离子共振 (SPR): 用于精确测量结合和解离的速率常数 (k_on, k_off)，从而得到 K_d。

阶段四：细胞水平功能验证

测量细胞内乳酸水平: 使用特异性敲低 (siRNA) LDHAL6B 的细胞系（如果可以构建的话），或者在已知高表达 LDHAL6B 的细胞系中，用您的化合物处理细胞，然后检测细胞培养基中乳酸的生成量是否下降。
能量代谢分析 (Seahorse): 检测化合物处理后，细胞的糖酵解速率 (ECAR) 是否如预期那样被抑制。

总结：

您的处境非常有利。CETSA 的结果不仅不是坏消息，反而是一个指向明确作用机制的强信号。您现在应该充满信心地推进您的研究。请将重点放在获取高质量的重组 LDHAL6B 和 LDHA 蛋白上，然后通过严谨的体外酶活实验来最终证实您的假说。祝您在接下来的关键实验中取得成功！

历史聊天记录

您说：

ChatGPT 说：

核心问题一：LDH5和LDHA是同一个蛋白吗？

核心问题二：关于您查到的LDHA蛋白的适用性分析

核心问题三：如何设计实验及购买试剂？

实验原理

所需试剂清单 (Reagent List)

实验步骤 (建议方案，以100 µL总反应体积为例)

您说：

ChatGPT 说：

第一部分：核心问题解析 - LDHAL6B是什么？

第二部分：推论合理性及体外酶活实验成功率分析

乐观因素 (为什么成功率较高):

风险因素 (可能导致实验失败或结果不佳的原因):

成功率评估小结:

第三部分：进一步的验证策略 (除了基础酶活实验)

您说：

ChatGPT 说：

第一部分：对 LDHAL6B 的再认识 (结合 GeneCards 信息)

第二部分：核心问题分析 - CETSA 实验结果的解读

第三部分：实验成功率再评估与后续验证策略

后续详细验证步骤 (优先级排序):